方法論記事

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

DOI：

10.3791/56761

⸱

2018年6月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血中循環がん細胞 (Ctc) がん転移中に肺を植民地化を促進する上での役割を解読する動物モデルです。ここでは、私たちが設立され、正常に実行体内法を具体的にテスト肺植民地化の Ctc の高分子フィブロネクチン (polyFN) アセンブリの要件。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

転移は癌死の主要な原因です。血中循環がん細胞 (Ctc) Ctc によって肺を植民地化が非常に初期の肺転移過程に貢献、がん転移を促進する上での役割を積極的に検討されている.そのため、動物モデルが完全全身転移プロセスをキャプチャする唯一の方法です。体内の肺植民地化アッセイを設けて血管漏出する Ctc の貢献を調べるため実験的デザインの以前に問題が発生したことを考える長期的蛍光セル-トレーサー、carboxyfluoresceinサクシニミジルエステル (CFSE) が中断された腫瘍細胞をラベルに使用した、閉じ込められた Ctc 以外特に肺の除去、共焦点イメージングと定量前をクリアする肺灌流を行った。CTC 表面組み立てられた高分子フィブロネクチン (polyFN) は、転移性腫瘍組織の最終的な確立で肺を植民地化を仲介する発見されています。ここでは、特に肺の植民地化および血管外漏出の Ctc で polyFN アセンブリの要件をテストするため短期を行った肺植民地化アッセイを中断ルイス肺癌細胞 (Llc) (shFN) の FN-shRNA を安定に発現するかスクランブル shRNA (shScr) と 20 の前にラベルが付いた CFSE の μ M は c57bl/6 マウスに静脈内接種しました。マウス肺を植民地化する shFN LLC 細胞の能力は shScr LLC 細胞と比較すると大幅減少したことを実証します。したがって、この短期的な方法論が広く適用特に肺を植民地化する循環内で Ctc の能力を発揮する可能性があります。

概要

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転移癌死1,2の主要な原因であります。主な組織由来腫瘍細胞懸濁液の循環を入力し、彼らの前に様々 な血行性課題、例えばアノイーキス、免疫の攻撃および血圧や幾何学的な制約からせん断応力に起因する損害を生き残る遠隔臓器転移3,4,5,6の成功を口述の重要なステップを植民地化することができます。そのため、積極的な努力は現在循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付けると腫瘍悪性度、転移、がん患者7,8の生存率とこれらの特性を関連付けることで行われています。,9. がん転移のプロセスは特に体内イベントを示しています、動物モデルは転移10、11,12 の完全全身プロセスをキャプチャする唯一の方法.

CTCs 遠隔臓器1,2の植民地化を含む複数の携帯電話イベントを介して転移腫瘍組織になります。ただし、最も一般的に使用される転移アッセイ13,14,15は遠隔臓器の CTC を植民地化を観察する方法を行いません。したがって、CTC の植民地化の可視化のため体内の分析設計が急務します。いくつか体内と体外の短い用語肺植民地化の試金に設計されている、問題および不利な点のまま。例えば、緑色蛍光タンパク質 (GFP) をしながらの試金の過剰発現の腫瘍細胞は、これらに使用されている22,23, 安定 transfect し、十分な GFP の蛍光強度の下で腫瘍細胞クローンの作成にかかる時間顕微鏡。同様が長期細胞トレーサー CFSE による腫瘍細胞の一時的な染色は、gfp 発現する腫瘍細胞を置き換えるに雇われている、それは CFSE 分類された腫瘍細胞が接続されているかどうかを判断することは困難または内だけに存在します摘出臓器16,17の血管。

批判的に転移腫瘍組織18,19,20,21,22 の最終的な確立に貢献する高分子フィブロネクチン (polyFN) Ctc の表面上で組み立てが見つかりました.ここでは、短期的には肺の植民地化の試金が中断されたルイス肺癌細胞 (Llc) 安定 FN shRNA (shFN) またはスクランブル shRNA (shScr) を表現し、事前の付いた CFSE c57bl/6 マウスに静脈内接種を行った。2 〜 3 日後マウス肺最初灌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 受ける前に血管内の未接続の Ctc を完全に削除する共焦点顕微鏡と肺をくわえて Llc の定量化します。明確に示した肺植民地化 shFN Llc の数と腫瘍結節はあった shScr Llc、実質的に植民地化の Ctc の成長を促進する上で Ctc で polyFN アセンブリの役割を裏付けると比較して大幅に削減、肺。我々 の研究は癌転移における polyFN の役割の検討をさらに保証します。

