ペプチド ベースのマトリックスのためにサンプルを固定ホルマリンの最適な準備支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング ワークフロー

Summary

このプロトコルでは、ホルマリン固定組織イメージング質量分析向けの昇華ベース準備の再現性と信頼性の高い方法について説明します。

Abstract

マトリックス支援レーザー脱離イオン化の使用は、質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングが急速に広がり、この手法を分析し薬と脂質から N 型糖鎖分子のホスト。様々 な試料前処理技術がありますが、このタイプの質量分析の最も困難な課題の 1 つのままホルムアルデヒド保存組織由来ペプチドの検出です。このため、作成し、イオン化可能なペプチドの最大数を誘発しながら、サンプルに含まれる空間情報を保持する強力な手法を最適化します。めざしていますコスト効果的でシンプルな方法でこれを達成するために自動計測を使用して場合に発生することができます潜在的なバイアスまたは準備エラーがなくなります。最終的な結果は、再現性と安価なプロトコルです。

Introduction

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングは、二十年^1、2、生体分子を含む各種の分析のイメージ ベース技術として採用されている: 脂質³、ペプチド^{2 ,4}タンパク質^2、5、代謝物^6、7N 型糖鎖⁸、および合成分子治療薬^9,10など。この手法の有用性を示す出版物の数は、最後の 10 年間^6,11,12,13以上大幅成長しています。脂質などの特定の分子の化学的性質は容易にイオン化し、こうして必要とする少し前の準備³MALDI MSI を介して分析する比較的簡単です。ペプチドなどより困難な目標は、効果的にこれらの分子をイオン化するために必要な手順が、広範かつ一般に複雑な¹⁴。現在、アドレスすることを目指して、このユニークな視覚技術¹⁵の組織を準備に採用されている方法論における再現性を示す非常に少数の出版物があります。この理由のため観測をコンパイルや最適化を実装、単一に簡単に実装できる、方法論、ホルムアルデヒドからペプチドの解析のためには少しの変更が必要な架橋組織ソース¹⁴。

本稿では、検出とホルマリン固定凍結 (FFF) とホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) ティッシュ セクションから生成されたペプチドの空間マッピングの検証、低コストの再現の方法論を説明しました。この方法論を必要としないか、または任意の特殊な計測³に依存。具体的には、ペプチド; を分析に必要な特殊なサンプル準備の多くの側面に取り組む抗原検索¹⁶マトリクス コーティングなどの手順。私達のプロトコルには、安価な装置と試薬、本来なら代替ロボット装置¹⁷をできられない人より広いコミュニティにアクセス可能なこの方法がそれにまた利用します。

マニュアル サンプル調製法の開発の後ろの推論は 2 倍だった: 第一に、装置の使用は 〜 1 μ m 長さ¹⁸より一般的なスプレーで何かは不可能では、マトリックス結晶の一貫性と均一なコーティングを作成しますテクニック。第二に、コストを比較的小さく設定: カスタム装置の総コストは <$ 1500 豪ドル我々 は、費用対効果の面でに注意、ロボット機械の関与がない場合、サンプルあたりの価格ははるかに安い。昇華の使用報告されている以前は、しかし、我々 の知識を最大限に試料調製をこのプロセスを説明するステップバイ ステップの方法論がない報告も、文献に記載されています。

このプロトコルは、MALDI の質量分析計へのアクセスがあるし、興味¹⁹の生体分子に関連する空間情報の生成に専念している研究者を支援するものです。要するに、MALDI MSI は審査組織の形は抗体に依存しないまたは²の汚れを。

Protocol

注意: 適切な個人用保護具 (PPE) (例えば白衣、ニトリル手袋、安全メガネ等)の使用を含む、この手順を実行するときにすべての適用可能な安全注意が従う必要があります。

