方法論記事

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

DOI：

10.3791/56896

⸱

2018年1月30日

 ,  ,  , 
1Institute of Physical Chemistry, University of Freiburg, 2Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、3色 smFRET データと 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデルとその解析を取得するためのプロトコルを提案する.このアプローチでは、科学者は複雑な蛋白質のシステム、協同性や相関相互作用などからキネティック情報を抽出できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

単一分子蛍光共鳴エネルギー移動 (smFRET) 生体分子のダイナミクスを調べるため広く使用されている生物物理学的技術となっています。自分のタスクを満たすために機能サイクルの相互作用パートナーと共に行動する細胞蛋白質の多くの分子機械を持っています。延長にマルチカラー 2 色 smFRET はそれに 1 つ以上の相互作用や構造変化を同時に調査することが可能。これだけではなく smFRET 実験新しいディメンションを追加しますが、イベントのシーケンスを直接研究して固定化サンプルと全反射蛍光相関相互作用を検出するユニークな可能性を提供しています顕微鏡 (TIRFM)。したがって、マルチカラーの smFRET は以前達成不可能の詳細で定量的な方法で生体分子複合体を研究するための多目的なツールです。

ここでは、蛋白質のマルチカラー smFRET 実験の特別な課題を克服する方法を示します。データを取得するため、運動情報を抽出するための詳細なプロトコルを提案します。これは、トレース選択基準、国家の分離、および 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデル (HMM) を用いたノイズの多いデータから状態軌道の回復が含まれています。他の方法と比較して、運動情報はドエル時間ヒストグラムから、直接 HMM からを回復しません。最尤フレームワーク キネティック モデルを批判的に評価して料金の意味のある不確実性を提供することが出来ます。

熱ショックタンパク質 90 (Hsp90) に本手法を適用しておりますはヌクレオチド結合および蛋白質のコンフォメーション変化が世界を解きほぐすことができます。これにより、Hsp90 二量体の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を直接観察できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多くの蛋白質は、動的錯体の構造変化と幅広い時間スケール1,2,3の一時的な連合を介した他の分子とその機能を発揮します。外部のエネルギー源 (例えばATP) これらの動的相互作用することができます機能サイクルの方向性につながる、最終的に生活のための前提条件のセルに非平衡定常状態を維持する結合。

これらの分子機械を完全に理解するためには、静的な記述の構造研究に導かれては十分ではありません。さらに、基になる運動モデルの知識を持って運動速度定数を決定するために不可欠です。いくつかの既存の方法許可バイナリ相互関心、表面プラズモン共鳴など、(例えば、ジャンプまたはストップト フロー分光読み出しと緩和法の 2 つの分子のダイナミクスを研究する研究者テクニック) と核磁気共鳴。ただし、適用性は、(例えば、 1 つのバインドとバインドされていない状態) の単純な 2 状態系平均一括実験に固有のために制限されてほとんどの場合です。以上の国または中間体が関与している場合、彼らは唯一速度定数の複雑な混合物をもたらします。単一分子光ピンセットや磁気ピンセットや 2 色 smFRET、つまり1 ドナー表面固定化したサンプルを 1 つの受容体 fluorophore など方法は、立体配座の変化すべての速度定数を回復できます。しかしときに、1 つ以上の結合部位に影響を与える相互作用は、これらの方法が限られている残る、2 つ (またはそれ以上) の可能な相関相互作用についてのみ、一連の実験から結論は間接を通じてアクセスできます。

マルチカラー smFRET4,5,6,7,8,9は、リアルタイムで直接、下のこれらのコンポーネント間の相互作用を研究する機会を提供しています近く生理的条件10。これにより、たとえば、リガンドまたは別タンパク質8,9,11のコンホメーション依存的結合を調査する 1 つ。ここで示した全体的なアプローチは、測定チャンバーの表面にタンパク質を付けると時間をかけて (の詳細についてを参照してください9プリズム型観察上の蛍光強度を追跡するための特定の位置で興味のタンパク質のラベルには,12) します。 異なる染料の空間的近接性することができますそれらの間のエネルギー移動から決定されます。(文献13) 蛋白質蛋白質から異なる場合があります戦略をラベリングと smFRET 測定におけるアーティファクトを避けるためのガイドライン14が存在します。

