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方法論記事

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

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DOI:

10.3791/56486

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2018年4月26日

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical and Health Sciences Institute, University of Georgia, 2Center for Craniofacial Molecular Biology, University of Southern California, 3Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia

この記事について

サマリー

ここでマウスでジカ ウイルス小頭のモデルを確立するための手法について述べる。このプロトコルには、ジカの新生児、萌芽期、成人期の脳内接種法が含まれています。

要約

ジカ (ZIKV) は北、中央、南アメリカで現在流行フラビ ウイルスです。それは今、ZIKV が小頭症と他の脳の異常を引き起こす可能性が確立されます。しかし、発展途上の脳における ZIKV の発症メカニズムは不明のまま。脳内手術方法、正常と異常な脳の発達と脳の機能について質問に対処する神経科学の研究でよく使用されます。このプロトコルは、古典的な手術手技を利用し、マウス神経系におけるモデル ZIKV によるひと神経疾患を 1 つを許可する方法について説明します。直接脳接種ウイルス伝達の通常モードをモデル化しない、発展途上の脳の ZIKV 感染後結果に関しターゲットを絞った質問に調査官メソッドことができます。このプロトコルでは、ZIKV の脳室内投与の胎生期、新生児、および大人の段階について説明します。一度マスター、この方法は簡単で再現性のある手法を実行するいくつかの時間を取るだけであるになることができます。

概要

小頭症は、新生児の頭の平均サイズより小さいによって特徴付けられる欠陥脳開発から生じる状態です。小頭症児発育遅延、発作、知的障害、難聴、視覚障害と運動と病気の重症度に応じて、他の間でのバランスの問題を含むことができる症状の範囲を示すと1,2,3が発生します。この条件は多因子遺伝、感染エージェントと小頭症4,5,6,7,8の原因にリンクされている環境要因と自然の中 9。2015-2016 ZIKV 発生前に 10,000 出生 8 子供たちは CDC10によるとアメリカ合衆国に小頭症と診断されました。上 2 月 1日st 2016 年の世界保健機構宣言ジカ小頭症診断母親11、ZIKV 感染症に関連付けられての警急の増加に伴い、国際的懸念の公衆衛生緊急事態 12。アメリカ合衆国の ZIKV 例を CDC から最近の研究アメリカから感染個体と ZIKV 感染した母親の 4% と比較して小頭症を開発する子供のための 20 の高められた危険で母体の ZIKV 感染の結果がで起因したことを示唆しています。小頭症11児。小頭症関連付けられているブラジルの ZIKV 感染症から妊娠中に先天性欠損症の率は感染した母親が、ラテン アメリカの他の要因が高められた危険に貢献するかもしれないことを示す赤ちゃんの 17% まで影響を受けていると報告されています。13私たち知っている、ZIKV の小頭症と病態を神経前駆細胞 (NPC) 人口7,8,14がことが、脳の開発の ZIKV の完全な病態。とらえどころのないままです。さらに ZIKV 感染に伴う脳異常の基礎となる疾患のメカニズムを調査する動物モデルを開発することが重要です。

直接、ZIKV が脳の発達に与える影響を調査するには、最初 ZIKV7日 14.5 (E14.5) 脳の脳内接種を用いたマウス モデルを開発しました。この段階は、人間の妊娠14の最初の学期末の代表と見なされますとして選ばれました。この萌芽期の脳内注入法と子犬が生後第 5 (P5) 日まで生き残ることができる (〜 1 μ L 106組織培養感染量 (TCID50/mL) × 1.7)。これらの出生後の子犬は、同様に脳室の拡大、神経細胞の損失、軸索の希薄、アストログリオーシス、ミクログリア活性化12,15など感染した人間の幼児にみられる表現型の範囲を示します。新生児マウス脳が比較的成熟し、妊娠中期16, 人間の脳の発達段階に似ているとマウスの脳の発達に産後の主要なコンポーネントが含まれています。後妊娠期感染症研究では、生後感染症法が説明もされています。P1 で ZIKV に感染した新生児は、13 日間投与後に生き残ることができます。血生まれ大人の段階の感染は以前17を使用する必要がマウスに記載されているインターフェロン (IFN) 規制要因 (IRF) トランスクリプション要因 IRF-3、-5、-7 トリプル ノックアウトひずみ。このプロトコルでは、成人のマウスモデルの抗ウイルス応答を無効にすることを回避するために intraventricularly ZIKV を接種の方法について説明します。これはマウスの免疫回避中、注入のこのルートは典型的な感染経路を直接模倣しません。この矛盾に対処するため、直接、実験者は頭蓋内のルートの代わりに ZIKV の子宮内感染を実行できます。以前の仕事18から採用、この胚性感染症プロトコルでこの手法を簡潔に説明が。

