Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

サマリー

誤って折りたたまれたタンパク質の凝集を定量化する手法について述べる.レンチ ウイルスのプロトコルの詳細は、安定的な細胞ラインの生成、自動の共焦点レーザー顕微鏡、タンパク質凝集体の画像解析に誘導されます。説明アプリケーションとして SOD1 集計時間と用量依存的に促進する上で小さな分子の影響を検討しました。

要約

筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は、遺伝子符号化銅亜鉛スーパーオキシドのディスムターゼ 1 (SOD1) で受継がれた突然変異によって引き起こされることができます致命的な神経変性疾患です。SOD1 構造の不安定性および家族性 ALS 患者に SOD1 正介在物の検出は、ALS の病理変性および/または集計 SOD1 の潜在的な因果的役割をサポートしています。本研究では細胞内 SOD1 集合のダイナミクスを定量化する高いコンテンツのスクリーニングのアプローチによって設計された細胞ベースのアッセイの開発について述べる.レンチ ウイルスのベクトルを使用して、我々 は野生型と変異型の A4V SOD1 黄色い蛍光蛋白質を付けられ、両方のタンパク質が細胞質凝集の兆候なしで表現された発見を表現する安定したセルラインを生成されます。興味深いことに、SOD1 A4V だけは安定、HEK 293 で表現がない U2OS または SH SY5Y 細胞におけるプロテアソーム阻害剤投与時に集計を形成します。各種のプロテアソーム阻害剤の用量反応解析に基づく集計を定量化するタイムラプス顕微鏡による集合体形成過程を追跡することが可能であるを示す.我々 のアプローチは、SOD1 A4V 塊り形成を防止する小分子のスクリーニングし同様、形成 SOD1 の役割に ALS 変異の影響の定量化の可能性を紹介します。

概要

蛋白質の集合であり、生物学的プロセス ミスフォールド蛋白質グループを (アミロイドーシス) の神経変性疾患の原因となるエージェントとして機能するかもしれない。蛋白質の集合を特徴づける細胞機能障害の病態の発症に影響する新しい要因の発見を促進するように同様の骨材の役割を理解することに不可欠です。細胞内のタンパク質の蛍光タグの可視化は、スクリーニング (HCS)^1,2,3,4高の内容に適用される試金の開発に役立つ可能性があります強力な手法です。

筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は集計および家族性 ALS (fALS) および散発的 ALS (Sal)^{5,6 の運動ニューロンに蓄積する傾向の誤って折りたたまれたタンパク質の存在によって引き起こされる proteopathic 疾患とみなされる}.FALS の場合の 20% のサブセットが関連付けられているゾル性細胞質の抗酸化酵素遺伝子に支配的な遺伝子変異を有する銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1)^7,8」と入力します。この遺伝的派生機能不全のいくつかの潜在的な原因が提案されている, 構造と機能の異常な安定性、展開数の増加、および集計^{9、性向などの SOD1 バリエーションの変更など 10}。特に、両方の ALS リンク SOD1 の変形によって共有プロパティのみが検証し、潜在的に有害と野生型 (WT) SOD1 は仕切られたタンパク質凝集体やタンパク質の介在物^{11,12 を形成する増加傾向}.誤って折りたたまれた突然変異体 SOD1、永続的 polyubiquitinated、ユビキチン-プロテアソーム系により劣化します。その結果、プロテアソーム活性の阻害の低レベルが突然変異体 SOD1 集計^13,14, 可溶性変異 SOD1 と交換することができます水溶性の成分から成る非晶質構造を形成するの蓄積につながる細胞質¹⁵。特に、SOD1 突然変異体 A4V (アラニン コドン 4 におけるバリンに変更) は、最も一般的な ALS の原因となる突然変異と病気発症¹⁶後 2 年未満の平均生存時間と急速な神経変性に 。生化学、SOD1 A4V が monomerize、集計、およびアミロイドの毛穴を形成する傾向が増すその孔のような集計他病気にリンクされた突然変異体の形態の α-シヌクレインと β-アミロイド蛋白質¹⁷などアミロイド毛穴に似ています。SOD1 集計蓄積のダイナミクスを研究するには、水溶性と不溶性 SOD1 集計フォームを監視する方法は開発されるままです。

