Method Article

ニューラル ネットワークによる発達有能か無能なマウス完全育てられた卵母細胞の同定

DOI:

10.3791/56668

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March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、中期 II ステージに卵核胞から体外成熟中に実行される卵発達能力の非侵襲的評価するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、粒子画像流速測定法 (PIV) ニューラル ネットワーク解析とタイムラプス イメージングを組み合わせます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

不妊クリニック発達有能と無能な卵全体の妊娠の結果を向上させる非侵襲的な手順を使用してを選択する機能の恩恵。我々 は最近、卵核胞 (GV) から体外成熟細胞運動の分析に続いて、中期 II ステージ中にマウス卵母細胞の顕微鏡のライブ観察に基づく分類方法を開発この時間経過の期間中に発生しています。ここでは、このプロシージャの詳細なプロトコルを提案する.卵は、完全育てられたから胞状卵胞から隔離され、37 ° C、5% CO2で時間経過の分析のため、顕微鏡内 15 時間培養します。写真は、8 分間隔で撮影されます。各卵子の培養期間中に発生する細胞質の運動速度 (CMVs) のプロファイルを計算する粒子画像流速測定法 (PIV) メソッドを使用して画像を分析します。最後に、それぞれの単一の卵母細胞の CMVs は主務が発達 91.03% の精度で無能か配偶子の確率を予測する数理分類ツール (フィード フォワード ニューラル ネットワーク、ファン) を介して供給されます。このプロトコルは、マウスの設定は、人間を含む他の種の卵母細胞に今テストでした。

Introduction

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女性の不妊は、女性数の増加に影響を与える検査です。世界保健機関によると約カップルの 20% が不妊、女性不妊原因の 40% です。さらに、がん治療を受ける女性の 3 分の 1 (300,000/年、米国やイタリアで 30,000/年それぞれ) 早期の卵巣の失敗を開発。

がん患者の不妊を防ぐため戦略は、MII ステージ (GV-MII 切り替え) に GV 卵子の体外成熟 (IVM) 続いて、がん治療前に卵胞の凍結と分離です。受精と発生過程と全体的な妊娠成功1,2卵子の発生能の非侵襲的なマーカーの可用性が向上します。

ヘキスト 33342、觀螢光色素で染色後に観察されたクロマチン構成に基づいて完全育てられた卵母細胞が囲まれた核小体 (SN) やない囲まれた核小体 (NSN)3のいずれかに分類されます。異質染色質組織以外にも卵母細胞のこれらの 2 つのタイプ表示多く形態的, 機能的違い3,4,5,6,7,8 ,9, 減数分裂と発達能力を含みます。体外成熟および卵巣から分離されたとき両方が MII 期卵子に達するの入力精子受精後 2 細胞期に開発、用語9SN クロマチン組織にのみ発展するかもしれない。有能と無能な卵母細胞を選択するための分類法として良い, 主な欠点は螢光色素自体と、上記のすべての検出に使用される紫外線が細胞に突然変異誘起効果は。

これらすべての理由から、我々 は同じ高い分類精度を維持しながらヘキストの使用を置き換えることができます SN または NSN のクロマチン構造に関連付けられている他の非侵襲的なマーカーの検索。細胞質の運動速度 (CMVs) の時間経過の観察は、細胞状態の特徴的な機能として現れています。たとえば、最近の研究は、CMVs の間の関連付けは、受精の時間と能力をマウスとヒトの受精卵の着床前の完全なと完全な長期的開発10,11で記録を示した。

これらの以前の研究に基づいて、ここで述べたい発達有能か無能なマウス完全育てられた卵5,6,7,8の認識のためのプラットフォーム。プラットフォームは、3 つの主な手順に基づいて: 1) から胞状卵胞由来卵子は最初囲まれて核小体 (SN) またはない囲まれた核小体 (NSN); としてクロマチン構成いずれかに基づいて分類されます各単一卵子の GV の MII の移行中に発生した CMVs の 2) コマ撮り画像が撮影され、粒子画像流速測定法 (PIV); と分析・ 3) PIV による解析で、フィード フォワード人工ニューラル ネットワーク (ファン) ブラインド分類12,13。私たちは、テストおよび他の哺乳類種 (例えば牛、猿、人間) ために使用する利用可能な準備ができているし、マウス用に設計されたプロシージャの最も重要な手順の詳細を与えます。

