Method Article

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

DOI:

10.3791/56498

⸱

December 8th, 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In This Article

Summary

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Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ ツールの範囲とインジェクションとイメージングのゼブラフィッシュの方向を提案します。

Abstract

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ゼブラフィッシュは、大規模な遺伝的・化学的画面を通じて基本的な発生生物学にまたがるさまざまな疾患や実験的研究の増加の範囲のための便利なツールの強力なモデルとして浮上しています。しかし、多くの実験、特にこれらの感染症と異種移植モデルに関連はマイクロインジェクションや胚とスキルと専門知識を必要とする困難な技術である幼虫の画像に依存します。精度と現在のマイクロインジェクション技術のスループットを向上させるため前、腹側、背側、または横方向に向き、2 日間ポスト受精 (dpf) でゼブラフィッシュ胚を安定させる微細構造デバイスのシリーズを開発、プロシージャ。胚のイメージングを支援、またオリエントのガラス製カバー スリップに対して平行に横方向に 4 ゼブラフィッシュ チャンネル付きシンプルなデバイスを設計しました。一緒に、ここで紹介するツールは、ゼブラフィッシュ技術の最適化のための有用なデバイスを生成するフォトリソグラフィー アプローチの有効性を示しています。

Introduction

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ゼブラフィッシュ遺伝子を大規模の根本的な発生生物学の研究から多くの分野で強力なモデルとして浮上しているし、化学スクリーン1,2。単一細胞の受精卵は、商業的、簡単・使いやすいの開発につながっているに遺伝物質のマイクロインジェクションに依存して遺伝子の過剰発現、ノックダウン、CRISPR/Cas9 変異、遺伝子導入などのルーチンの遺伝子操作定位と注入3卵の安定化に使用できるツール。移植と感染症などの他のアプローチは、後の段階の胚およびより大きいゲージ キャピラリー針4を使用して幼虫にマイクロインジェクションを必要があります。但しより大きいゲージの針を使用は、押すか、または胚を圧延することがなく標的組織に浸透するより困難だと重要な技術的な課題を示します。これらの条件の下でプロシージャの間に乾燥を避けることは難しい、胎児を安定させるために必要な適切な水分張力と胚を取得できない場合があります理想的な標的組織への注入を指向。

次の顕微注入、注入された胚初期時点の画像をキャプチャして選択する正常に挿入されていることを画面に便利です。これらの課題に対応するマイクロインジェクション5とイメージ ベースの迅速なスクリーニング後注入の両方の....

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Protocol

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幼虫の研究動物のケアに関するマサチューセッツ総合病院小委員会プロトコル 2011N000127 の下で承認されました。

1. デバイスの作製

注: すべてコンピューター支援図面 (CAD) ファイルここで説明フォトリソグラフィ マスクを設計するために使用 (図 1)、ダウンロード可能。リンクの材料表を参照してください。

  1. 標準写真平版の技術7を使用してクラス 1,000 のクリーン ルーム内マスター金型ウェハを作製します。組織アレイとチャンネルは、製造元の指示に従って 3 別のマスクを使用して 3 層の順番にエポキシ系ネガ型フォトレジストをパターン: 浅い機能 100 μ m、200 μ m の機能のため、400 μ m の深層の特徴。イメージング デバイスの 2 つのパターン層の浅い機能および深層の特徴の 600 μ m の 400 μ m を使用します。
  2. 15 cm (図 2) を鋳造用シャーレのベースに完成したウェハーをテープします。

2. 微細加工表面のアレイ - PDMS の準備

  1. 使用可能なデバイスを作る金型としてマスター....

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Results

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ここで説明している方法は、デザイン (図 1) および 2 dpf ゼブラフィッシュ、フォトリソグラフィー (図 2) とソフト平版 (図 3) の技術を使用して使用デバイスの作製を示します。このメソッドを使用する多くの設計イテレーションおよび変更の迅速検査、変更および開発の他の段階でゼブラフィッシュ用微細構造寸法の最適化、アプリケーションに拡張可能性があります。

我々 は、挑戦的なマイクロインジェクション技術と便利なイメージングこれらのデバイスの使用を示します。耳胞 (図 4、白点線) は、ゼブラフィッシュ9の好中球動員をテストするために便利、免疫特権および孤立したサ.......