1. 試薬・機器の準備

1. 溶液の調製
   1. カルノワの液 500 mL を準備するミックス 6 氷酢酸、クロロホルム、100% エタノール (エタノール): きれいなガラス ショット ボトルで v/v/v 比率は 3:1。
   2. 液体ニトロセルロース (NC) をするためには、40 mg/mL の最終的な集中のための穏やかな攪拌できちんとしたアセトン (西部にしみが付くことでよく使われる) NC 膜を溶解します。
2. コーティング NC スライドの準備
   1. 使用血液の準備のため使用されるものと同様の手法が病理²⁰ NC を準備するため汚れはコーティング スライドです。
   2. 導電性インジウムの錫の酸化物 (ITO) 顕微鏡のスライドの 1 つの端に液体の NC の 40 μ L をピペットします。通常のガラス顕微鏡スライドを使用して、表面張力の下でノースカロライナをも薄膜を作成するスライドにドラッグします。
   3. 20 s し、室温で必要になるまで室温で乾燥する NC を許可します。これらの条件下でサンプルのストレージは組織維持され、ほこりの無料提供に明確なできます。
      注: このメソッドの準備としてよりもっとよく知られている「薄膜」は、NC の粘度と表面張力にスライドに自己レベルの欠如に依存する均一なコーティングになります。唯一ケア、スライドの準備は早すぎる移動ではないとき取られるべき完全な報道ではなく、NC の縞模様が作成されます。
      注意: 液体 NC は非常に迅速に乾燥、ソリューションを適切に普及している前に乾燥を避けるためにすぐに働くことが不可欠です。注意は、高エネルギー化合物であるそれとして液体状態で NC を処理し、放火爆発を防ぐために点火の元に連絡する必要がありますいないときにもすべき。NC も乾燥と皮膚や手袋をはめた手で長時間の接触に入って来ること冷たい火傷を引き起こすことが吸熱転移を経る。たびに、関連するすべてのリスクを最小限に抑える少量が準備されるべき (< 1 つの mL をお勧めします)。一度乾燥し、室温で安定しています。ただし、NC は大量に存在する場合は爆発的な残ることができます。
3. カスタム ベーパーチャンバーの作成
   1. 標準プラスチック シャーレ (94 mm 径で 3 mm 厚) の半分下に合うように十分な大きさのはさみのペアで厚めのあぶらとり紙の部分をカットします。
   2. センター、紙、ペトリ皿 (補足図 1) 内での位置が維持されるよう十分な余剰を残して顕微鏡スライドと同じサイズの長方形のストリップを残して、紙をカットします。

2. ティッシュ セクションの準備

1. FFPE 組織²¹。
   1. NC に標準的なベンチ マウントされたミクロトームとフロート マウントで 12 μ m の厚みでそれはプレコート伊藤スライド セクション目的組織ブロックを選択します。
   2. 新鮮なキシレン、2 分間残留パラフィンを削除するスライドを水没し、操作 2 回を繰り返します。
      注: パラフィン ブロックは特に広汎性または組織が比較的小さいパラフィン ブロックと比較して、サンプルがキシレンで洗濯前に大半を離れて溶融する 60 ° C では加熱することができます。
   3. 傾斜溶剤シリーズのスライドを水没によって deparaffinized のサンプルを洗う: 70 %v/v エタノール/水、100% エタノール、カルノワの流体、100% エタノール、超純水、100% エタノール。各浸水の期間必要があります 30 秒、2 分を持続する必要がありますカルノワの流体を除く。
      注意: カルノワの流体とキシレン必要があります保存および吸入した場合非常に有毒な発煙のフード使用します。
2. ホルマリン固定凍結 (FFF) 組織
   注: サンプルする必要があります既に凍結する、適切なサンプルの種類に応じて。
   1. 20 分²²のミクロトームの動作温度で組織ブロックを平衡します。
      注: 平衡温度は組織の種類によって異なります。
   2. 12 μ m と雪解けのマウントにミクロトームを使用して組織に事前に用意された NC セクション コーティング伊藤セクションにスライドさせます。
   3. 暗闇の中でベンチに真空デシケータにスライドを格納します。
      注: これらの条件の下で数週間のためのサンプルを格納できます。
   4. 前述した FFPE 組織 (2.1.3) の傾斜溶剤シリーズのサンプルを洗います。
      注: 必要はありませんキシレン deparaffinisation ステップのサンプルが埋め込まれていないようです。

3. メチレン架橋加水分解

1. 上部に 20 ミリ モル トリス-HCl (pH 8.8) で満ちているプラスチック製のスライド ボックスにスライドのサンプル (FFF または FFPE) を読み込みます。シール ボックスとボックス下部に触れることができるように、水の 500 mL を含む水のお風呂にそれを置きます。70 kPa の圧力を達成することができる圧力鍋で 120 ° C で 15 分間それを熱します。
2. スライドを取り外して冷ます、15 分間常温乾燥させます。

