SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

サマリー

本研究では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼ 2 によって Rab10 リン酸化の内因性のレベルを検出する簡単な方法について説明します。

要約

ロイシン豊富な繰り返しキナーゼ 2 (LRRK2) の変異は、家族性パーキンソン病 (FPD) とリンクする示されています。LRRK2 のキナーゼ活性の異常な活性化は、PD の発症機序に関与している、ので LRRK2 キナーゼ活性の生理的レベルを評価する手法の確立が必要不可欠です。最近の研究では、LRRK2 廃止 Rab10 を含む生理学的な条件の下で、Rab GTPase 家族のメンバーであることを明らかにしました。質量分析法による培養細胞における LRRK2 による内因性 Rab10 のリン酸化を検出する可能性があります、されているイムノブロットの現在入手可能な特定のリン酸化抗体の感度不良のためそれを検出することは困難Rab10。ここで、簡単な説明ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) リン酸バインディング タグ (P タグ)、併用を利用した免疫ブロットに基づく LRRK2 による Rab10 リン酸化の内因性のレベルを検出します。N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N'、N'- トリス (ヌクレオチ-2-イル-メチル) - 1, 3 - diaminopropan-2-ol。現在のプロトコルだけでなく P タグを利用する方法の例を提供します、どのように変異と同様阻害剤治療/管理やその他の要因を変える細胞や組織における LRRK2 の下流のシグナリングの評価ができます。.

概要

PD は、主に高齢者¹モーター システムの機能不全の結果、中脳のドーパミン作動性ニューロンに影響最も一般的な神経変性疾患の一つです。ほとんどの患者は、PD を作成し散発的な方法で、病気を継承する家族が集まっています。FPD²とリンクするいくつかの遺伝子の突然変異が見つかっています。FPD の原因遺伝子の 1 つは、LRRK2、パーク 8 と呼ばれる支配的継承された FPD にリンク 8 のミスセンス変異 (N1437H、R1441C、G、H、S、Y1699C、G2019S、および I2020T) にされているの報告された^3,4,5これまでのところです。いくつかのゲノムワイド関連研究 (GWAS) 散発的な PD 患者は PD、LRRK2 の機能に異常が散発的の両方の神経変性疾患の一般的な原因であることを示唆しているのリスク要因として LRRK2 軌跡におけるゲノム変化も確認します。パーク 8 FPD^6,7,8。

LRRK2 は、ロイシン豊富な繰り返しドメイン、複雑なタンパク質 (中華民国) ドメイン、ROC (COR) ドメイン、セリン/スレオニン蛋白質キナーゼ ドメインおよび⁹WD40 リピート ドメインの C 末端の GTP 結合 Ras から成る大規模な蛋白質 (2,527 アミノ酸) であります。8 つの FPD 変異をこれらの機能ドメインの検索します。N1437H と ROC ドメイン、COR ドメイン、G2019S とキナーゼ ドメインで I2020T で Y1699C で R1441C/G/H/S。それは、仮定される G2019S 突然変異は、PD 患者^10、11,12の突然変異を見つけた最も頻繁には、体外で2-3 倍¹³LRRK2 のキナーゼ活性が増加、のでLRRK2 substrate(s) のリン酸化の異常な増加は神経細胞に有毒であります。ただし、それされています患者派生サンプルで評価方法の不足のため散発的/家族性 PD 患者における生理学的関連 LRRK2 基板のリン酸化が変更されるかどうかを検討することが可能。

蛋白質のリン酸化は免疫ブロットまたは質量分析によるタンパク質のリン酸化状態を具体的に認識する抗体を用いた酵素抗体法 (ELISA) によって一般に検出されます。ただし、元の戦略時適用できませんリン酸化特異的抗体を作成する難しさのため。放射性隣酸塩に細胞の代謝ラベリングはリン酸化特異的抗体が容易に利用可能でない場合、リン酸化の生理的レベルを確認する別のオプションです。ただし、放射性物質の大規模な量を要求され、したがって放射線防護¹⁴のために特殊な機器を伴います。質量分析はより敏感なこれらの免疫化学的方法と比較して、蛋白質のリン酸化の分析に人気となったです。サンプル準備は時間がかかるし、高価な楽器が分析に必要です。

Rab10 Rab8 など Rab GTPase の家族のサブセットは、LRRK2 の直接生理学的な基板が¹⁵大規模プロテオーム解析の結果に基づき、最近報告されました。[Rab10 リン酸化された FPD 変異マウス胚性線維芽細胞、マウス¹⁶をノックの肺によって増加するデモンストレーションを行った。本報告では、ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を採用しました-P タグ分子が SDS ページのゲル (P タグ SDS-PAGE) Rab10 リン酸化の内因性のレベルを検出するために共重合する手法リン酸化 Rab10 の高感度抗体はまだ欠けていた。我々 は合計 Rab8 の現在入手可能な抗体の選択度が低くによる内因性 Rab8 のリン酸化を検出する失敗します。したがって、我々 は Rab10 リン酸化に焦点を当てることを決めた。LRRK2 は、Thr73 の非常に節約された「スイッチ II」地域の中で場所に行く Rab10 を廃止します。Rab 蛋白質リン酸化のサイトの高い保護は明確な Rab 蛋白質を認識する検体抗体が作りにくい理由の一つかもしれません。