我々 は以前に、住セルイメージ投射を使用して、HEK 293 細胞一過性発現蛍光タンパク質タグ SOD1、ALS 関連変異体が SOD1 の活性化と集計¹¹を損ないます。一過性発現システムは、短期的な遺伝子発現の生物学的結果について有用な情報を提供できますが、目的の遺伝子の強固な統合を提供するメソッドがアッセイ開発に適して可能性があります。そのため、レンチウイルスベクターは哺乳類セル¹⁸長期的かつ調整された遺伝子の発現を付与する能力を提供しています。本研究では WT を軸受組換えレンチ ウイルスで導入した安定したセルラインの生成に着目した、変異 SOD1 が付いた黄色い蛍光蛋白質 (YFP)。生細胞イメージング顕微鏡と SOD1 集計の自動定量評価を使用して、我々 はトリガーされ、プロテアソームの阻害に SOD1 集約イベントを定量化します。

プロトコル

1 レンチ ウイルス生産

注: 生産およびレンチウイルスベクターの操作は含む組換え研究の国立衛生研究所 (NIH) のガイドラインに従って実施された。DNA。キム ら 説明野生型および A4V 変異 SOD1 が付いた (SOD1WT YFP と SOD1A4V YFP) 強化された YFP プラスミド エンコードします。 ¹¹ 両方遺伝子融合製品 PCR プライマー 5 を使用して増幅された ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ 5、′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC 3 ′ pTRIP デルタ U3 CMV 挿入プラスミド ¹⁹ XhoI と BsrGI 制限のサイトを使用しています。事前の実験で HEK 293 t 細胞は、2 日ごと 1:4 1:6 の比率で分割されました。20 以上の通路と少ない 60% の合流により良いトランスフェクションの効率を確保するために細胞の維持の回避します

。

1. 日 1 に、ウイルスの生産のための細胞培養液 (10 %fbs と 4 mM L グルタミンの高グルコース DMEM) 10 mL に 10 cm 径組織培養プレート (3 x 10 の ⁶ セル/ディッシュ タイプ) 30-40% 合流 HEK 293 t 細胞を分割します
。
2. 直径 10 cm の組織培養プレート (37 ° C、5% CO ₂) CO ₂ インキュベーターで一晩保持します
。
3. 日 2 の準備レンチウイルスベクターの 10 μ g を含む DNA トランスフェクション ソリューション (pTRIP デルタ U3 の CMV - SOD1WT YFP または - SOD1A4V-YFP)、レンチ ウイルスとプラスミド (pVSVg の 5 μ g; pCMV dR8.71 の 10 μ g) (包装 図 2 a) ²⁰. 1 M CaCl ₂ 125 μ L を追加し、蒸留水を使用して 500 μ L にボリュームを調整します。ゆっくり混合物に 0.05 M HEPES の 500 μ L を追加し、室温で 10 分間インキュベートします
。
4. 置換 HEK 293 t 細胞の抗生物質フリー 10 mL に予め温めておいた新鮮な培養液 1 mL DNA トランスフェクション溶液と混合媒体と 37 ° C、5% CO ₂ で一晩インキュベートします
。
5. 3 日目、新鮮な培養液上清中のセルを置換します
。
6. 日 4 では 15 mL チューブで死んだ細胞および残骸を取除く 500 x g で 5 分間遠心上清を収穫します。さらに 60 mL の大型シリンジを使用して 0.45 μ m のフィルターを通過して上清を浄化します。すぐに使い捨ての因数 (300 μ L) に分配し、-80 ° C で保存最大製品活動を維持するために凍結融解サイクルを回避します
。

2。レンチ ウイルス伝達

1. 分割 60% 合流で感染する細胞株 (HEK 293 細胞と SH SY5Y; ウェルあたり 5 x 10 の ⁵ セルと U2OS; ウェルあたり 1 x 10 の ⁵ セル) DMEM 培地 2 mL に 6 も組織培養プレートに10 %fbs
。
2. 37 ° C の定温器で 5% CO ₂ に一晩 6 ウェル培養プレートを保持します
。
3. -80 ° C のフリーザーから冷凍のレンチ ウイルスを削除、各使用前に氷の因数を解凍; 再冷凍しないでください
。
4. ウイルスを解凍すると中は、暖かい関心の細胞ラインと互換性の血清を含む培養液です。ウイルスは完全に解凍、希釈の範囲を準備 (1:3、1:10、1:30 と 1: 100) 1.5 mL の新鮮なおよび microfuge の管に DMEM で
。
5. 低下した血清中のメディアと 1 mL にチューブ内のボリュームをもたらすします
。
6. ウイルス/メディアの ml (4 μ g/μ L の在庫) で Polybrene の追加 2 μ L。ピペッティングでよく混ぜるし、セルに混合物の 1 つの mL を追加します。24 時間のウイルスと細胞をインキュベート
7. ウイルスのメディアを削除し、通常 DMEM 培地 10% に置き換える FBS。37 ° c、5% CO ₂ 細胞を維持します
。
8. は、細胞の成長を監視し、文化メディア 2 日ごとに変更します。Confluence (コンフルエンス) で直径 10 cm の組織培養プレートに 6 よく皿を展開します
。
9. セルが十分に展開されている一度、DMEM 384-well アッセイ プレート、YFP の表現レベルをチェックするメディアの 50 μ L の井戸あたり種子 1.5 × 10 ⁴ 細胞顕微鏡による蛋白質のタグ。タグ付きの YFP 発現細胞信号対雑音比が表示されます ≥ 3、セルの対応する線の細胞の在庫を準備します
。