ジカ ウイルスの系統がこの手法で実装 MEX1 447,19メキシコの分離、アフリカを分離氏-766 1947年20で分離があります。ジカ MEX1 44 感染したネッタイシマカから 2016 年の 1 月にメキシコのチアパス州で分離された蚊。テキサス大学医学部ガルベストン (UTMB) でアクセス権を持つこのウイルスを得た。さらに、デング ウイルス血清型 2 (DENV2) の比較研究ではこの手法を使用して接種しました。DENV2、ひずみ S16803 (GenBank GU289914 シーケンス)、1974 年にタイからの患者検体から分離され、c6/36 細胞で継代されました。ウイルスは継代 Vero 細胞で二度世界参照センター新興ウイルスのアルボ ウイルス媒介能 (WRCEVA) マウス注入前に。これはこのテクニックが同様に動作することを示して ZIKV と脳の発達に影響を与える可能性があります他の発現の多様な分譲。

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プロトコル

すべての動物は、南カリフォルニア大学、ジョージア大学のアニマル ・ ケアのガイドライン プロトコルに従ってを使用します。妊娠中のダムと大人のための安楽死方法が承認されたプロトコルに基づいて行われて: 二酸化炭素の窒息、安楽死できるように二次的な方法として頚部転位が続きます。新生児の子犬は斬首で安楽死させた。

注意: 次のプロトコルには処理病原性ウイルスが含まれます。ウイルスを処理しながら、適切な予防措置を取られるべき。すべてのプロトコルは、使用する前に、適切な機関の委員会によって承認されなければなりません。