ドナー色素は、マルチカラー smFRET 実験で異なるアクセプター色素にエネルギーを移す可能性があります、ので、すべての染料の相対位置は 1 つの染料だけで15,16の興奮からアクセスできません。しかし、交互にレーザー励起 (アレックス17、および18の見直し) との組み合わせでこのメソッドは、1 秒未満でサブナノ メートル分解すべての時空間的情報を提供します。

原則として、構造情報は色素間の距離を使用して実現できます高解像度はアレックスとマルチカラー smFRET 実験ではすべての蛍光強度の組み合わせから計算されます。しかし、ここで状態の識別、分離、マルチカラー smFRET が不可欠である、運動のモデルの抽出に着目します。三角形分割による構造決定「のみ」が必要な場合、高い信号対雑音比の単純な 2 色 smFRET 実験セットは実行12,19にできます。

部分的な蛍光を用いて (figure-introduction-1) 2 つの同時7間のエネルギー移動のためのプロキシとして。PFは、2 色実験の FRET 効率に類似した蛍光強度から計算されます。

figure-introduction-2

ここで、figure-introduction-3カラー exと励起後放出チャネルemの強度は、 cが最も長い波長を持つ受容体です。検出チャンネルは、試料室が蛍光ライトのスペクトル範囲が異なるレコードの同じ位置を表しています。励起と放射の同じ識別子はこのプロトコルで使用される (すなわち、 「青」、「緑」と"red")。

実験的欠点のため測定された蛍光強度はエネルギー転送のみならず、fluorophore およびセットアップ プロパティにも依存します。2 フルオロ間真のエネルギー伝達効率を得るために修正する測定強度があります。次の手順は、参照9に基づいています。明らかな漏れ (lk、すなわち、別の染料のため指定されたチャネルの蛍光体からの光子検出) の明白なガンマ補正係数 (ag、すなわち色素の蛍光量子収率とチャネルの検出効率) 表示するイベントを漂白アクセプター分子トレースから取得されます。

すべての可能な受容体チャネルにドナー色素の漏出、アクセプター色素漂白しますが、ドナーはまだ蛍光記録された蛍光トレース内のすべてのデータ ポイントから計算されます (figure-introduction-4)。

figure-introduction-5

漏れヒストグラムの中央値は明らかな漏洩ファクターとして使用されます。漏れの訂正後、明白なガンマ係数はトレースの同じセットによって決定されます。それはアクセプター色素の漂白時にドナーのチャネルで蛍光の変化による受容体チャネルの蛍光の変化を割ることによって計算されます。

figure-introduction-6

場所c再び、最長波長を持つ受容体の検出チャンネルです。結果の分布の中央値は、明らかな補正係数として使用されます。

各チャンネルで修正された強度は、によって得られます。

figure-introduction-7

PFによると計算されます。

figure-introduction-8

別の集団は、 PFs 多次元空間で分離できます。位置と各状態の幅は、継ぎ手の多次元ガウス関数とデータによって決まります。すべてPFトレースに基づく 1 つのグローバルな HMM の後続の最適化は、観測された挙動の定量的な説明を提供します。率の小さな変更は検出です。

Hmm は、騒々しい時間トレースの収集から状態モデルを推定する方法を提供します。システムは、任意の時点と実際の観測 (すなわち、排出量) で隠された状態はこの隠し状態20の確率関数、離散のセットのいずれかにすると見なされます。観察 smFRET データの場合、放出確率bは私の状態は私あたりは連続ガウス確率密度関数でモデル化できます。定期的に間隔をあけられた離散時間ポイントでから 1 つ別の状態への遷移、時不変であり現在の状態にだけ依存する遷移確率によると発生します。遷移行列Aでは、これらの遷移確率ijをすべて非表示のステート間を含まれています。初期状態分布figure-introduction-9状態固有の確率を与えるfigure-introduction-10時間トレースの最初の時間の点。最大尤度アプローチを使用して、これらのパラメーターは最高前後バウム ウェルチ アルゴリズム20,21とデータを記述するために最適化できます。最尤推定 (MLE) が得られます。最後に、最も可能性の高い観察の軌道を生成状態シーケンスはビタビ アルゴリズムで推測できます。HMM、単なる「平滑化」のデータが必要とせずデータ セットから抽出運動の状態モデルのドウェル時間を嵌合するための smFRET データ24,25,26の他の HMM 解析と対照をなして使わないヒストグラム27。HMM 解析は、Igor Pro を使用してスクリプトを内部で行われます。コードの実装は、参照21に基づいています。我々 は次のセクション 5 および 6 はこのプロトコル (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) のために当社ホームページのソフトウェア キットと模範的なデータを提供します。完全なソフトウェアは、リクエストを承ります。

