説明アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) を識別するために設計されています-エージェントを阻害するまたは競争または、アロステリックに CXCR4 活性化による細胞内 Ca2 +放出を刺激します。
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方法論記事
キネティック蛍光ベースの Ca2 +動員試金 G タンパク質共役受容体アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック変調器を識別するために
この記事について
サマリー
要約
彼らは多くの疾患に関与している、よく検証された治療的介入の対象としては G タンパク質共役受容体 (Gpcr)、製薬業界にとって非常に重要です。小さく総合的な分子、受容体の機能を阻害する具体的を含む、リード化合物の発見は新薬開発の重要な最初のステップは、敏感な具体的で、堅牢な細胞ベースのアッセイに頼る。ここで、によって運動アッセイは CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) の活性化に誘発される細胞内の Ca2 +放出を抑制する受容体の拮抗薬を識別するために主に設計されている蛍光読み出しと説明、内因性リガンド、CXC ケモカイン配位子 12 (cxcl 12)。この方法の主な利点は、また組み込みの敵対プロパティ (すなわち、化合物の細胞内 Ca2 +濃度がない場合 cxcl 12 の増加を誘発) 又は化合物に恵まれている化合物のスクリーニングできます。アロステリック結合部位との相互作用を介して受容体の機能を調節すること (すなわち、正と負のアロステリック変調 (Pam と NAMs、それぞれ))。ダウン側に蛍光化合物は、アッセイの読み出し、それにより信頼性の高いデータの解釈を妨げると干渉する可能性があります。最も可能性の高いこのアッセイとして実装できます、最小限の適応するの活性化は、細胞内 Ca2 +のリリースにつながる他の多くの Gpcr のジェネリック医薬品検出アッセイ。
概要
Gpcr は、細胞外リガンド結合に伴うシグナル伝達カスケードを活性化する細胞表面タンパク質の重要なスーパーファミリーです。彼らは多様な細胞内シグナル伝達経路、最終的に生体反応1,2 の開始で起因するペプチド、タンパク質ホルモン類、アミン、脂質などの刺激の大きい変化によってアクティブにできます。.また、Gpcr が場合すべてではない発達的および生理学的プロセスの多くでは、関与している、多くの人間の病気は機能不全の GPCR シグナリングまたは受容体発現に関連付けられています。Gpcr したがって医学1,3で最も検証された薬理学的ターゲット中です。
通常、GPCR 創薬探索ワークフローは細胞スクリーニング アッセイなど小さな分子、モノクローナル抗体と特定の GPCR の活性を調節することができるペプチド化合物の識別を有効にすると起動します。ほとんどは、GPCR 創薬アッセイの多くの異なる種類が存在そのような化合物を検索する、半ば-に高スループットス クリーニング キャンペーンと互換性があります。最もよく使われるアッセイは、受容体結合実験蛍光または発光ベースのいわゆる二次メッセンジャーの (例えばCa2 +、環....
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プロトコル
注: 1 と 2 のセクションで説明したすべてのステップ キャビネット層流無菌条件の下で実行されます。
1. U87 のメンテナンス。CD4.hCXCR4 セル
- 加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でコート t75 フラスコ培養フラスコで細胞を成長します。
注: このプロトコルで使われる培養細胞のラインは安定に発現する分化 4 のクラスター (CD4) と人間 U87 膠芽腫細胞株 CXCR4 と前述の17をされています。CD4 と CXCR4 の細胞表面発現をフローサイトメトリーによる常時監視し、表現のレベルは常に一定 (~ 100 %cd4+と 〜 100 %cxcr4+細胞)。受容体発現レベルを調査する流れ cytometry プロシージャの使用されているセルの行の世代の詳細な説明は、このプロトコルの範囲内ではありません。- 80-85% の confluency にサブカルチャーのセルです。細胞培養する前に部屋の温度 (RT) に到達するすべての試薬を許可します。
- セルから条件培を外し、5 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でセル単一層を洗います。
- 0.25% トリプシン-EDTA の 3 mL を追加し、単層細胞に均等に配布しま....