3。時間依存蛋白質凝集に及ぼすプロテアソーム阻害剤

注: 自動顕微鏡による画像の取得を実行 (マテリアル を参照してください).

1. DMSO やプロテアソーム阻害剤の 384 ウェル平底プレート (ALLN, 2 mM) 100 %dmso に溶解の 0.25 μ L を分注します
。 同じメディア
2. DMEM を 50 μ l 添加のウェルあたり手動でシード 1.5 x 10 の ⁴ の細胞アッセイ用プレート。プロテアソーム阻害剤 (ALLN) の最終濃度は 10 μ M をする必要があります
。
3. は、37 ° C、5% CO ₂ 顕微鏡システム環境制御ユニットを設定します。実験のセットアップのスクリーン ショットは、 図 3 に示す.
4. 広視野蛍光モードでは、次の設定でソフトウェアを使用しての顕微鏡の動作: 時間のキャプチャ間隔と X の目的、非共焦点モード、4 フィールド/まあ、LWD 20。それぞれの実行の最後に、撮影した画像が自動的にサーバーにアップロードします
。

4。生きている細胞で YFP 式のタイムラプス イメージングの時間し、画像解析 (シングル チャンネル)

注: (例えば コロンブス) ソフトウェア アプリケーションを次に示します

。

1. 選択適切なアルゴリズム (細胞質と集計) のプライマリ オブジェクトをセグメント化します。必要な場合は、背景のしきい値とコントラスト パラメーター ( 図 4) を調整します
。
2. 数のセルを使用して ' のセルを検索 ' YFP 輝度チャンネルの 0.1 の個々 の閾値。集計を使用してを決定する、' のスポットを見つける ' 相対 YFP スポット強度とアルゴリズム > 0.2 と分割係数 1.0
。

5。線量応答プロテアソーム阻害蛋白質の集合の細胞に及ぼす生活 (2 チャンネル) の核を染色

注: 自動顕微鏡による画像の取得を実行します。最適なカーブ フィットを確保するため期待される IC ₅₀ 値に基づいてプロテアソーム阻害剤 (ALLN、Epoxomicin、および MG132) の濃度範囲を決定する

。

1. 準備 384 ウェル ストレージ ポリプロピレン化合物のシリアル希薄標準で 1:3 希釈系列をプレートします。化合物の希釈をミックス確認も化合物濃度が正確であることを確認する
。
2. は、0.25 μ L 空フラット底黒 384-well アッセイ プレートに対するプロテアソーム阻害剤の調剤します。我々 はボリュームを転送できる 384 キャピラリー頭装備液体ハンドラーを使用します
。 アッセイ プレートに DMEM メディアの 50 の井戸あたり 10 の ⁴ セル x
3. シード 1.5 μ。孵化 24 時間の CO ₂ を 37 ° C、5% でアッセイ プレート
4. 染色液 (10 mg/mL の在庫でヘキスト 33342) (37 ° C に加温) DMEM メディアの 10 μ L を追加し 10 分間室温でインキュベート
5. マイクロを起動します。オペレーティング ソフトウェアを対処します。実験装置のスクリーン ショットを 図 6 に示します。選択、" 構成 " 目的と正しいプレート タイプ X 20 を選択します。確認 " 襟 " 異なるプレートの種類と適切なフォーカス可能にする目的で正しい値に設定されます
。
6. 選択、" 顕微鏡 " タブ定義露出 YFP として 1 (488 レーザー) とヘキストとして露出 2 (405 レーザー)。両方のエクスポー ジャーのフィルターをアクティブにし、カメラ 1 とカメラ 2 の露出 2 に露出 1 を割り当てます。露出 1 ~ 800 ms に露光時間を設定露出 2 〜 40 ミリ秒です
。
7. 選択露出 1。選択は、0 μ m にフォーカスの高さを設定 " フォーカス "。一度、フォーカス、カメラ 1 を公開します。露出面を最適化しをクリックしてフォーカスの高さを調整する " の高さにする "。露出時間を変更し、〜 3000 の最大ピクセル強度を与える力をレーザーします。露光パラメーターを保存します。露出 2 の繰り返し
。
8. 選択 " 実験の定義 " タブのレイアウトと sublayout を作成します。ドラッグ アンド ドロップ関連のレイアウト、露出、参照イメージ、skewcrop ファイル、および sublayout。実験を保存します
。
9. 選択 " 自動実験 " タブをクリックし、画像を取得します。それぞれの実行の最後に、撮影した画像が自動的にサーバーにアップロードします
。