LRRK2 による Rab8A のリン酸化は、Rabin8、GTP¹⁵にバインドされた GDP を交換することによって Rab8A をアクティブにグアニン ヌクレオチド交換因子 (GEF) の結合を阻害します。Rab10、LRRK2 による Rab8A のリン酸化は、Rab タンパク質の活性化に不可欠な膜¹⁵から GDP 結合 Rab 蛋白質の抽出は、GDP 解離阻害剤 (GDIs) の結合を阻害します。総称して、それは、LRRK2 による Rab タンパク質のリン酸化を防ぎます活性化正確な分子機構とリン酸化の生理的影響は明白でなく残るが、仮定されます。

P タグ SDS ページは 2006 年に木下らによって発明された: この方法ではアクリルアミドは P タグと共有結合は、SDS-PAGE に共高親和とリン酸塩を取り込み分子ゲル¹⁷。SDS ページのゲルの P タグ分子選択的リン酸化タンパク質の電気泳動移動度を遅らせる、ので P タグ SDS-PAGE は非リン酸化のものからリン酸化タンパク質を区切ることができます (図 1)。興味の蛋白質は複数の残基のリン酸化、リン酸化特異的形態に対応するバンドのはしごは見られなくなります。Rab10、場合 Rab10 で Thr73 だけでリン酸化されることを示す 1 つだけ移されたバンドを観察します。リン酸化特異的抗体と免疫ブロット上 P タグ SDS ページの主な利点は非リン酸化特異抗体 (すなわち、認識合計 Rab10) とイムノブロット リン酸 Rab10 が認識されること膜に転送された後である一般により特定、機密、および利用可能な商業学術ソースから。SDS ページ P タグを使用してのもう一つの利点は、リン酸化特異的抗体と免疫ブロットすること放射性と細胞の代謝ラベリングによって不可能である 1 つは、リン酸化の化学量論の近似的評価を取得できることリン酸塩。

別に安価な P タグ アクリルアミドおよびそれに関連するいくつかのマイナーな変更の使用は、現在 LRRK2 による Rab10 リン酸化の検出法免疫ブロットの一般的なプロトコルに従います。したがって、免疫ブロットが浄化された蛋白質、セル lysates の組織乳剤などのサンプルの任意のタイプの通常の練習を任意の所で簡単であり、容易に実行可能ファイルをする必要がありますそれ。

