ここでは、中期 II ステージに卵核胞から体外成熟中に実行される卵発達能力の非侵襲的評価するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、粒子画像流速測定法 (PIV) ニューラル ネットワーク解析とタイムラプス イメージングを組み合わせます。
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この記事について
サマリー
要約
不妊クリニック発達有能と無能な卵全体の妊娠の結果を向上させる非侵襲的な手順を使用してを選択する機能の恩恵。我々 は最近、卵核胞 (GV) から体外成熟細胞運動の分析に続いて、中期 II ステージ中にマウス卵母細胞の顕微鏡のライブ観察に基づく分類方法を開発この時間経過の期間中に発生しています。ここでは、このプロシージャの詳細なプロトコルを提案する.卵は、完全育てられたから胞状卵胞から隔離され、37 ° C、5% CO2で時間経過の分析のため、顕微鏡内 15 時間培養します。写真は、8 分間隔で撮影されます。各卵子の培養期間中に発生する細胞質の運動速度 (CMVs) のプロファイルを計算する粒子画像流速測定法 (PIV) メソッドを使用して画像を分析します。最後に、それぞれの単一の卵母細胞の CMVs は主務が発達 91.03% の精度で無能か配偶子の確率を予測する数理分類ツール (フィード フォワード ニューラル ネットワーク、ファン) を介して供給されます。このプロトコルは、マウスの設定は、人間を含む他の種の卵母細胞に今テストでした。
概要
女性の不妊は、女性数の増加に影響を与える検査です。世界保健機関によると約カップルの 20% が不妊、女性不妊原因の 40% です。さらに、がん治療を受ける女性の 3 分の 1 (300,000/年、米国やイタリアで 30,000/年それぞれ) 早期の卵巣の失敗を開発。
がん患者の不妊を防ぐため戦略は、MII ステージ (GV-MII 切り替え) に GV 卵子の体外成熟 (IVM) 続いて、がん治療前に卵胞の凍結と分離です。受精と発生過程と全体的な妊娠成功1,2卵子の発生能の非侵襲的なマーカーの可用性が向上します。
ヘキスト 33342、觀螢光色素で染色後に観察されたクロマチン構成に基づいて完全育てられた卵母細胞が囲まれた核小体 (SN) やない囲まれた核小体 (NSN)3のいずれかに分類されます。異質染色質組織以外にも卵母細胞のこれらの 2 つのタイプ表示多く形態的, 機能的違い3,4,5,6
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プロトコル
動物を含むすべてのプロシージャは、制度的動物のケアし使用とパヴィア大学の倫理委員会によって承認されました。動物は、22 ° C、湿度 60% の空気と 12:12 時間の明暗サイクルの条件の下で維持されました。
1. 卵巣の分離
- 腹腔内 2 4-11 週齢 CD1 雌マウス 10 U の卵胞刺激ホルモン滅菌 1 mL インスリン注射器を注入します。
- 46-48 h を待ちます。
- マウスの重さし、Zoletil (Tiletamina、Zolazepan cloridrate) の 50 mg/kg の筋肉内注射で麻酔。頚部転位によって安楽死させます。
- 剥離鉗子のペアを使用して腹壁を覆っている皮膚を把握します。はさみで皮膚と体壁をカットし、鉗子で切開を開けます。
- ピンセットのペアを使用して、移動勇気はさておき、正確な子宮角と四肢の運動で卵巣をローカライズします。
- 時計鉗子を用いた卵巣優しく押しながら子宮にその靭帯をカットするはさみを使用します。他の卵巣を繰り返します。
- 37 ° c、5% CO2空気中で加温 M2 分離培地 1 mL を含む 35 mm 細胞培養シャーレに収集した卵巣を転送します。
- 脂肪と顕微鏡下で高級はさみを使用して卵管を取り外します。
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結果
図 2は、それぞれ先頭 (GV) と IVM プロシージャの終わり (MII) 代表的な発達有能で無能な卵を示します。完全育てられたマウス卵母細胞の IVM 培養 15 時間中に発生します。時間経過の観察は減数分裂の進行を記録し、GVBD と第一極体の押し出しなどを含む、主要な減数分裂イベントを検出します。
分析と無能な卵母細胞発達有能な対200 以上の比較は、減数分裂の進行で時間差を示した。具体的には、NSN 卵母細胞、GVBD が著しく遅れた 1-2 時間経過フレームの PB1 押出は 15 フレーム遅延で発生するのに対し。これらの違いにもかかわらず、変動が単一卵母細胞分類を許可するように高すぎます。このため、手順を数学的な分類ツールを実装しました。
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ディスカッション
1 つはこのプロトコル マウス卵母細胞と他の種のそれらの実行中の世話をする必要がありますいくつかの重要な手順があります。コンパニオンの積雲からの分離細胞のトリガーに卵母細胞必要がありますすぐに記録の低下に転送一度彼らの卵胞から分離、GV の MII 遷移の開始。議定書への可能な変更が Coc 分離に使われる M2 媒体に 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) の付加であります。IBMX GV-MII 遷移の即時トリガーを防ぎ、卵母細胞の実験グループの同期を可能にします。
実験 (材料の表を参照) で使用されているライブ細胞スクリーニング システムは、4 実験あたり 16 卵母細胞の合計にこのようにドロップあたり 4 卵子に成熟液滴の数を制限します。他のコマ撮りライブ細胞スクリーニング システム、商業的にいくつかの培養室を装備を使用して、この制限を克服できます。
我々 の経験に基づいて、枠と次の記録間隔は重要です。予備実験の後、我々 の画像を取った 8 分毎これは胚 vescicl.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
サポートのおかげで可能に作られたこの作品: パヴィア大学ドイツ連邦共和国 2016;パルマ大学フィル 2014、2016;本研究の遂行に必要なプラスチック製品を供給するためのキネシス。博士シェーン ウィンザー (工学部、ブリストル大学、イギリス) は、Cell_PIV ソフトウェアを提供することを感謝いたします。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| フォリゴン | インターベット | A201A02 | ホルモン治療 |
| ヘキスト33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | 卵母細胞ヘテロクロマチン染色用 |
| 細胞培養 ペトリ皿 35 mm x 10 mm | コーニング | 430165 | COCs分離用 |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | 卵子in vitro成熟用 |
| 細胞培養 ペトリ皿 35 mm ガラス底 | ウィルコ | GWSt-3522 | イメージング実験用 |
| BioStation IM-LM | ニコン | MFA91001 | ライブセルスクリーニングシステム |
| パスツールピペット | デルキマイカ 科学 ガラス器具 | 6709230 | 卵胞操作用 |
| 鉱物油 | Sigma-Aldrich | M8410 | 汚染と媒体蒸発を防ぐため |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ライフテクノロジー | ズ 15070063 | 媒体の汚染を防ぐため |
| ウシ胎児血清(FBS) | シグマ・アルドリッチ | ML16141079 | メイクアップ用&α;MEM媒体 |
| L-グルタミン | ライフテクノロジー | ズ25030 | アップ&アルファ;MEM媒体 |
| タウリン | シグマ-アルドリッチ | T0625 | メイクアップ用&アルファ;MEM媒体 |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | メイクアップ用 & α;MEM培地 |
| ビン酸ナトリウム | シグマ・アルドリッチ | P4562 | メイクアップ用 & alpha;MEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | マウス麻酔 |
| Cell_PIVソフトウェア用 | Shane Windsor博士(英国ブリストル大学)より提供されました | 。 - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | マルチパラダイム数値計算用 |
参考文献
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a syst....
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再版と許可