4. 組織消化

1. 加水分解し、一度ティッシュ セクションの端に液の 10 μ L 分注による超純水のトリプシン溶液 (1 mg/mL) の 10 μ L のサンプルをコートし、同じピペット チップを使用して、表面の下で組織の表面全体に液滴をドラッグ緊張。
   注: 組織のエッジの枠を超えて酵素の拡散上にピペット チップ組織表面を傷つけない。
2. 常温乾燥するサンプルを許可します。
3. 一度乾燥し、スライド (補足図 2) のどちらかの端にオートクレーブ テープで構築済みの蒸気室 (組織下向き) の上部にあるサンプルをマウントします。
4. 600 μ L が均等にウェット指が表示されるまで、100% アセトニ トリルと 50 mM 重炭酸アンモニウム ペトリ皿の底の部分にあぶらとり紙指に慎重の 1:1 v/v ミックスを含む溶液をピペットします。
5. 紙指およびサンプル スライドを確保、半分が完全に、整列下部に蒸気室の上半分を置き、パラフィン フィルムの赤道周辺の商工会議所のシールします。
6. 完全な消化力を許可する 37 ° C の定温器のサンプルを一晩おきます。

5. マトリックス昇華によるコーティング

1. かつて消化、5 桁の微量分析バランスのサンプル スライドの重量を量る。
2. 昇華装置の冷却の指の上にスライドをマウントし、蒸気室 (補足図 3) のとおり同じように銅テープで固定します。
   注: スライドは冷却指で均等に連絡を確保するため、銅テープの層は水平な面に冷却の指の下に配置されます。これは行列も沈着につながるスライドは均等に冷却されることを保証します。
3. 商工会議所とマトリックス結晶の薄膜を作成する均等に広がりの下部にガラス シャーレに 300 mg の α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) マトリックスを配置します。
4. 技術を組み立て、馬蹄形クランプで 2 つの半分を固定します。220 ° C でレトルト スタンドに接続されている金属製のリングに置くことで予熱、砂浴上組み立てユニット 15-20 cm を中断します。
5. 真空源に商工会議所を接続し、真空を従事、5 分 ~ 25 mTorr に安定させることができます。
6. パック氷の上に指を冷却し、50 mL の水を追加します。続行する前にさらに 5 分のために解決する装置を許可します。
7. 砂、チャンバーの底に完全に接触を確保、砂の表面に商工会議所を下げ、0.22 mg/cm²の理想的なコーティングを作成する 45 分のためにそれを残す
   注意: ガラス室の致命的な障害で避難中、装置への損傷として高真空でガラスを処理結果ことができる場合は、注意をすべき。
8. 45 分後に金属製のリングを上げることによって砂浴からチャンバーを削除し、商工会議所をぶちまけます。
   注: 商工会議所がベントされて、一度スライドする必要があります削除する空気中の水分が凍結指およびサンプル スライドを凝縮して開始されます非常に迅速に。
9. スライドを削除し、目的のコーティングが達成されていることを確認するそれの重量を量る。
   注: 場合が不足してコーティングを達成すると、プロセスを繰り返して昇華スライドの必要な塗膜厚さを達成するまで。

6. 再結晶

1. ・昇華し、一度説明以前 (組織下向き) として構築済みの蒸気室の上部にあるサンプルのスライドをマウントします。
2. 溶液の均一なコーティングをしてシャーレの底の部分であぶらとり紙の上に慎重に水に酸「100% アセトニ トリルと 0.1% v/v トリフルオロ酢酸の 1:1 (v/v) ミックス 600 μ L をピペットします。
3. 商工会議所を組み立てる、完全に合わせ、1 h の 37 ° C の定温器のまま紙タブや顕微鏡スライドを確保します。
   注意: は、商工会議所をシールしないでください。
   注: 再結晶、一度行列の通常黄色の色合いが白に変更より少なく光沢がある、および表示も非常に。これはその結晶が正しく実行されたことを示します。
4. サンプルは、分析の準備が整いました。

7 計装

1. デジタル イメージを作成するフラットベッドスキャナーのスライドをスキャンします。
2. 質量分析計にサンプルをロードし、適切なソフトウェア プラットフォームを使用して分析します。
3. 750 3,500 Da、望ましい結果に適用されているスポットの解像度の質量範囲で肯定的なイオン リフレクトロン モードのサンプルを分析します。ほとんどの場合、20-50 μ m のラスターの幅が十分では 10 μ m、しかしわずかに使用される¹⁵。
   注意: MALDI UV レーザー電離放射線の源は、直接表示すべき。レーザー計測器は、操作の前にシールド内で含まれていることを確認します。