プロトコル

1 P タグ-SDS-PAGE の前処理

1. 削除吸引を使用して細胞が成長して 10 cm 皿からメディアを破棄し、5 mL ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 細胞層を脅かさないよう料理の側に最初の追加 DPBS によって細胞を洗いし、戻って料理を手動でロック何度前後。
2. 削除吸引を使用して DPBS を破棄 DPBS で希釈した 0.25% (w/v) トリプシン 2 mL を加えるし、細胞層をカバーするため料理をそっと差し込みます。CO₂インキュベーター (37 ° C, 加湿空気, 5% CO₂) 5 分のために料理を置きます。
3. 剥離細胞を分割する使い捨てのピペットを使用して上下にピペッティング後 15 mL チューブに細胞懸濁液を収集し、顕微鏡¹⁸の下で hematocytometer を使用して細胞密度を測定します。
4. 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンと補われた mL ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) と/2.5 × 10⁵細胞に細胞を希釈します。6 ウェル プレートの各ウェルに希釈した細胞懸濁液 2 mL (5 × 10⁵セル) を追加します。
5. (37 ° C, 加湿空気, 5% CO₂) CO₂インキュベーターで一晩細胞を成長します。
6. HEK293 細胞にトランスフェクション
   メモ: 内因性 Rab10 のリン酸化が検討される場合は、1.7 をステップに進みます。このプロトコルに供するプラスミドは、リクエストの作成者から入手できます。簡単な情報のための材料表と図の S1の DNA のシーケンスを参照してください。
   1. 1.5 mL チューブに DMEM の分注 200 μ。
   2. 各管にエンコード HA Rab10 と 1.066 μ g (5.33 μ G/ml の最終的な集中) 500 μ G/ml プラスミド株からプラスミド エンコード 3 × フラグ LRRK2 のプラスミッドの両方 0.266 μ (1.33 μ G/ml の最終濃度) を追加します。ポリエチレンイミン (20 mM HEPES 水酸化ナトリウム、pH 7.0 で解散) の mg/ml 1 つ解決の 4 μ L を追加し、すぐに 5 のボルテックスによってソリューションをミックス s。
   3. チューブ 10 分室温で放置し、滴下もピペットを使用する 1 つの管の内容を追加しなさいゆっくりと手動では培養皿を数回前後ロックとトランスフェクション混合物も全体に均等に拡散させる。
7. CO₂インキュベーター (37 ° C, 加湿空気, 5% CO₂) で別の 24-36 h の成長細胞をしましょう。
8. 内因性 Rab10 のリン酸化が検討される場合は、細胞を溶解する前に 1 時間 LRRK2 阻害薬と細胞を扱います。
   1. ジメチルスルホキシド (DMSO) 10 mM の阻害剤を溶解することにより LRRK2 阻害剤の貯蔵液を準備します。MLi 2 と GSK2578215A、極めて特殊で、強力な LRRK2 の阻害剤は、使用をお勧めします。-80 ° C で原液を保存します。
   2. Dmso 溶液を希釈することによって、阻害剤の株式を働いているを準備: MLi-2 のそれぞれ内因性と発現 LRRK2 の 10 μ M と 30 μ M を準備します。GSK2578215A の 1 mM と 3 mM の準備内因性と発現 LRRK2 それぞれ。
   3. マイクロ ピペットを使用して 1 つの中央に MLi 2 または GSK2578215A のいずれかの株式を働いているの 2 μ l 添加し阻害剤も全体に均等に拡散させるプレートを前後手動で数回軽くロックします。
   4. 1.8.3 の手順で阻害剤と同様の方法で異なるよくネガティブ コントロールとしての DMSO の 2 μ L を追加します。
   5. インキュベーターにバック プレートを置くし、1 時間の細胞の培養します。
9. 細胞を溶解させます。
   1. 氷の上には、培養皿を置きます。取り外して、メディアを廃棄します。最初の追加 2 ml セルを脅かさないよう料理の側に DPBS 層し、手動でのロック、料理、前後数回セルを洗浄します。
   2. 削除し、DPBS を破棄し、換散バッファーのセル 100 μ L を加える (50 mM トリス塩酸 pH 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) ポリオキシエチレンノニルフェニル エーテル、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 (エチレング リコール-bis(2-aminoethylether)-N、N、N'、N'-四酢酸)、1 mM ナトリウム バナジン、50 ミリメートルフッ化ナトリウム、10 mM の β-グリセロリン酸、ピロりん酸ナトリウム 5 mM、0.1 μ G/ml ミクロシスチン-LR、270 mM ショ糖、プロテアーゼ阻害剤のカクテル)。
   3. 氷の上でプレートを傾けるし、細胞スクレーパーを使用して、できるだけ多くの細胞をできるだけライセートを収集する細胞をこすり。(氷の上中古冷蔵) 1.5 mL チューブにマイクロ ピペットを使用して lysates を収集します。
      注意: ミクロシスチン-LR は、飲み込んだまたは皮膚に接触する場合に致命的なすることができます。
10. させない完全な換散のため 10 分間氷の上に立ちます。遠心 (20,000 × g、4 ° C で 10 分間) でセル lysates を明確にし、培養上清を新しい 1.5 mL チューブ氷で冷やして事前に転送します。
11. ブラッドフォードの試金によってクリアされた溶解液のタンパク質濃度 (μ g/μ L) を測定します。
    1. 準備のウシ血清アルブミン (BSA) 基準 (0.2, 0.4, 0.6、0.8、および 1 mg/mL) 蒸留水原液を希釈することによって。によってクリアされたセル lysates を 20 倍希釈で蒸留水します。
    2. 3 通の 96 ウェル プレートに BSA の規格・ ブランク (蒸留水)、希薄化後の各セルの 5 μ L/ウェルのライセートを置きます。
    3. 12 チャネルのピペットを使用してブラッドフォードの試金の試薬の 150 μ L/ウェルを追加し、5 分間室温で放置プレート。
    4. 595 で吸光度を測定プレート リーダーと BSA の標準に比較 nm。
12. SDS ページのサンプルの 100 μ L を準備します。サンプルの蛋白質の集中が発現 HA Rab10 の 1 μ g/μ L と内因性 Rab10 の 2 μ g/μ L。
    1. Lysates (μ の蛋白質の集中によって、ボリューム (μ L) を 100 μ g (発現 HA Rab10) と同等のセル lysates または 200 μ g (内因性 Rab10) の蛋白質量 (100 μ g または 200 μ g) で除して計算ステップ 1.11.4 から定量化された濃度を使用して、g/μ l)。
    2. 4 × 塩化物イオンの SDS-PAGE サンプルバッファー (62.5 mM トリス-HCl、pH 6.8, 8% (w/v) SDS、40% (v/v) グリセロール, 0.02% (w/v) ブロモフェノール ブルー, 4% (v/v) β-メルカプトエタノール) の 25 μ L を新しい 1.5 mL チューブ室温で保管に追加します。
    3. セル lysates それぞれにチューブし、5 のボルテックスでミックスの計算された容積を追加室温で s。
    4. 換散バッファーとミックス 100 μ L に 5 のボルテックスで総量をもたらす室温で s。
13. 10 ミリメートルとキレート剤をクエンチする MnCl₂を補足します。500 mM MnCl₂の 1 μ L を追加します。ミックス 5 ボルテックスによって室温で s。
    注: MnCl₂を含むサンプルは通常の SDS-PAGE に適してない場合があります。