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プロトコル

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すべてのマウスの実験は、当研究所 (ケア、NCKU 医科大学実験動物の使用のためのガイド) のガイドラインに従って行われました。

1. 楽器、文化、メディア、料理の準備

  1. 実験的プロトコルを開始する前に取得 (尾静脈注射) を 26 G/0.5 cm の針を用いて 1 mL 注射器滅菌手術用縫合糸、3 mL シリンジ (肺灌流) の 24 G/3 cm 針ダルベッコ変更イーグル メディア (DMEM)、トリプシン EDTA 溶液 (5グラム/L のトリプシンと 0.53 mM)、ウシ胎児血清 (FBS)、1 x PBS (137 mM NaCl、KCl 2.7 mM、10 mM Na2フォー4と 1.8 mM KH2PO4)、6 cm 文化料理。

2. 準備中と懸濁液中に腫瘍細胞の回復

  1. 滅菌ダルベッコ変更イーグル メディア (DMEM) 10% または 20% を含む準備 FBS たて 0.05%、1 x PBS 2 mM L グルタミンを追加およびトリプシン-EDTA。
  2. 10 %dmem で細胞の培養 37 ° C で FBS、培養皿で 70-80% の合流があるまでそれらを育てます。
  3. 2 mL の滅菌 1x PBS で 2 回洗濯に続いて、料理から文化メディア (DMEM) を削除します。
  4. 0.05 %1 mL を加えてトリプシン-EDTA 料理に徹底的にすべてのセルをカバーするため。すぐに 800 μ L のソリューションを削除し、料理にのみ 200 μ L を残します。30 の 37 ° C で料理を孵化させなさい (携帯型) によって 1 分と細胞の大半がサスペンド状態になるまで待機します。
  5. 新鮮な DMEM の 1 mL を追加 10% を含むと精力的にトリプシンの酵素活性を停止するお皿に直接 FB ピペットの細胞懸濁液を上下 1000 μ L ピペット単一細胞懸濁液を準備するとします。
  6. 1.5 mL 遠心チューブにお皿からセルを転送、室温で 3 分間 162 x g 細胞をスピンします。
  7. 上清を吸引し、37 ° C 2 時間の懸濁液で細胞を回転 1.5 mL 20 %fbs、エンド オーバー エンドを含む DMEM で腫瘍細胞を再懸濁します。
    注: 媒体は回復中に黄色に変わったら場合、は、20% を含む新鮮な培地で古い培地を交換政府短期証券。

3. 蛍光染色と Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) と懸濁液中に腫瘍細胞の解析

  1. 懸濁液中の細胞回復後、用量を染色する蛍光を滴定の室を数えるノイバウアーのトリパン ブルーと適切な生菌数をカウントし、尾静脈注射。
  2. 3 分の 1 mL にペレット細胞滅菌 1x PBS、162 x g 3 分で室温の遠心分離によって続いて再懸濁します常温 162 x g で細胞をスピンします。
  3. 500 μ L の 10 を含む 1x PBS でペレットの細胞を再懸濁します %fbs と 0、5、10、20、または用量調節の 40 μ M CFSE 37 oC 暗闇の中で 10 分間の細胞懸濁液を孵化させなさいと。
  4. スピン ・ ダウン 3 分間室温で 162 x g でセルと 4 ml の 1% を含む DMEM の小球形にされた細胞を再懸濁します FBS。この洗浄工程を 3 回繰り返します。DMEM 最終的な洗浄のためだけの 4 ml 小球形にされた細胞を再懸濁します。
  5. 尾静脈注射や CFSE 分類された細胞を蛍光活性化細胞のソーティング (FACS) による単一細胞の蛍光強度を定量化するために対象します。
    注: は、FACS 解析や尾静脈注射を実行する前に氷の上細胞を保ちます。