6。2 つのチャンネルの画像の解析を画像

1. (核、細胞質、および集計) のプライマリ オブジェクトをセグメントするソフトウェア アルゴリズムを選択 ( 図 7).
2. は、正確にセグメント化されたオブジェクトの外観検査で核をセグメント化する方法を選択します。ヘキスト染色のオブジェクト チャネル 1 (Ch1) は、細胞の数を決定する使用されます。YFP 染色から突然変異体 SOD1-A4V チャネル 2 (Ch2) では、骨材の量を決定する使用されます
。
3. を使用してセルを数える、' 核を見つける ' ヘキスト染色領域としてアルゴリズム > 20 μ m ² 7.0、0.40 とコントラスト閾値の分割係数 > 0.10
。
4. データ テーブルを作成しを使用して化合物のそれぞれの EC ₅₀ を決定する、' 非線型回帰 ' グラフ作成ソフトウェアで方程式
。

結果

レンチを使用して生成する安定したセルライン:SOD1 タンパク質凝集体を監視するための全体的な戦略を図 1に示します。最初のステップで我々 は細胞 (ステップ 1) に SOD1 遺伝子の安定配信するためのレンチ ウイルス発現ベクターを生成されます。エンコード YFP タグ SOD1 WT と SOD1 A4V 2 レンチウイルスベクター (SOD1WT YFP と SOD1A4V-YFP、それぞれ) プラスミド パッキングと封筒 (図 2 a) を作製しました。レンチ ウイルス伝達 (ステップ 2) セルに線テスト (HEK 293、U2OS、および SH SY5Y) (図 2 b)、健康、示した高発現レベルと YFP 標識 SOD1 フォームに関係なく長期に残った。興味深いことに、どちらも WT も突然変異体 SOD1 の一過性発現細胞モデルと対照をなしての...

ディスカッション

安定したセルラインを生成するための 2 つの主な方法があります。最初の数週間を要するし、ゲノムの統合されたプラスミド DNA ベクターの一時的なトランスフェクションと抵抗の選択が必要です。2 番目は、限られた努力で複数の細胞株における標的タンパク質の効果的な表現に従うこのプロトコルを作る、レンチを使用して時間の問題を受け取ります。保存された伝達効率と安定した遺伝子発現の使用する持続的なベクトルに旅行 CMV ベクター¹⁹はあった。驚いたことに、生成された 3 つのセルの行を示した一過性発現に基づく実験的プロトコルとは対照的突然変異体 SOD1 の表示の集計には以前¹¹説明ないです。一過性発現が蛋白質の集合を支持するようにそれは時間の比較的短い期間でより高い蛋白質の表現を生成する可能性が高いです。一過性トランスフェクションに蛋白質の大半が低下、ユビキチン-プロテアソーム システム集計しやすい蛋白質を低下させる能力は活用飽和ポイントに達する。しかし、我々 は安定したラインが、プロテアソームによって誤って折りたたまれたタンパク質の除去に一致する比較...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ALLN (C20H37N3O4)	Millipore	208719
MG132 (C26H41N3O5)	Sigma-Aldrich	C2211
エポキソマイシン (C28H<サブ>50N<サブ>4O<サブ>7)	シグマ・アルドリッチ	E3652
ヘキスト 33342	Invitrogen	H-3570
オペラ・	パーキン・エルマー	OP-QEHS-01
オペラ・エボシェル・ソフトウェア	パーキン・エルマーVer	1.8.1
オペレッタ	・パーキン・エルマー	OPRT1288
ハーモニーイメージングソフト	パーキンエルマーVer	3.0.0
コロンバス画像解析ソフト	パーキンエル	マーVer 2.3.2
CyBi Hummingwell リキッドハンドリング	CyBio AG	OL 3387 3 0110