この手順はキレート剤の存在のために必要 (エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、グリコールエーテルジアミン四酢酸など等) 換散バッファー内。そうでなければ、P タグ アクリルアミドと結合した Mn^{2 +}イオンがキレート剤によって分離され、P タグ SDS-PAGE は正しく動作しません。

100 ° C で 5 分間ですべてのサンプルを沸騰し、使用するまで-20 ° C 以下のサンプルを格納します。ゆでのサンプルは、少なくとも 6 ヶ月間まで格納できます。

2. P タグ-SDS-PAGE のゲルを鋳造

注: ゲルはゲルを実行したのと同じ日にすべきであります。ゲルは、周囲光の条件下で行うことができます。

1. 最初にメタノール 100 μ L で完全に粉/立体 P タグ アクリルアミドの 10 mg を溶解することにより 5 mM P タグ アクリルアミド原液を準備し、二重蒸留水を追加して 3.3 mL をもたらします。
   注: P タグ アクリルアミドは光に敏感です。調製した溶液は、使用するまで 4 ° C で暗闇の中格納する必要があります。
2. 平滑および切欠きの両方クリーン プレート 70% エタノールをスプレーし、ペーパー タオルで拭きます。ゲル板を組み立てます。この特定のプロトコルで使用されるゲル板の寸法は、80 または 100 mm 幅 100 mm 長さ。平野の間にきれいなシリコンのスペーサーを入れ、切欠き平板と組み立てられたプレートはバインダー クリップでクランプされます。
   注: 通常の SDS ページのために働くゲル板の任意の型を使用できます。
3. 櫛を入れて使用する (17 よくプラスチック製の櫛) 組み立てられたゲル板とゲル板、井戸の底の位置にマークに永久的なマーカー。
4. 10% アクリルアミド ゲル混合物 10 ml (10% (w/v) アクリルアミド (acrylamide:bis-アクリルアミド = 29:1)、375 mM トリス-HCl (pH 8.8) 0.1% (w/v) SDS) 15 mL チューブに。
   注: 最適なアクリルアミド濃度は使用する試薬によって異なります。テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)、アンモニウムの過硫酸 (APS) はこの時点で追加しないでください。
5. それぞれ、最終濃度 50 μ M、100 μ M の 5 mM P タグ アクリルアミドの 100 μ L と 1 M MnCl₂ソリューションの 10 μ L を追加しています。
   注: P タグ アクリルアミドおよび MnCl₂の至適濃度使用する試薬によって異なります可能性があります。
6. 最終濃度 0.15% (v/v) でゲル混合物に TEMED の 15 μ L と 10% (w/v) APS 最終濃度 0.05% (w/v) で、50 μ L を追加します。位置マーク 2.3 の手順で高さが 2 mm 以下まですぐに組み立てられたプレートに 5 s と注ぐのチューブを軽く旋回でよく混ぜます。
7. ゲルの分離の上部を平らにするゲル溶液に 2-プロパノールを優しく層します。
8. 室温で 30 分間立つゲルをしましょう。ゲルを光から保護する必要はありません。
   注:、ゲル寒い室温下で設定するがかかることがあります。ゲル混合物を脱ガス TEMED と AP を追加する前にこの手順を加速できます。この目的のために吸引接続 100 200 mL 三角フラスコにゲル混合物を用意できます。ドガの 10 分のためのソリューション。
9. 層状の 2-プロパノールを削除するには、ペーパー タオルで吸収します。
10. 洗浄ボトルから蒸留水をスペースを埋めることでのゲルの上のスペースを洗って捨てる水を洗面器に注ぐことによって。3 回の洗浄を繰り返します。
11. ペーパー タオルで吸収することによって残りのゲルの上のスペースの残留水を削除します。
12. 4% アクリルアミド ゲル混合の 3 ml (4% (w/v) アクリルアミド (a: crylamide:bis-アクリルアミド = 29:1)、125 mM トリス-HCl (pH 6.8) 0.1% (w/v) SDS) 15 mL チューブに。
    注: は、スタッキングのゲル混合物に P タグ アクリルアミドまたは MnCl₂ソリューションを追加しないでください。
13. TEMED 7.5 μ と 10% (w/v) APS 最終濃度 0.25% (v/v)、0.08% (w/v) の 24 μ L をそれぞれ追加します。5 s の分離ゲルの上に混合物を注ぎチューブを軽く旋回でよく混ぜます。すぐに適切な櫛 (たとえば最大 25 μ L のサンプルを収容する 17 よくプラスチック櫛) を置きます。
14. 室温で 30 分間立つゲルをしましょう。ゲルを光から保護する必要はありません。スタッキングのゲルを設定した後は、さらにストレージなしで実行します。