4. 肺植民地化アッセイ

  1. 20 μ m CFSE 分類されるセルを準備 (ステップ 3.1 3.4 を参照)。
    注: 腫瘍細胞、FACS 解析から滴定結果に基づいてラベル付けのため CFSE の作業量を決定する (ステップ 3.3 を参照)。
  2. 4-6 週のツインテールを暖かい-古い男性 c57bl/6 マウス (6 マウス) マウス尾静脈を拡張するためのマウスでごとに 5-10 分のハロゲン ランプを使用。
  3. 徹底的にミックスし、(5 × 106セル/mL の最終的な細胞密度) の細胞懸濁液で任意の気泡を回避 (26Gx1/2) 1 mL 注射器 CFSE 分類された腫瘍細胞を吸引します。
  4. 慎重に 1 を注入 x106 CFSE 分類された腫瘍細胞マウス落で提出する必要がありますマウスの尾静脈に DMEM を 200 μ l 添加します。
    注: 注入中尾静脈の内腔に針を直接配置した場合腫瘍細胞必要があります簡単に配信循環に注射器にハードにプッシュすることがなく。腫瘍細胞をプッシュするは難しいが場合、彼らほとんど挿入されている尾静脈外の皮下組織に。
  5. マウス静脈内 CFSE 分類された腫瘍細胞を受信した 2 つのグループに分ける: 1 つのグループは共焦点顕微鏡に続いて肺灌流を受けるし、肺植民地化アッセイおよび他の 1 の ImageJ 定量化が残される 4 - 5 だけで長期肺植民地における週間の試金します。
  6. 20、38、45 h 以上との時間コースと用量依存の滴定の間に静脈内注入 1 × 106腫瘍細胞はよく受け入れられ、適切な anesthetizer2350 75 mg/kg zoletil 50, 担癌マウスを麻酔します。
    注: 麻酔中の乾燥を防ぐためのマウスの目に獣医軟膏を使用。
  7. 縦外科はさみで皮膚と胸部に腹部から皮下組織を切る。外科はさみと心臓と肺を完全に公開するための鉗子で胸腔内を開きます。
    注: 血管を切断しないように注意ください。
  8. 上大静脈 (SVC) と下大静脈 (IVC) 肺灌灌流液の逆流を防ぐために滅菌手術用縫合糸とを結ぶ。
  9. 肺から灌流液を排出する裂 (約 2-4 mm) を開く手術ハサミで左心室の壁をカットします。
  10. 1x PBS を右心室に 3 mL 注射器で注入し、肺は完全に薄いに赤みを帯びた色からターンまで肺灌一定の吸引、排水ソリューションを削除します。

5. 共焦点顕微鏡イメージングと肺植民地化腫瘍細胞の解析

  1. 胸腔内から今薄い肺を取り外し、外科はさみ鉗子24と気管と結合組織の靭帯の切除によって 5 つの葉。
  2. 肺葉の配置の 2 つの棒の間にスペースを持つ網状テクスチャーを生成する担架のような肺ホルダーに示すよう図 3 bにナイロン縫合糸を巻き約二本の金属棒を用意します。6 cm 皿肺ホルダーをセットします。
    注: 肺ホルダーは、共焦点顕微鏡の対物レンズの下に肺葉を安定させるために使用されます。
  3. ロッジ、肺ホルダーの網状組織、肺葉を修正します。1x PBS で肺葉を湿らすし、カバーします。
  4. 件名記録肺植民地化腫瘍細胞蛍光画像をキャプチャする共焦点顕微鏡に肺のホルダーに肺葉をかくまっている 6 cm 培養皿です。
  5. イメージングのための対物レンズを使用して、(5 X、MPLN、NA: 0.1、WD: 20、空気)。
  6. NIBA (励起/蛍光; 470-495 nm/510-550 nm) にフィルター ホイールを回転、488 nm レーザーを使って、エキサイト CFSE 明らかに肺の葉に蛍光ドットのイメージを視覚化します。
  7. (マイタイ HP DeepSee レーザー) のフィルター ホイール R690 を回転 2.0 でスキャンする μ s/ピクセル スキャン速度し、HV、ゲインとオフセットを最適化レベル。
  8. 10 で顕微鏡のソフトウェアを使用して蛍光画像 (512 × 512 ピクセル) をキャプチャ μ s/ピクセル スキャン速度。
  9. 定量化し、前述21として ImageJ とグラフパッド ソフトウェアを用いた顕微鏡画像の統計的な分析します。

6. 長期的な肺の植民地化の試金

メモ: 手順 4.1 4.5 から繰り返します。

  1. 4-5 週間の腫瘍細胞接種後マウスを犠牲にし、1 ~ 2 日間ブアン液25彼らの肺を修正します。
  2. 定量化し、統計的に分析ソフトウェア21マウス肺から腫瘍結節。