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Protocol

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動物を含むすべてのプロシージャは、制度的動物のケアし使用とパヴィア大学の倫理委員会によって承認されました。動物は、22 ° C、湿度 60% の空気と 12:12 時間の明暗サイクルの条件の下で維持されました。

1. 卵巣の分離

  1. 腹腔内 2 4-11 週齢 CD1 雌マウス 10 U の卵胞刺激ホルモン滅菌 1 mL インスリン注射器を注入します。
  2. 46-48 h を待ちます。
  3. マウスの重さし、Zoletil (Tiletamina、Zolazepan cloridrate) の 50 mg/kg の筋肉内注射で麻酔。頚部転位によって安楽死させます。
  4. 剥離鉗子のペアを使用して腹壁を覆っている皮膚を把握します。はさみで皮膚と体壁をカットし、鉗子で切開を開けます。
  5. ピンセットのペアを使用して、移動勇気はさておき、正確な子宮角と四肢の運動で卵巣をローカライズします。
  6. 時計鉗子を用いた卵巣優しく押しながら子宮にその靭帯をカットするはさみを使用します。他の卵巣を繰り返します。
  7. 37 ° c、5% CO2空気中で加温 M2 分離培地 1 mL を含む 35 mm 細胞培養シャーレに収集した卵巣を転送します。
  8. 脂肪と顕微鏡下で高級はさみを使用して卵管を取り外します。

2. 卵丘卵子複合体の単離

  1. 幽門洞卵丘卵子複合体 (Coc) が受動的に解放されるまで、滅菌ピンセットや 1 G 滅菌インスリン針を使用して卵巣の表面を穴をあけます。
  2. 卵丘細胞口制御の手を引っ張ってパスツール ピペット (直径 200 μ m) を使用しての 3 つ以上の層で Coc を収集し、培 M2 300 μ L ドロップにそれらを転送します。
  3. 数秒間に軽くピペッティングして手を引いたパスツール ピペット (80 μ m) を使用して卵母細胞を囲む積雲セルを削除します。
  4. 繰り返し卵母細胞から転送 M2 中の 20 μ L ドロップを別卵丘細胞が完全に除去されるまで。

3. クロマチン組織ベースの卵母細胞の分類

  1. 最終濃度 5 mg/mL の 1x PBS で希釈の母液から M2 を中で 0.05 μ G/ml ヘキスト 33342 染色液を準備します。
  2. ヘキスト染色液 35 mm シャーレの蓋の下部の 3.5 μ の微小液滴を配置します。
  3. ドロップを染色ヘキストにそれぞれの単一の卵を転送、予め温めておいた (37 ° C) 加熱プレートの上に皿を置き、光博覧会を避けるために暗いふた付きカバーします。
  4. 常温静置後の 10 分は後より 1 〜 2 秒の紫外線 (330-385 nm) の下で 10 倍の倍率で蛍光顕微鏡で卵母細胞を観察します。
  5. ヘキスト正クロマチン核小体を周囲のリングを呈する場合は、卵母細胞に囲まれた核小体 (SN) (図 1 a)、として分類します。
  6. 彼らの核小体がヘキスト正クロマチンで囲まれていないとショーを分散させる (図 1 b) 核内多色スポットない囲まれた核小体 (NSN) として卵母細胞を分類します。