1. ジカの萌芽期の脳内接種

  1. タイミング妊娠交尾 E0.5 として交配翌日の正午を検討してください。一日の終わりにマウスをペアリングし、交配時期のばらつきを減らすために早朝にプラグをチェックします。
  2. 手術前にガラス針を準備します。針を引っ張ると 1/3 でその長さをカットし、細孔のサイズが 50-70 μ m の範囲チェック針先品質と破損のため万国実体写真の下まで水点滴とマイクロ ピペット グラインダーを使用して 45 ° の角度で研ぐ。
  3. 氷の上に分注ウイルスを保ちます。手術の直前に準備されたガラス注射針に ZIKV 注入ミックスをロードします。ガス タイトな注射器 (50 μ L のボリューム)、ルアーロックの添付ファイル、およびチューブを組み立てるし、鉱物油とチューブで組み立てられた注射器を飽和させます。飽和、一度針を添付し、描画 〜 針に 6-7 μ ZIKV (〜 1 μ L、1.7 × 106 TCID50/mL)。
  4. (頭蓋内注射) を日 E14.5 胚または塩酸ケタミン (80-100 mg/kg) とキシラジン (5-10 mg/kg) 滅菌生理食塩水の溶液で希釈 (子宮内注射) を E10.5 胚で妊娠 c57bl/6 j または 129S1/SvImJ マウスを注入します。腹腔内に母親の麻酔を誘導します。また、必要に応じて監視イソフルラン イソフルラン吸入、廃ガス清掃、によって提供されると母親を麻酔します。ブプレノルフィン SR (0.5-1.0mg/kg) を皮下麻酔を誘発するを挿入します。
  5. ピンチ テストつま先先端または尾の母親は麻酔し、動物が承認した加熱パッド (100 x 200 2.5 mm の熱パッド) にそれらを仰臥位置き。つま先ピンチ鉗子は滅菌ではない、手術で組織を処理するは使用されません。また、つま先ピンチ逃避反射をテストする手袋をはめた手を使用する可能性があります。
    注: は、最寄りの周術期加熱法の制度的獣医スタッフを参照してください。カバーは、この加熱パッドと動物の間置かれました。
  6. 眼軟膏を目に追加します。
  7. 腹部の表面を削るし、3 回ヨードとアルコール消毒します。代替のヨードとアルコール ワイプ;手術部位から円を描くように拭いてください。
  8. 切開および器械の汚染を避けるため無菌布で手術部位の周囲の皮膚をおいましょう。
    メモ: ドレープ オープニングは準備手術サイトより大きくできません。ドレープの開口部に、髪を見てはなりません。
  9. 鉗子で彼女の腹部から母親の皮膚をつまみ、滅菌手術用ハサミで芯矢状線で 1 〜 1.5 cm ラインで下腹部をカットします。これは皮膚に切り取り、胚、現在公開されているので、腹腔内にさらにします。
    注: 外科はさみ、皮膚と腹膜の層を切開する使用されます。滅菌器具や手袋は、各手術に使用されます。
  10. 小さな滅菌ガーゼの中央にスリットを切り、外科的開口の上に適用されます。滅菌生理食塩水で水和物します。一度に 1 つの子宮角に焦点を当てよりも 4-5 胚を削除しないように注意して、滅菌ガーゼに残りの部分にスリットから胚を引き出します。
  11. 前に、彼らは乾かないように接種を通して滅菌生理食塩水で胚をメタンハイド レートします。胚が注入されると子宮角内の場所の追跡。個々 の胚は、胚は子宮内で開発しながら位置を変更しないでください、このように個別の実験として扱われます。(子宮内注入用 1.15 を手順に進みます)。
  12. 胎児の頭の下のへらをそっと置きます。頭と頭蓋骨の縫合を視覚化するランプとともに胚を照らします。
    注: 無菌技術の後、滅菌手術用手袋や楽器など。後 (ランプ) などの非滅菌の項目を操作している、手袋は滅菌器具やエリアを処理する前に新しい滅菌手袋に置き換える必要があります。
  13. 胚の頭まで (可視性のための頭部) の背後にあるランプと無料の指の両方を持つ胚を操作することによりヘッドの位置は、子宮の壁に直接プッシュされ、非利き手で開催。
    注: は胚を位置決めの重要な部分、ほとんどの練習法です。あまりにも多くの指圧は、致死に至る胚膜を損傷することが、十分な圧力注入を困難にすることができます。
  14. ガイドとして頭蓋骨縫合線に沿って実行している血管を使用します。ZIKV ウイルスを注入 (〜 1 μ L、1.7 × 10 6/mL の TCID50 メキシコ分離 MEX1-44) 組み立てられた注射器と針で E14.5 胚脳の側脳室に。シャム注射としてメディア コントロールを使用します。
  15. 妊娠の保持を高めるためには、卵巣の横にある 2 つの胚と上部膣 (図 1 a) の横にある 2 つの胚をウイルスの投与を避けます。全体的にみて、手術の時間が短縮され、胚の損失を防ぐためにリットル当たり以上 6 胚が注入されます。
  16. 妊娠中のダムに戻し注入胚、腹部腔を埋める 〜 0.5 mL 滅菌生理食塩水。閉じるには、最初両方腹部腹膜筋を縫合し、4.0 滅菌縫合糸で外部の皮膚層を第二に縫合します。縫合; を使用することが望ましい。マウス咀嚼の縫合、創傷の裂開の可能性があります。
  17. 部分的に必要な場合、非加熱の領域に脱出するマウスを許可するように加熱パッドで休んでケージにマウスを配置します。麻酔から回復 (1-2 時間) いる間、母親を監視します。個々 の実験によると時間は異なりますの手術後は、胚を開発します。
  18. 子宮内注入
    1. 1 つの子宮角と胚、100 μ L ジカ (106 TCID50単位 100 μ L DMEM で中断) を注入する 1 mL 注射器および 27 G 針を使用またはコントロール中、子宮内の空間や胎盤の組織に。胚は、胚段階解離の注入されているに注意してください。詳細詳細18以前に公開された作品を参照してください。
    2. 妊娠中のダムに戻し注入胚、腹部腔を埋める 〜 0.5 mL 滅菌生理食塩水。閉じるには、まず腹部の腹膜筋を縫合し、4.0 滅菌縫合糸で外部の皮膚層を第二に縫合します。縫合; を使用することが望ましい。マウス咀嚼の縫合、創傷の裂開の可能性があります。
    3. 部分的に必要な場合、非加熱の領域に脱出するマウスを許可するように加熱パッドで休んでケージにマウスを配置します。麻酔から回復 (1-2 時間) いる間、母親を監視します。個々 の実験によると時間は異なりますの手術後は、胚を開発します。

