建設と操業追跡ナノスケール蛍光ことができるリアルタイム 3 D 単一粒子追跡顕微鏡プローブ高拡散速度と低い光子カウント率をこのプロトコルの詳細
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この記事について
サマリー
要約
リアルタイム三次元単一粒子 (RT-3D-SPT) を追跡するセルラ システムにおける高速、3 D プロセスに光を当てる可能性があります。各種 RT 3 D SPT は、近年に前方を置かれているがユーザーは、課題のままに低い光子カウント レートでの粒子の拡散 3 D 高速を追跡します。さらに、RT 3 D SPT セットアップが一般に複雑で実装が困難生物学的問題への広範な応用を制限します。このプロトコルは、(10 kHz) まで低光子カウント レートで 3 D ダイナミック フォトン局在追跡 (3 D DyPLoT)、高拡散速度 (最大 20 μ m2/s) の粒子を追跡する名前付き RT 3 D SPT システムを提案します。3 D DyPLoT が 2次元電気光学偏向器 (2 D EOD) を採用し、単一焦点を当てたドライブに可変音響グラデーション (タグ) レンズ レーザー 3 D で動的にスポット。最適化された位置推定アルゴリズムを組み合わせると、3 D DyPLoT を高いトラッキング スピードと高い位置推定精度単一粒子にロックできます。単一励起と単一検出パス レイアウト、3 D DyPLoT は堅牢で簡単にセットアップです。このプロトコルでは、3 D DyPLoT ステップ バイ ステップを構築する方法について説明します。まず、光のレイアウトが記述されます。次に、システムは校正、走査線 190 nm の蛍光ビーズを圧電 nanopositioner を最適化します。最後に、リアルタイム 3 D の追跡能力を示すためには、110 nm の蛍光ビーズが水で追跡されます。
概要
高度なイメージング技術の出現は、分子レベルまでの細胞現象のより詳しい構造を表示するウィンドウを開いています。確率論的光再構成顕微鏡 (嵐)1,2,3、光重合のローカリゼーション顕微鏡 (パーム)4,5,6,7 等、照明顕微鏡 (SIM)8,9,10,11, 構造および誘導放出の枯渇顕微鏡 (STED)12,13、 14は、生きた細胞の機能と構造に前例のない詳細を提供する回折限界を越えるまで行っています。しかし、どのようにこれらのシステムの動作を完全理解構造....
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プロトコル
1 のレイアウトおよび配置をセットアップします。
- インストールおよび追跡励起のコリメーション レーザーします。
- 自作のマウントを使用して光学テーブルにレーザーを貼付します。マウントは、取り付けレーザー ヘッドおよび光学テーブルの穴が付いたシンプルなアルミ板です。レーザーは、安定性と放熱のため金属製のマウントにしっかりと固定する必要があります。この作品は、特定の蛍光体に合うか実験する波長を選択できますが照明 (図 1)、488 nm 固体レーザを使用してください。重要な要因は 2 つのデフレクタ間波長板によって主に決定される 2D EOD の作業範囲をレーザー波長に合わせて (図 1: W2)。488 nm レーザーは効果的に、緑または黄色蛍光蛋白質 (GFP/YFP)、生きているセル実験における一般的な蛍光タグであるを刺激できます。
- レーザー ビーム高さと誘電体ミラーのペアを使用して方向を調整 (図 1: M). レーザー光は光学テーブルに平行かどうかを確認し、適切な高さに調整します。
注: 高さは顕微鏡プラットフォームに基づいて選択する必要があります。それ明示的には述べていませんが、このプロトコルで使われるそれ以降....
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結果
固定粒子 (図 4) をスキャンと自由に拡散 110 nm 蛍光粒子追跡 (図 5) 上記のプロトコルを次に行った。同時にパーティクルの計算をする各ポイントでのスキャン位置を推定しながら圧電 nanopositioner と箱の光子を移動することによって粒子のスキャンを行ったでも強度 (図 4 a) の正方形で示し、推定位置 x で 1 × 1 × 2 μ m の範囲にわたって粒子の実際の位置との線形関係を示すスキャン画像 y、および z の方向 (図 4 b-f)。
リアルタイム追跡を示すためには、110 nm 蛍光粒子は水の 3 D DyPLoT.......