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結果
U87 で細胞内 Ca2 +動員に cxcl 12 刺激の影響。CD4.CXCR4+と U87。CD4 細胞は、Ca2 +動員アッセイで評価されました。プロトコル (図 1) の最初の分注ステップ中に通常追加されるテスト混合物の 20 μ L、代わりにアッセイバッファーに追加された蛍光 2 AM U87 を読み込まれます。CD4.CXCR4+細胞測定プレート。2 番目の調剤手順では、濃度の異なる cxcl 12 (0.2 102.4 nM、最終濃度) 測定プレートで分配しました。蛍光、Ca2 +リリースの用量に依存する増加と相関の用量に依存して増加を示した (図 2 a)。ここでは、マイナス コントロールのサンプルを表す測定プレートに追加されたアッセイ バッファーのみ追加した両方でそれらの井戸 (すなわち、0 nM cxcl 1.......
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ディスカッション
Ca2 +の動員アッセイ記載以前の識別し、CXCR417のターゲット受容体拮抗薬の分類に貴重なツールであること示されています。ただし、関連ケモカイン受容体 CCR5 の示すようにこのメソッドことができますより一般的にその起動時に、ゾル性細胞質 Ca2 +放出を引き起こす他の Gpcr の大規模なグループに適用することも予想されます。(例えば、セル番号めっきで、蛍光色素を細胞の読み込み) プロトコルのいくつかの手順がするアッセイを転送する前に再最適化する必要があります CCR5 の場合全く同じ実験条件が適用されますが、一方良好な信号対雑音比を得るために他の Gpcr。ここで重要な問題はまた適切な培養細胞ホストの関心と Ca2 +経路の機能的結合の GPCR の高度な表現を許可する選択です。CXCR4、場合 U87 ひと膠芽腫細胞のため選ばれた: (1) CXCR7 の内因性表現の欠如 (関連ケモカイン受容体 CXCR4 として同じアゴニストを占有する)、(2) カップルの Ca2 .......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は、優れたテクニカル サポートにエリック ・ フォンテーン、Geert Schoofs を感謝したいです。この作品は、ルーヴェンに支えられている (no を付与します。PF/10/018)、フォンや Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、いいえを付与します。G.485.08) と財団ドルムール ファドゥーツ。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | 蛍光Ca2+敏感染料 |
| ロニックF-127 | グマ | P2443-250G | プルロン酸 |
| ラチン | G9391 | ||
| AMD3100 | シグマ | A5602-5mg | 特定のCXCR4拮抗薬 |
| マラビロック | AnorMed | 抗レトロウイルス薬、CCR5拮抗薬 | |
| ケモカイン配位子 CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| ケモカイン配位子 CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Σ | A1933-25G | |
| ダルベッコ修正イーグルス培地 (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x)、カルシウム、マグネシウム、フェノール赤なし | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %)、フェノールレッド | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| ファルコンチューブ、50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| 組織培養フラスコ (T75) | Corning | 353024 | |
| ブラックプレート、96ウェル、透明底、蓋付き | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | アッセイプレート(96ウェル)、細胞播種用 |
| ポリプロピレン(PP)プレート | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | コンパウンドプレートとケモカインの調製に使用プレート、丸底 |
| FLIPR Tetra ハイスループット細胞スクリーニングシステム | 分子デバイス | ピペットヘッドとICCDカメラを内蔵した蛍光プレートリーダー | |
| FLIPR Tetra LEDモジュール 470-495 nm | 分子デバイス | 0200-6128 | 蛍光Ca2+高感度染料の励起用発光ダイオード |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515-575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | 蛍光色素 |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96ウェルピペッターヘッド |
| ScreenWorks | Molecular Devices | ||
| 細胞生存率アナライザー | |||
| でのデータ分析と可視化に使用Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | アッセイプレートの手動コーティングの代替品となる可能性のあるプレコート96ウェルアッセイプレートです。 |
参考文献
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome f....
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再版と許可