2 ジカの新生児脳内接種: P0 ・ P1

  1. ガス タイトな注射器 (10 μ L のボリューム) と針が詰まっていないことを確認します。きれいにし、26 g 針で 20 mL 注射器 3 をロード テスト: 生理食塩水との 1 つ、70% エタノール、ソリューションをオフに空気で一つ。ウイルス注射用を使用した場合を 10% の漂白剤で殺菌します。
  2. 氷の上のウイルスを保ちます。シリンジのデッド ボリュームを減らすために生理食塩水とそれを充填して注射器をロードし、0.75 μ L 注入材料から食塩を分離する空気を描画します。
  3. 注入された子犬を温め加湿回復室を設定します。暖房のブロックを使用して、滅菌ガーゼで閉めコンテナー (空ヒント ボックス) などを置き、生理食塩水で湿らせます。注射を開始する前にそれを予熱します。
  4. ポンプおよびコント ローラーを含むマイクロインジェクターを設定します。特定の注射器のデバイスの種類コードを確認する (すなわち、10 μ L のシリンジは、デバイスの種類には"D")。注入の速度を決定します。
  5. 手術のセットアップの近く生後 0 または 1 子犬 (P0 ・ P1) を収集します。ウイルスと注射器をロードします。70% で子犬のヘッド マウントを消毒エタノール。
  6. ガーゼの薄層で子犬をラップし、完全に麻酔状態を達成するために氷でそれらを埋めます。子犬は、cryoanesthetized 5 分子犬が応答なし尾/つま先ピンチを実行することによって十分に麻酔注入のことを確認してください。これは、約 15 分間の麻酔状態が得られます。
  7. ヘッド マウントに子犬を置いて、滅菌のヨウ素と、エタノールの頭の表面 (3 回)、それから滅菌ワイプで拭きます (イソプロパノール 70 %etoh)。
  8. 黒のマーカーでラムダをマークし、脳定位固定装置を使用してラムダで座標を記録します。目とラムダの定位座標から始まりのラムダからエッジまでの距離測定は、(の場合は両方を注入、両半球) 目にラムダから 2/5 距離を計算します。
  9. 注射部位の穴を作成する前に麻酔の深さを再確認します。26 ゲージの針を使用して、慎重に、表面的には、注射針用の開口部を作成する頭皮と頭蓋骨 (頭蓋骨は新生児で非常に柔らかい) 射出位置を穿刺します。
  10. パンクした場所に注射針を下げ、針が皮膚を破らだけ計算脳定位固定装置を用いた注射部位 (側脳室) の深さ 1 mm。
  11. 針は、注入深さに下げている、一度プログラムを注入するマイクロインジェクター: 10 nL/s、1.5 分間かけて約 1 μ L 注入の割合でウイルスの 1 μ L (〜 1 μ l 3.4 × 105 TCID50/mL ZIKV)。
  12. 注入が終了したとき、待機 30 秒し、針を撤回 (背側)、ネジを回転させることにより、0.5 mm 刻みで 30 を待っている各インクリメント後 s。
    注: これは注入されたウイルスの漏れを低減します。
  13. 多くのウイルスとは、針と注射器をすばやくロードどちらか削除されると、(別のウイルスまたはモック コントロールに読み込む別の注射器・針) またはあらかじめ加温加湿チャンバーにヘッド マウントから子犬を削除します。数分おきの子犬を監視すると、ゲージの回復。子犬をくずに置き換えます。

3. 大人の脳内接種ジカの

  1. 麻酔を誘導する滅菌生理食塩水で希釈した塩酸ケタミン (80-100 mg/kg) とキシラジン 5 〜 10 mg/kg 腹腔内の成体を注入します。ブプレノルフィン SR (0.5-1.0mg/kg) を皮下麻酔を誘発するを挿入します。つま先/尾ピンチ マウスをその麻酔状態を確保し、その後手術中に頭部を固定する (加熱パッド) と脳定位固定装置でそれをマウントします。
  2. マウスの目の手術中に完全に乾くことを防ぐために目に眼軟膏を追加します。耳の初めに目の後ろに開始頭皮を剃る。ヨウ素と 70% の露出した皮膚の消毒エタノール 3 回。代替のヨードとアルコール ワイプ;手術部位から円を描くように拭いてください。
  3. 皮膚を切開する前に麻酔の深さを再確認します。メスを使用して、前の公開滅菌場所に頭の芯矢状線に沿って 0.5 cm の切開を作ることが。注射部位から皮膚を同時に押しながら硬膜組織の頭蓋骨の表面をオフに綿の先端アプリケータ、圧延動きの使用します。
  4. 前から始まって、手術ドリル ビットを合わせ、次の座標を使用して注入のサイトを識別: AP-0.50 mm、ML: ± 1.5 mm します。 コントロールのフットペダルを使って、ゆっくりと針の穴がクリアされるまでだけ骨をドリルとして頭蓋骨にドリル。
  5. マイクロインジェクター ポンプとガス タイトなシリンジ (10 μ L のボリューム)、定位のドリルを交換してください。食塩とウイルスとの間の小さな気泡を残して、描画 〜 ウイルスの 4-5 μ L。特定のシリンジ ボリューム (すなわち、10 μ L のボリュームのシリンジの D) のデバイス タイプのコードを決定します。DV に針を下げ: 脳表面から-1.50 mm。1 μ L のウイルスを注入するには、10 nL/秒、1.5 分間かけて約 1 μ L 注入のレートをプログラムします。
  6. 注入が終了したとき、待機 30 の 30 を待って、0.5 mm 刻みで針を外し各回転の後の s。これは逆流と注入されたウイルスの漏れが減少します。
  7. Injection(s) が完了したときは、皮膚を緩めるし、露出の頭蓋骨を回復する鉗子を使用します。縫合頭皮 4.0 縫合糸を使用して、脳定位固定装置から、マウスを削除します。麻酔から必要な場合は、非加熱領域に脱出し、彼らは回復 (1-2 時間) を監視するマウスを許可する場所部分的加熱パッドの上に休んでケージ内マウス。