4. ニューラル ネットワーク ベースの卵母細胞の分類

  1. 4 つの準備 5% 熱不活化牛胎児血清 2 mM L グルタミン 5 mM タウリン、100 U/mL ペニシリン、75 μ g/mL ストレプトマイシン、35 ミリメートルのガラスに 23.5 μ g/μ L ナトリウム ピルビン酸と α MEM 培 2 μ L 水滴シャーレの底し、でそれらをカバー予め温めておいた (37 ° C) および培地の蒸発を避けるためにあらかじめ釣合い鉱物油。
    生きている細胞スクリーニング システムを使用している場合注意: 滴特定の距離をガイドラインとして 7 mm × 7 mm の描画グリッドを使用します。
  2. 転送 3-4 卵にドロップします。
  3. コマ撮り録画ソフトウェアを搭載したライブ細胞スクリーニング システム ガラス底ペトリ皿に配置 (参照材料表)、安定した温度 (37 ° C) と CO2 環境で卵成熟過程の観測が可能濃度 (5%)。
  4. コマ撮り録画ソフトウェアを開きます。画面の左側にある卵子と右側にあるすべての設定ボタンのライブ ショット ウィンドウが表示されます。
  5. 画面中央に位置する卵子のセンターを選択します。必要な場合は、フォーカスを調整します。
  6. Phのボタンを選択し、192; DIA ランプを設定露出時間 1/125 s;得るために1.99;1600 ×1200の解像度。
  7. FL2を選択し、ダイヤ ランプを5に設定露出時間 3 s;得るために2.37;1600 ×1200の解像度。
  8. 文化ドロップ内卵子の位置を記録するために新しいポイントボタンを選択します。各卵母細胞文化ドロップ内の同じルーチンを繰り返します。
  9. 時間を選択し、 8 分と合計時間 15 hまでに買収のサイクルを設定します。
  10. 記録サイクルを開始するコマ撮りを開始を選択します。
  11. MATLAB ソフトウェアを開き、書き込み >>cell_piv;PIV ツールを選択します。
  12. 記録映画が含まれているフォルダーを選択し、全体像をロードする .jpeg ファイルのいずれかを選択します。各卵母細胞領域ツールを選択をクリックして利益 (率 ROI) の領域を選択します。
  13. [ファイル] メニューでPIV プロセスを選択します。ビューアー ツールボタンを選択します。
    注: プログラム ROI 内の速度ベクトルを計算し、.mat ファイルとして保存、データ ファイルが自動的に生成されます。
  14. .Mat ファイルを開くを選択します。ボタン選択 ROI ツールを選択し、卵母細胞の輪郭に沿って円を描きます。ファイル] メニューの [保存] をクリックします。
    注: この地域でベクトルが表示されます、グラフ ウィンドウで振幅データ更新この新しい投資収益率。
  15. オープン全体時間経過フレームの収集した振幅データ記録と、フレーム シーケンスの行を列のスプレッドシートに各単一卵母細胞を分析します。
  16. 10 サブグループに NSN と SN の卵母細胞のデータをまとめます。
  17. 繰り返しフィード フォワード人工ニューラル ネットワークを訓練する 9 のサブグループを使用 (ファン) とブラインド テスト 1 サブグループ。
    1. 別に繰り返し 9 回ブラインド テストのサンプル (10 倍クロス検証) を変更します。
  18. MATLAB を開き、カスタム スクリプトメインを実行し、リクエストでは、訓練データ (train.txt)、(通常から分析するトレーニングとインターバル撮影の間隔の使用 NSN と SN の卵子の数を持つファイルの名前を挿入フレーム フレーム # 112-113 に # 1-2)。
  19. トレーニングを実行する入力を押します。
  20. テスト データ (test.txt) を含むファイルの名前を挿入します。
  21. MATLAB のワークスペースでベクトルtest_outputs_cytを開きます。
    注: 最初の行、それぞれ NSN と SN の卵子の本当の陽性 (TP または True NSN) および偽陽性 (FP または False NSN) を入手する確率を示す画面上にウィンドウが表示されます。代わりに、2 行目で、偽陰性 (FN または False SN) および NSN と SN の卵子の真のネガ (テネシー州または True SN) をそれぞれ取得する確率。
  22. 数式を使用して: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN)、ファンの確度、パーセンテージを計算します。