3-SDS-PAGE および免疫ブロット

1. ゲルから櫛を削除します。ゲルからシリコン スペーサーしクリップを削除します。
2. キャストのゲルを入れてゲル タンク、バインダー クリップにしてタンクにゲルを修正します。
3. ゲルの上部と下部で実行バッファー (25 mM トリス、グリシン、192 mM 0.1% (w/v) SDS) を注ぐ。5 mL シリンジと 21 G 針を使用してゲル部分を削除する実行中のバッファーをフラッシュすることによってきれいな井戸。
4. 注射器に付いている曲がった針を使用してゲルの底空間から空気の泡を削除します。曲がった針をするためには、30 ~ 45 ° 先端と針の間の角度になるので、手動で針の途中で 21 G 針を曲げます。
5. 明確なサンプルを取得する MnCl₂部屋の温度で 1 分の 20,000 × g の添加物による析出物をスピンダウンします。
6. 内因性 Rab10 の発現 Rab10 と 30 μ g タンパク質リン酸化を検出する 10 μ g のタンパク質をロードします。
   注: すべての井戸のサンプルの等しいボリュームをロードするが重要です。空レーンは、1 × 塩化物の SDS-PAGE サンプルバッファーが付いてロードする必要があります。サンプルが MnCl₂場合は、ダミー サンプルを同じ MnCl₂濃度を追加します。
7. 搭載している分子量マーカー (MWM) も補わなければなりません × 1 塩化物イオンの SDS-PAGE サンプルバッファーでロードされたサンプルのボリュームは、すべての井戸で同じ。
   注: 再度、サンプル含まれて場合 MnCl₂、追加 MnCl₂の同じ濃度、MWM に。また、EDTA 無料 MWM は使用できます。
8. 分離ゲルに染料の前に交差するまで (約 30 分) をスタッキングのため 50 V でゲルを実行します。
9. 染料前ゲルの下端に到達するまでサンプル スタック後、電圧を 120 V 分離に変更 (80 〜 100 ミリメートルの約 50 〜 80 分長いゲル、それぞれ)。
   注: 西洋の移行パターンは異なっている通常の SDS-PAGE のゲルにする予定です。それは P タグ SDS ページのゲルの蛋白質の分子量を推定するためには使用しないでくださいが、P タグ ゲルの再現性をチェックするため使用することができます。詳細についての議論を参照してください。
10. ゲルから MnCl₂を削除するゲルを洗います。
    1. バッファー (48 mM トリス、グリシン、39 mM 20% (v/v) メタノール) 含む 10 mM EDTA と 0.05% (w/v) SDS (例えばボートの重量を量る大きい) コンテナーに転送を注ぐ。

バッファーのボリュームは、ゲルをカバーするために十分なはずです。

ゲル板から分離ゲルを削除し、1 つのコンテナーに 1 つのゲルを置きます。スタッキングのゲルを破棄します。

室温で 10 分間のロッキング シェーカー (~ 60 rpm) にゲルを残します。

3 回合計の洗浄手順を繰り返します。
注: 各洗浄のため新鮮なバッファーを使用します。

0.05% (w/v) EDTA を削除する SDS を含む転送バッファーで 10 分に 1 回ジェルを洗い流してください。バッファーのボリュームは、ゲルをカバーするために十分なはずです。

エレクトロ-湿式タンクを使用してニトロセルロースやポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜に転送します。

1. 転送用スポンジ パッドのフィルター紙 (10 × 7 cm) を配置します。フィルター紙の上には、ゲルを置きます。フィルター紙とゲルの間に気泡がないことを確認します。
2. ジェルに膜 (10 × 7 cm) を置いて、ゲルと膜との間に気泡がないことを確認します。
3. 膜に別のフィルター紙 (10 × 7 cm) を置くし、再び、膜とろ紙の間に気泡がないことを確認します。
4. フィルター紙の上には、別のスポンジ パッドを配置します。膜・ フィルター ペーパーのスタックを転送用カセットに入れてください。
5. カセットをゲルと正荷電の陽極の間膜があるかどうかを確かめて、転送タンクに入れます。
6. タンクを電源装置に接続し、冷たい水で満たされたスチレン発泡ボックスにタンクを置きます。100 V 180 分で転送を開始します。
   注: 長時間の転送は、P タグ SDS ページのゲルからタンパク質の転送は通常の SDS-PAGE のゲルからほど効果的でないので必要です。効率的な冷却は、転送中にゲルを溶融を避けるために不可欠です。