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結果

胎生期脳の ZIKV 接種の注入方式の代表的なイメージが脳内注入 (図 1 a) を描いた図に示すように、子宮と胎盤注射 (図 1 b) を示す、妊娠中ダム方法、胚を閲覧、手術 (萌芽期接種プロトコル) を指向する必要があります。図 2 aは、E18.5 大脳皮質における ZIKV (MEX1-44) 感染 (緑フラビ ウイルス抗原に対する抗体と immunostained) を展示します。Pax6 (赤) は、皮質で Npc をラベル付けします。ZIKV は、E14.5 胚の脳に接種しました。私たちの成長曲線の分析は示す、ZIKV 組織サンプル7、TCID50 アッセイを用いた効率的にレプリケートし、公開された7として (図 2 b

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ディスカッション

脳の発達における ZIKV による被害の調査のため、新生児、胎児および成体の段階で、ZIKV の脳内接種法は、ここで説明しました。簡単である反面、研究者が研究の質と関係者の安全を確保できるように、いくつかの考慮事項があります。

DENV はフラビ ウイルス属の ZIKV に密接に関連します。DENV ない因果ヒトの小児脳疾患にリンクされています。DENV2 することができます正常に感染し、萌芽期接種法を用いた脳の発達で複製 (〜 1 μ L 3.4 x 10 の5 TCID50/mL) (図 2 D)。したがって、感染 Vero 細胞メディア (モック) に加え DENV 感染使えますネガティブ コントロールとして発展途上の脳に ZIKV 固有の病態を研究するために。ウイルス漏洩子宮内で、他の胚の不要な汚染になることができますを避けるために重要です。そのため、続く qRT PCR または TCID50 法それぞれの胚から脳組織を分離することによって感染し、感染していない個人を確認する...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、成人外科と新生児のテクニックの学習に関連する彼の指導や議論のためのロチェスターの大学博士 Abdellatif Benraiss を認めたいと思います。著者はまた博士ジェームズ ・ ローダーデール脳定位固定装置のディスカッション用 UGA ではこの手法の方法論と研究大学の科学者 (円弧) 基盤の進歩の設定に関連を認めたいと思います、サポートと (NINDS 付与 F99NS105187-01 ・ R01NS097231-01 R01NS096176 02) 私たちの NIH のサポート。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
フレキシブルドライブシャフトドリルハンギングモーターライカ39416001
マウスステレオタックス
マイクロ4マイクロシリンジポンプコントローラーWPISYS-MICRO4
UMP3ウルトラマイクロポンプWPIUMP3
モデュランプショットル
アーロックチューブ(19ゲージ)ハミルトン90619
融点キャピラリーキンブル34500-99ガラス針
Fluoro-Max: 赤色 蛍光マイクロスフィアThermo ScientificR25希釈なし;練習用注射に使用
10 & マイクロ;L、モデル1701 LT SYRHamilton80001、胚接種
用10 & マイクロ;L、モデル1701 RN SYR、小型リムーバブルNDL、26s ga、2インチ、ポイントスタイル2ハミルトン80030新生児/成人用
4-0エチロンナイロン縫合糸エチコン-
鉱物油VWRマイクロ
ピペットプーラーサッターインスツルメンツP-1000
ピペットグラインダーナリシゲEG-44
ファストグリーンFCF染料SigmaF72520.5% Dye
Antibodies
Flavivirus group antigen antibodyMilliporeMAB10216ms IgG2a 1:400 (図 2, 図 3)
Pax6DBHBPax6-sms IgG1 1:20
Kopf04557Rマイクロ

参考文献

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