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Results

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図 2は、それぞれ先頭 (GV) と IVM プロシージャの終わり (MII) 代表的な発達有能で無能な卵を示します。完全育てられたマウス卵母細胞の IVM 培養 15 時間中に発生します。時間経過の観察は減数分裂の進行を記録し、GVBD と第一極体の押し出しなどを含む、主要な減数分裂イベントを検出します。

分析と無能な卵母細胞発達有能な対200 以上の比較は、減数分裂の進行で時間差を示した。具体的には、NSN 卵母細胞、GVBD が著しく遅れた 1-2 時間経過フレームの PB1 押出は 15 フレーム遅延で発生するのに対し。これらの違いにもかかわらず、変動が単一卵母細胞分類を許可するように高すぎます。このため、手順を数学的な分類ツールを実装しました。

...

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Discussion

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1 つはこのプロトコル マウス卵母細胞と他の種のそれらの実行中の世話をする必要がありますいくつかの重要な手順があります。コンパニオンの積雲からの分離細胞のトリガーに卵母細胞必要がありますすぐに記録の低下に転送一度彼らの卵胞から分離、GV の MII 遷移の開始。議定書への可能な変更が Coc 分離に使われる M2 媒体に 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX) の付加であります。IBMX GV-MII 遷移の即時トリガーを防ぎ、卵母細胞の実験グループの同期を可能にします。

実験 (材料の表を参照) で使用されているライブ細胞スクリーニング システムは、4 実験あたり 16 卵母細胞の合計にこのようにドロップあたり 4 卵子に成熟液滴の数を制限します。他のコマ撮りライブ細胞スクリーニング システム、商業的にいくつかの培養室を装備を使用して、この制限を克服できます。

我々 の経験に基づいて、枠と次の記録間隔は重要です。予備実験の後、我々 の画像を取った 8 分毎これは胚 vescicl...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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サポートのおかげで可能に作られたこの作品: パヴィア大学ドイツ連邦共和国 2016;パルマ大学フィル 2014、2016;本研究の遂行に必要なプラスチック製品を供給するためのキネシス。博士シェーン ウィンザー (工学部、ブリストル大学、イギリス) は、Cell_PIV ソフトウェアを提供することを感謝いたします。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
フォリゴンインターベットA201A02ホルモン治療
ヘキスト33342 Sigma-AldrichB2261卵母細胞ヘテロクロマチン染色用
細胞培養 ペトリ皿 35 mm x 10 mm コーニング 430165COCs分離用
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol redMerck-MilliporeMR-015-DFor COCs isolation
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax Sigma-AldrichM4526卵子in vitro成熟用
細胞培養 ペトリ皿 35 mm ガラス底 ウィルコ GWSt-3522イメージング実験用
BioStation IM-LM ニコンMFA91001ライブセルスクリーニングシステム 
パスツールピペットデルキマイカ 科学 ガラス器具6709230卵胞操作用
鉱物油Sigma-AldrichM8410汚染と媒体蒸発を防ぐため
ペニシリン/ストレプトマイシンライフテクノロジーズ 15070063媒体の汚染を防ぐため 
ウシ胎児血清(FBS)シグマ・アルドリッチML16141079メイクアップ用&α;MEM媒体 
L-グルタミン ライフテクノロジーズ25030アップ&アルファ;MEM媒体 
タウリンシグマ-アルドリッチT0625メイクアップ用&アルファ;MEM媒体 
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-AldrichA3310メイクアップ用 & α;MEM培地
ビン酸ナトリウム シグマ・アルドリッチ P4562メイクアップ用 & alpha;MEM media
Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)Virbac SrlQN01AX9マウス麻酔
Cell_PIVソフトウェア用 Shane Windsor博士(英国ブリストル大学)より提供されました。              -               -
MATLABThe MathWorks, Natick, MA                -マルチパラダイム数値計算用
メイクピル

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
  3. Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
  4. Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380(2013).
  5. Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
  6. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
  7. Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
  8. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  9. Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
  10. Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417(2011).
  11. Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
  12. Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
  13. Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).

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