転送を確認します。

1. ピンセットを使用してゲルから膜を外し、プラスチック容器に膜に転送されたタンパク質を染色する Ponceau S 溶液 (0.1% (w/v) Ponceau S, 5% (v/v) 酢酸) 膜を浸漬します。溶液の量は膜をカバーするために十分なはずです。
2. 手動で揺動によって室温で 1 分の膜を孵化させなさい。
   注: バンドのはしごは各レーンの見えるようになる必要があります。
3. ピンセットで染色液の膜をピックアップし、バンドのはしごあるサンプルが読み込まれているすべてのレーンで均一なパターン、強度を参照してください。
4. 染色をチェックした後染色液を削除してバッファー TBST (20 mM トリス塩酸 pH 7.4 では、150 mM の NaCl、0.1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate) を追加します。バッファーのボリュームは、膜をカバーするために十分なはずです。
   注: Ponceau S ソリューションは収集することができます、数回を再使用します。
5. 膜に目に見えるバンドがなくなるまで室温でロッキング シェーカー (~ 60 rpm) に TBST で膜をロックします。
6. 5 分新鮮な tbst 洗浄のステップを繰り返します。

取り外して、TBST を廃棄します。室温で 1 時間に 5% (w/v) 脱脂粉乳溶解 TBST で追加してロッキング シェーカー (~ 60 rpm) でブロックします。ブロッキング液量は膜をカバーするために十分なはずです。

一次抗体 (内因性 Rab10 アンチ Rab10 抗体) と抗 HA 抗体発現 HA Rab10 のブロッキング液膜あたり 10 mL で希釈することによって一次抗体ソリューションを準備 (濃度の材料表を参照してください)。

削除しブロックの液を捨て、一次抗体を追加します。4 ° C でロッキング シェーカー (~ 60 rpm) で膜を一晩インキュベートします。

一次抗体のソリューションを削除し、膜を洗浄する TBST を追加します。バッファーのボリュームは、膜をカバーするために十分なはずです。

室温でロッキング シェーカー (~ 60 rpm) で 5 分間膜を孵化させなさい。3 回合計で洗浄 (ステップ 3.16) を繰り返すたびに新鮮な TBST が使用します。

ブロッキング液膜あたり 10 mL の西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 希釈二次抗体二次抗体ソリューションを準備します。アンチ Rab10 抗体プローブ膜が標識されて抗うさぎ IgG 抗体とアンチ プローブは、HRP で標識抗マウス IgG 抗体を使用-HA 抗体 (濃度の材料表を参照してください)。

削除し 3 番目の洗浄後、TBST を破棄し、二次抗体溶液を追加します。室温で 1 時間ロッキング シェーカー (~ 60 rpm) で膜を孵化させなさい。

10 分繰り返し洗浄ステップの合計 3 回、3.17 の手順と同様の TBST で膜を洗浄します。

化学発光 (ECL) を用いた膜を開発します。
注: 露光時間は ECL ソリューションと化学発光の検出に使用されるシステムによって異なる場合があります。

1. 電荷結合素子 (CCD) カメラを搭載した撮像素子、撮像素子に接続されているコンピューターをオンにします。撮像素子の制御ソフトウェアを起動します。CCD カメラの温度が-25 ° c. に達するまで待つ
2. ベンチの上に広げ、ラップの上膜 1 つの ECL 溶液 1 mL を入れます。
3. ECL ソリューションに膜ゲル側アップを置いて、すぐにひっくり返して、膜の両側はソリューションが塗られます。
4. 膜をピックアップし、5 のペーパー タオル膜タッチの片側をさせることによってそれをドレイン s。
5. 透明フィルム (例えば、用紙ポケット) 間膜を置きます。
   注意: プラスチック製のラップは膜を包むため推奨されません。膜を包装用透明フィルムは背景ムラを避けるために目に見えるしわなしでできるだけ平坦にする必要があります。
6. 黒いトレイに膜を配置します。撮像素子にトレイを入れドアを閉めます。
7. 制御ソフトウェアのウィンドウの「フォーカシング」ボタンをクリックします。膜が正しく配置されていることを確認します。「戻る」ボタンをクリックします。
8. 「露出型」の"精度"を選択します。「露出時間」の「マニュアル」を選択し、露出時間を 1 に設定 s。
9. 「感度/解決方法」の「高」を選択します。デジタル画像を追加」はオフのままにします。イメージを取得する「スタート」ボタンをクリックします。
10. コンピューターのディスプレイ上登場イメージを TIFF ファイルとして保存します。
11. 1、3、10、30、60、90、120、150 からの露出時間と撮影画像を繰り返し s と最大 180 秒。最後の画像を撮影するとき、膜の発光、ない、デジタル画像を同時に取ることができるのでデジタル化画像を追加」をチェックします。
12. 興味のバンドで最大のダイナミック レンジと飽和ピクセル (赤色で表示) の最高の画像を選択します。
    注: 検出¹⁹のため、従来の x 線フィルムを使用もできます。

結果

過剰発現システム: ハ-Rab10 3 のリン酸化 × フラグ-LRRK2 の HEK293 細胞します。

HEK293 細胞は、HA Rab10 野生型および 1.066 μ g 3 × フラグ LRRK2 の (野生型、キナーゼ不活性変異体 (K1906M)、または FPD 変異) 0.266 μ g を導入させた。反を用いたイムノブロット P タグ SDS-PAGE を用いて Rab10 リン酸化-HA 抗体 (図 2)。10 μ g のタンパク質は、50 μ M P タグ アクリルアミドと 100 μ M MnCl₂を含む 10% ゲル (80 × 100 × 1 mm) で実行されました。P タグ ゲル (上部パネル) の露光時間は 10 s 標準 ECL ソリューションを使用します。Rab10 と LRRK2 の過剰発現の Co が P タグ ゲルのバンドのシフトを...