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結果

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体内の肺の植民地化分析を実行する前に肺の植民地化および/または転移を促進する管外中断された腫瘍細胞上の polyFN を仲介するかどうかをテストするのには、図 1 aに示されているように我々 まず滴定別CFSE は細胞透過性と共有抱合体細胞内アミン含有分子26,27中断された腫瘍細胞のと時間のかなり長い期間、細胞のままである蛍光化合物の濃度。その腫瘍細胞が効果的にラベルの付いた CFSE に示す図 1 bとしての用量依存的にわかった。6 CFSE 分類5 LLC 細胞/ml として 20 μ M の高原に達してほぼ x10 は図 1に示します。

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ディスカッション

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一緒に長期間肺植民地化アッセイ、短期的には遠く離れた臓器に Ctc によって肺菌を体内を用いてここで我々 の方法論は明確に発表し、植民地化で Ctc に組み立てられた polyFN の特定の役割を区別肺の血管外漏出と転移プロセス18,19,20,21につながった。直接確認できなかった長期の細胞追跡 CFSE 肺灌流前まで 3 日間静脈内注入の Ctc をトレースし、定量的な目的のために十分な緑の蛍光性を保持することができましたと細胞をラベルが腫瘍細胞が血管内腔内に位置していたかはすでにに血管からバリウムしました。この問題、赤い蛍光を解決するためにローダミン標識デキストラン レクチンの内皮細胞に発現する非具体的バインドすることができるが肺灌流28,29...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

テクニカル サポートのため博士明分チャン ・ チェンさんは屋新を感謝致します。この作品は、台湾の科学技術省によって支えられた (ほとんど-103-2325-B-006-009、ほとんど-104-2325-B-006-001、ほとんど-105-2325-B-006-001、および MOST-106-2320-B-006-068-MY3) 厚生省と福祉 (MOHW106-TDU-B-211-144004)。また、国立成功大学、医学のコア研究室から多光子顕微鏡のサポートを感謝しております。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Material
ウシ血清アルブミン (BSA)Cyrusbioscience (台北、台湾)101-9048-46-8
Bouin's FluidMCC(医療化学法人)/POISON456-A-1GL
CFSE Proliferation Dyeebiosciences65-0850-85フルネーム: カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル
ダルベッコの改変イーグル培地 (DMEM) (Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)Cyrusbioscience(台湾、台北)101-6381-92-6調製したトリプシン-EDTA溶液用( 最終濃度:0.53mM ) 
ウシ胎児血清 (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC)ATCC, Manassas, VA, USACRL-1642
L-Glutamine, USP (Gibco)ThermoFisher Scientific21051-024
塩化カリウム (KCl)Cyrusbioscience (台北、台湾)101-7447-40-7調製された 1X PBS ( 最終濃度: 2.7mM )
リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)Cyrusbioscience (台北、台湾)101-7778-77-0調製された 1X PBS ( 最終濃度: 1.8mM )
ナトリウム塩化物 (NaCl)Cyrusbioscience (台北、台湾)101-7647-14-5調製済み 1X PBS ( 最終濃度: 137mM )
リン酸二塩基性 (Na2HPO4)Cyrusbioscience (台北、台湾)101-10039-32-4調製済み 1X PBS ( 最終濃度: 10mM )
Trypan BlueSigma AldrichT61460.5 g 100 mL 1X PBS
と混合トリプシンシグマAldrichT4799されたトリプシン-EDTA溶液用(最終濃度:5g / L)
ゾレチル50バック1X PBSで希釈する 
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
コンパクト卓上遠心分離機 2420KUBOTA Co.2420
培養皿 (6cm)Wuxi NEST Biotechnology Co.
使い捨てシリンジ(針付き)パーフェクトメディカル工業株式会社24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
エンドオーバーエンドミキサーC.T.I YOUNG CHENNTS-20懸濁細胞回収用 
FACSCalibur (FACS)BD biosciences
ForcepsDimeda10.102.14
Forma Direct Heat CO2インキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社HEPA CLASS 100
マウス拘束具 (円筒形拘束具 15-30 gm)Stoelting51338
多光子共焦点顕微鏡 BX61WIオリンパスFV1000MPE
ノイバウアー計数室マリエンフェルト・スペリオル640010
手術用ハサミDimeda08.370.11
手術用縫合糸 UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. (株)NO. 0034黒編み絹 非吸収性 (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL 微量遠心チューブWuxi NEST Biotechnology Co.
15 mL Greinerチューブ Greiner bio-one188271
調製ビル705001615001

参考文献

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