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Discussion

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ここに述べる使用デバイスの最近行った dpf ゼブラフィッシュ マイクロインジェクション52 を容易にし胚の便利な画像の単純な agarose フリー実装デバイスを導入します。これらのツールは、ゼブラフィッシュのテクニックの有用なデバイスの作製に写真平版の技術の有用性を強調表示します。

我々 MSA デバイス特に有用な発見した細胞や粒子の射出用マイクロインジェクション針、真菌分生子など配信のため大きな穴針の使用を必要とするひと癌細胞内で凝集しやすい。耳胞 (図 4) 注入は、胚は頻繁に針を接触時にロールとして特定の課題を提示します。我々 はオリエントし、の横ゼブラフィッシュを安定させる微細構造チャネルの使用を見つける方向は、スループットと我々 の手でこの手法の精度を大幅に改善します。

好中球動員や異種移植腫瘍転移の評価など、異なる時点で横方向に指向のゼブラフィッシュの急速なイメージングのアガロースを回避する胚との間に損傷.......

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Disclosures

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著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

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著者は気前よく水槽スペースを提供するためデビッド Langenau を感謝したいです。エリック ・ ストーン、ジョン c. ムーア、秦唐は、ここで使用されるゼブラフィッシュ系統を調達のレナード ・ ゾンのラボからエリオット懸アン ・ ロバートソンと試薬、ゼブラフィッシュ メンテナンスを支援します。彼らはまたオクタビオ ウルタドのフォトリソグラフィー技術に関するアドバイスをありがとうしたいと思います。FE は、子供とアメリカのオーストラリア連合の Shriner の病院からの奨学金で賄われていた。この仕事 NIH によって資金が供給された GM92804 を付与します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ダウ コーニング シルガード 184 ポリジメチルシロキサン (PDMS)エルスワース Adhsives184 SIL エラスト キット 0.5KGデバイスの鋳造用。キットに含まれるもの PDMSモノマーと開始剤
低ゲル化温度 アガロースシグマ アルドリッチA9414-10Gキャスティング用アガロース装置
PFDTS シランシグマ アルドリッチ448931-10GネガティブPDMS金型のキャスティング用
トリカイン (MS-222)シグマ アルドリッチE10521-10Gゼブラフィッシュを麻酔する
ローダミン デキストラン 70,000 DaサーモフィッシャーD1818マイクロインジェクションをトレースするには
ロイコトリエン B4 (LTB4)ケイマン ケミカルズ20110好中球化学誘引剤
N-ホルミルメチオニン-ロイシル-フェニルアラニン (fMLP)シグマ アルドリッチF3506-50MG好中球化学誘引剤
15 cm ペトリ皿フィッシャー科学08-757-148マスターウェーハからのキャスティング用
ガラス底 6 ウェルプレートMatTekP06G-0-20-Fイメージングデバイス用
ホウケイ酸ガラス マイクロキャピラリーワールド・サイエンティフィック・インスツルメンツTW-100-4マイクロインジェクション針用
トランスファーピペットシグマ・アルドリッチZ350796ゼブラフィッシュ胚の移植用
マイクロローダーチップフィッシャーサイエンティフィックE5242956003マイクロインジェクション針の装填用
ハリス・ユニコア 1.5mmパンチテッド・ペラ株式会社15111-15PDMSイメージングデバイスのポートを打ち抜くには
No.11 ScalpelFine Science Tools10011-00PDMSの切断用
Dumont No.5 鉗子Fine Science Tools11252-10胚の解剖とマイクロインジェクション針先を壊すため
Marzhauser マイクロマニピュレーターASIMM33-Rマイクロインジェクション針の操作用
マグネットスタンドMSCSPI - 87242624マイクロマニピュレーター搭載用
MPPI-3 PicopumpコントローラーASIMPPI-3マイクロインジェクションの量とタイミングを制御するため
EVOS 倒立蛍光顕微鏡サーモフィッシャーEVOS FL注入した胚を画像化する
解剖顕微鏡ニコンSMZ745マイクロインジェクションの可視化用
AutoCADソフトAutodeskAutoCAD ファイルのダウンロード元: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853<[> および ZFIN コミュニティ プロトコルの Wiki ページ (https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ プロトコル + Wiki)  

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916

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