ディスカッション

ここでは、P タグの方法論に基づいて内因性レベル LRRK2 による Rab10 リン酸化を検出する簡易で堅牢な方法をについて説明します。現在利用可能なリン酸化 Rab10 抗体発現タンパク質¹⁵でのみ動作するため、P タグ SDS-PAGE を利用した本法は Rab10 リン酸化の内因性のレベルを評価する唯一の方法です。さらに、本法は、Rab10 リン酸化細胞の化学組成の推定できます。P タグの方法論はリン蛋白質に一般的に適用される、ためこの議定書は他のリン蛋白質のための同様のメソッドを確立するための「プロトタイプ」をすることができます。

プロトコルの重要なステップは、鋳造ゲルと試料の調製です。比較的写真不安定な試薬であり、長期的なストレージ 4 ° C で、後リン酸化タンパク質の電気泳動移動度を遅らせる能力が失われる時 P タグ アクリルアミド研究者は、光に P タグ アクリルアミドを公開することを避けるためにすべての心配を取る必要があります。また、P タグ分子はリン酸塩をキャプチャする Mn^{2 +}イオンとの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagents
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	自家製		150 mM NaCl、8 mM Na2HPO4-12H2O、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4 MilliQ水でオートクレーブ
ナトリウム	NacalaiTesque	31320-34
ナトリウム二ナトリウムリン酸水素 12-水	和光	196-02835
塩化カリウム	和光	163-03545
リン酸二水素カリウム	和光	169-04245
2.5% トリプシン (10X)	Sigma-Aldrich	T4549	滅菌 DPBS で 10 倍に希釈して作業溶液
を調製しますDulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
ウシ胎児血清	BioWest	S1560	56°Cで熱不活性化;C for 30 min
Penicillin-Streptomycin (100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
Na hydroxide	Wako	198-13765
Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	原液を 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 で 1 mg/mL で調製し、NaOH
ジメチルスルホキシド	Wako	045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
塩酸	Wako	080-01066
ポリオキシエチレン(10) Octylphenyl Ether	Wako	160-24751	Triton X-100 と同等
エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)	和光	346-01312
オルトバナジン酸ナトリウム(V)	和光	198-09752
フッ化ナトリウム	関東化学	工業 37174-20
&β;-グリセロリン酸 二ナトリウム塩 五水和物	ナカライ テスク	17103-82
ナトリウムピロリン酸十水和物	国産化学	2113899
ミクロシスチン-LR	和光	136-12241
ショ糖	和光	196-00015
完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11873580001	1錠を1mLの水に溶かし、-20°Cで保存することができます。Cは1ヶ月間。細胞溶解に1:50希釈で使用
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23200
Nadium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31607-65
Glycerol	Wako	075-00616
Bromophenol blue	Wako	021-02911
β-mercaptoethanol	関東化学	25099-00
エタノール	和光	056-06967
メタノール	和光	136-01837
リン酸結合タグアクリルアミド	和光	AAL-107	Pタグアクリルアミド
40% (w/v) アクリルアミド溶液	ナカライ テスク	06119-45	アクリルアミド:Bis = 29:1
テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)	ナカライ テスク	33401-72
過硫酸アンモニウム (APS)	Wako	016-08021	10% (w/v) 溶液を MilliQ 水
2-propanol	和光	166-04831
塩化マンガン四水和物	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	プロトコールで使用される分子量マーカー
WIDE-VIEW 染色済みタンパク質サイズマーカー III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0.45	GE Healthcare	10600007	Nitrocellulose membrane
Durapore Membrane Filter	EMD Millipore	GVHP00010	PVDF
membrane Filter Papers No.1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
酢酸	和光	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	ポリオキシエチレンソルビタン モノラウレート
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	和光	345-01865
脱脂粉乳	Difco Laboratories	232100
イムノスター	和光	291-55203	ECL液(普通感度)
イムノスターLD	和光	290-69904	ECL液(高感度)
CBB 染色液	自家製		1g CBB R-250、50% (v/v) メタノール、10% (v/v) 酢酸 1 L のミリQ 水
CBB R-250	和光	031-17922
CBB 脱脂溶液	自家製		12%(v / v)メタノール、7%(v / v)酢酸1LのMilliQ水
名前	会社	カタログ番号	コメント
Antibodies
anti-HA抗体	Sigma-Aldrich	11583816001	0.2 μイムノブロッティング用のg / mL。
anti-Rab10 antibody	Cell Signaling Technology	#8127	Used at 1:1000 for immunoblotting. 特異性は、CRISPR KOによって確認されました。これは、Ito et al., Biochem J, 2016.
抗pSer935抗体	Abcam	ab133450	1 μイムノブロッティング用のg / mL。
抗LRRK2抗体	Abcam	ab133518	1 μイムノブロッティング用のg / mL。
抗-α;-チューブリン抗体	Sigma-Aldrich	T9026	1 μイムノブロッティング用のg / mL。
抗GAPDH抗体	Santa-Cruz	sc-32233	0.02 μイムノブロッティング用のg / mL。