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ディスカッション
3 D の単一粒子追跡方法の多くの品種は、近年浮上している堅牢なリアルタイムで追跡の簡単なセットアップと低い光子カウント料金で高速三次元拡散はまだ重要な生物学への応用を制限の挑戦問題。3 D DyPLoT メソッドは、いくつかの方法でこれらの課題をこのプロトコルのアドレスで説明します。まず、励起と検出経路はシンプルで堅牢な合わせを作る他の実装に比較して大幅簡素化します。第二に、移動レーザー スポットと位置推定アルゴリズムより安定したフィードバックを作るフィードバック ループの位置の正確な推定値を提供します。第三に、動的に移動レーザー スポットの効果的に大規模な検出範囲 (4 μ m x 1 x 1) は、高速移動粒子の追跡のためことができます。この大規模な検知エリアが重要な理由は、「圧電 nanopositioner 組み込みの応答時間を考慮することが重要です。高速圧電ステージは、1 kHz、順番に 1 さんの 1 ms、4 μ m2/s の拡散係数と 100 nm のナノ粒子への応答時間を制限する順序の共鳴回折麗のセンターから平均 90 nm に拡散します。負わないもの検出ボリューム。平均変位のみで、真にランダム.......
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開示事項
著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。
謝辞
この作品は、によって、国立医学研究所の一般的な受賞番号 R35GM124868 の下で健康の国民の協会のデューク大学にサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2D電気光学ディフレクター | ConOptics | M310A | 2 必要な |
| EOD用電源 | ConOptics | 412 | FPGA出力をEODタグ用の高電圧に変換します |
| レンズ | TAG 光学 | TAG 2.0 | 軸方向に沿ってレーザーを偏向するために使用されます |
| XY圧電ナノポジショナー | MadCity Labs | ナノPDQ275HS | サンプルを移動させて粒子を対物レンズの焦点ボリュームに固定するために使用されます。 |
| Z圧電ナノポジトナー | MadCity Labs | Nano-OP65HS | 拡散粒子に追従するように対物レンズを移動させるのに使用 |
| マイクロポジショナー | MadCity Labs | MicroDrive | サンプルの粗い位置決めと評価に使用 |
| ツァイス | PlanApo | 最高の感度を得るためには高い開口数が必要 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss | |
| sCMOSカメラ | PCO | pco.edge 4.2 | 粒子の位置を監視するために使用 |
| APD | Excelitas | SPCM-ARQH-15 | ダークカウントを少なくし、有益な |
| フィールドプログラマブルゲートアレイ | National Instruments | NI-7852r | |
| ソフトウェア | National Instruments | LabVIEW | |
| Tracking 励起レーザー | JDSU | FCD488-30 | |
| レンズ | ThorLabs | AC254-150-A-ML | L1 |
| レンズ | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L2 |
| ホール | ThorLabs | P75S | PH |
| Glan-Thompson 偏光子 | ThorLabs | GTH5-A | GT |
| 半波長板 | ThorLabs | WPH05M-488 | WP |
| レンズ | ThorLabs | AC254-75-A-ML | L3 |
| レンズ | ThorLabs | AC254-250-A-ML | L4 |
| レンズ | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L5 |
| レンズ | ThorLabs | AC254-200-A-ML | L6 |
| ダイクロイックミラー | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | DC |
| 蛍光発光フィルター | Chroma | D535/40m | F |
| 10/90 ビームスプリッター | Chroma | 21012 | BS |
| PBS | シグマ | D8537 | |
| 190 nm蛍光ナノ粒子 | 前髪研究所 | FC02F / 9942 | |
| 110 nm蛍光ナノ粒子 | 前髪研究所 | FC02F / 10617 | |
| カバースリップ | フィッシャーサイエンティフィック | 12-545A | |
| パワーメーター | Thorlabs | PM100D | |
| CMOS | DCC1545M | ||
| アイリスソー | ラブ | SM1D12D | |
| 顕微鏡 | ッドシティラボRM21 |
参考文献
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imagi....
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再版と許可