Results

場合、このプロトコルは総傷やその他の変形 (図 1) なし組織形態を明確に表すイメージを生成します。正しく実行されたサンプルの準備のための理想的な検証はされている分子を変更することによって別の物理的な構造を区別する能力 (図 2)。

サンプルは正しく準備されているかを判断する良いガイドは非局在化またはマトリックス集計の有無をチェックするには身体組織の境界を超えて拡張ペプチド署名は、分子はサンプル準備中に移動している完璧なインジケーターです。・ オルークとパドゥーラの詳細で説明されて (2017)¹⁵。

作り出されたペプチド スペクトルは選ばれた質量範囲

Discussion

このプロトコルは、検体の非局在化を排除しながらイオン化可能な分子種の生成を最大化するために設計されました。重要な要因を含む行列、サンプルを消化したり昇華²⁴; 後再結晶を適用するとき、同じ基本原則を使用してすなわち、蒸気も沈着マトリックスまたはそれ以外の場合、作成および管理する必要があります。再結晶と均等にサンプルの下に、消化の溶剤洗浄をピペッティングどこよりもより多くの溶剤蒸気を受け取る個々 の領域を防ぎます。これは目に見える結露の形成を予防する重要な全体的にサンプルが均等に消化され、再結晶したことの保障し同様、表面の分子の非局在化を阻害します。それは、あまりにも少ない比較的低強度と種の多様性が表示されます行列のも沈着を達成するために不可欠です、あまりにも強度と²⁵種の多様性を低下させる、サンプルからイオンを抑制します。行列も沈着を達成するために中断された顕微鏡スライドのフット プリントの真下でも、薄い均一なサイズのマトリックス結晶層が置かれることを確認します。レイヤーが凹凸や薄すぎるのか、行列の昇華もゆっくり進むが不均一な

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
クライオミクロトーム	ライカ	CM3050	組織の準備と切片用。
酸化インジウム錫顕微鏡は	、ブルカー	8237001	組織の準備と切片用。
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	組織の準備と切片用。
圧力鍋	カンブルック	KPR620BSS	ティッシュの準備と切片用。
昇華剤	Chem Glass	NA	昇華手順用。CG-3038とデザインが似ていますが、カスタムメイドでした
サンドバス	NA	NA	昇華手順用。特定の会社からではなく外部から供給された折り畳まれたアルミホイルに保持された上質な川の砂
ガラスペトリ皿	シグマアルドリッチ	CLS70165100	昇華手順用。
真空ポンプ	NA	NA	昇華手順用。古い質量分析計のスペアパーツとして供給されています
コールドトラップ	ケムグラス	CG-4510-02	昇華手順用。
ホットプレート	ジョン・モリス	EW-15956-32.	昇華手順用。
プラスチック製ペトリ皿	シグマ・アルドリッチ	Z717223	昇華手術用。
37度;Cインキュベーター	NA	NA	昇華手順用。該当なし、インキュベーターは非滅菌で30年以上経過しています
あぶらとり紙	Sigma Aldrich	P7796	昇華処理用。
ニトロセルロース	シグマアルドリッチ	N8395	スライドの洗浄用。
アセトン	シグマアルドリッチ	650501	スライドの洗浄用。
キシレン	シグマアルドリッチ	214736	スライドの洗浄用。
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	スライドの洗浄用。
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	スライドの洗浄用。95%ストックエタノールからラボで作られています
クロロホルム	シグマ アルドリッチ	C2432	スライドの洗浄用。
氷酢酸	シグマアルドリッチ	ARK2183	スライドの洗浄用。
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	タンパク質分解性切断用。粉末を1Mにした後、32% HClで平衡化してPH 8.8
Milli Q Ultra-Pure Water	Sigma Aldrich	NA	タンパク質分解開裂用。サートリアス浄水システムによる社内での浄化
ビルカーボネートアンモニウム	Sigma Aldrich	A6141	タンパク質分解性切断用
トリプシン	Sigma Aldrich	T0303	タンパク質分解性切断用
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	再結晶用。
アセトニトリル	シグマアルドリッチ	1.00029	再結晶用。
トリフルオロ酢酸(TFA)	シグマアルドリッチ	302031	再結晶用。