ペルオキシダーゼ AffiniPure Sheep 抗マウス IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	0.16 μイムノブロッティング用のg / mL。
ペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	0.16 μイムノブロッティング用のg / mL。
Name	Company	カタログ番号	コメント
InhibitorsGSK2578215A
	MedChem Express	HY-13237	ストック溶液は、DMSOで10 mMで調製し、-80°で保存しました。C
MLi-2	Dario Alessi 博士 (ダンディー大学)		溶液を DMSO で 10 mM で調製し、-80 °C で保存しました。C
Name	Company	カタログ番号	Comments
Plasmids
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA ダ	リオ・アレッシ博士提供 (University of Dundee)		このプラスミドは、アミノ末端HAタグ付きヒトRab10を発現します。
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	岩坪武博士(東京大学)		伊藤ほか, Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007).このプラスミドは、アミノ末端に3xFLAGタグ付き野生型ヒトLRRK2を発現します。
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	岩坪武博士(東京大学)		Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きK1906Mキナーゼ不活性変異体を発現します。
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			この論文です。このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きN1437H FPD変異体を発現します。
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	岩坪武博士(東京大学)		川寺ら、Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きR1441C FPD変異体を発現します。
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	岩坪武博士(東京大学)		川寺ら、Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きR1441G FPD変異体を発現します。
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	岩坪武博士(東京大学)		川寺ほか, Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きR1441H FPD変異体を発現します。
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			この論文です。このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きR1441S FPD変異体を発現します。
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	岩坪武博士(東京大学)		川寺他提供, Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きY1699C FPD変異体を発現します。
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	岩坪武博士(東京大学)		川寺ら、Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きG2019S FPD変異体を発現します。
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	岩坪武博士(東京大学)		川寺ら、Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013).このプラスミドは、ヒトLRRK2のアミノ末端3xFLAGタグ付きI2020T FPD変異体を発現します。
名前	会社<	strong>カタログ番号	コメント<
strong>Equipments
CO2インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	フォーマシリーズII 3110ウォータージャケットオート
ピペット	ドラモンド	ピペットエイドPA-400
マイクロピペットP10	日用	00-NPX2-10	0.5–10 μL
マイクロピペット P200	日菱	00-NPX2-200	20–200 μL
マイクロピペット P1000	日用	00-NPX2-1000	100°C;1000 μL
マイクロピペット用チップ P10	STAR	RST-481LCRST
マイクロピペット用滅菌チップ P200	FUKAEKASEI	1201-705YS
マイクロピペット用滅菌チップ P1000	STAR	RST-4810BRST	滅菌済み
5 mL ディスポーシャブルピペット	Greiner	606180	滅菌
済み 10 mL ディスポーシャブルピペット	Greiner	607180	滅菌済み
25mL ディスポーサブルピペット	ファルコン	357535	滅菌
済み血球計算盤	サンリードガラス	A126	改良型ノイボイアー
顕微鏡	オリンパス	CKX53
10cm皿	ファルコン	353003	組織培養用
6ウェルプレート	AGCテクノグラス	3810-006	組織培養用
ボルテックスミキサー	サイエンティフィック・インダストリー	ボルテックス・ジーニー 2
セルスクレーパー	住友ベークライト	MS-93100
1.5mL	STAR	RSV-MTT1.5
15mLチューブ	AGCテクノグラス	2323-015
50mLチューブ	AGCテクノグラス	2343-050
遠心分離	タカラトミーMX-307
96ウェルプレート	Greiner	655061	Not for tissue culture
プレートリーダー	Molecular Devices	SpectraMax M2e
SDS–PAGEタンク	日本映像	NA-1010
トランスファータンク	日本映像	NA-1510B
ゲルプレート(ノッチ付き)	日本映像	NA-1000-1
ゲルプレート(プレーン)	日本映像	NA-1000-2
シリコンスペーサー	日本映像	NA-1000-16
17ウェルコーム	日本映像	カスタムメイド
バインダークリップ	日本英道	NA-1000-15
5 mL シリンジ	テルモ	SS-05SZ
21G	テルモ	NN-2138R
発電所 1000 VC	ATTO	AE-8450	SDS用電源ページングとトランスファー
大型計量ボート	イナオプティカ	AS-DL
プラスチック容器	AS ONE	PS CASE No.4	10 x 80 x 50 mm
ロッキングシェーカー	タイテック	NR-10
スチロールフォームボックス	ジェネリック		内寸は、トランスファータンク1個(200×250×250mm)に収まるようにしています。
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		ECL検出用冷却CCDカメラ搭載イメージャー