時間でPFを使用してデータ ポイント <-1 またはPF > 任意の検出チャンネルで 2 がすべての州 (10-200) の発生が少ない確率を割り当てられます。これは、これらのデータ ポイントで人工の遷移を防ぎます。

放出確率のパラメーターは、手順 5.7 ガウス関数による 3 D PFヒストグラムのフィットから取得されます。これらのパラメーターは、HMM の最適化中に固定されます。

提示されたアプローチで初期状態分布ベクトルと遷移行列が、トレースの全体のアンサンブルを記述するグローバルに使用されます。参照27に従って、データ セットからのすべてのN分子に基づいて更新されます。

初期状態の配布の開始パラメーターはPFヒストグラム (ステップ 5.3) の投影から決定され、遷移確率に設定されて 0.05 確率を除いて同じ状態に滞在するそのような物選ばれました。特定の状態のままにする確率を団結を正規化します。

プロファイル尤は、すべて移行率21,22不確実性の意味のある見積もりとなるための信頼区間 (Ci) を与えるためです。特定のレートの CI の境界を計算するための関心の遷移確率は尤以外の値に固定されています。これにより、テスト モデル λ'。尤度の尤度比 (LR) 検定figure-introduction-11によると特定のデータ セット0が実行されます。

figure-introduction-12

バインド パラメーターはLR 3.841、 2xの 95% の変位値を超えたときに 95% の信頼-1 自由度22,23配布。

Hsp90 を使用してメソッドの力を発揮します。この豊富なタンパク質は、細菌と真核生物で発見され、細胞ストレス応答28の一部です。がん治療29で有望な薬剤標的であります。Hsp90 は各サブユニットの30の N 末端ドメインの 1 つのヌクレオチド結合ポケットのホモです。それは、少なくとも 2 つのグローバル異なるコンフォメーション、閉鎖の 1 つと 1 つ N ターミナル オープン、V 字構造19,31,32間の遷移を受けることができます。二量体の性質は直接 Hsp90 2 つのヌクレオチド結合部位間の相互作用の問題を発生させます。

以下では、データ集録および酵母 Hsp90 とヌクレオチドの 3色 smFRET 実験の解析の手順プロトコルを提供します。蛍光に分類されたアンプ PNP のコンホメーション依存的結合 (AMP-PNP *、非加水分解性 ATP アナログ) が分析します。記述されていたプロシージャのアプリケーション研究ヌクレオチド結合のと同時に Hsp90 のコンフォメーション変化が許認可により Hsp90 の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を明らかにします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. セットアップおよび前提条件

  1. プリズム型観察で多色 smFRET 測定を実行します。2 色の設定の説明ゼウス パブリケーションが与えられると12を参照します。
    1. マルチカラー観察を構築します。一般的なレイアウトは、 9の詳細です。
    2. 切替可能な使用、ダイオード励起固体の連続波レーザーは、励起パスでメカニカル シャッターの使用を不要なレンダリングします。
    3. 目的を入力する背面側から励起光の裏面の反射を防止する非対称、細長いプリズムを採用してください。
    4. 自動蛍光と収差、画像の中心から外れた領域の歪みなどを防ぎ、できるだけ多くの光を収集する検出パスに 2 インチ非球面色消し石英レンズを使用します。
    5. 別のレンズを持つ EMCCD のチップに焦点を各検出パス。これにより、各検出チャネルの最適な中心します。
      注意:クラス 3B レーザーは、観察で使用されます。これは、彼らが危険な目は直接、公開されるが、拡散反射光は有害ではない場合を意味します。システムを操作する前にレーザーの遵守を地方自治体の条例によると安全上の注意を確認します。
  2. あらかじめ dsDNA のサンプルを使用してセットアップと fluorophore プロパティの補正係数を決定します。
    1. 最長の励起波長を持つ受容体との組み合わせで各染料の 1 つ高フレット dsDNA サンプルを使用 (提示のセットアップ: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N)。DNA は、ビオチンとさらに変更されることを確認します。
    2. 5 サンプルを希釈 nM TNM バッファー (5 mM Tris pH 7.5、5 mM の NaCl、20 mM MgCl2) と 2 mM トロロックス (このバッファーに測定も使用)。
    3. Hsp90 の 2.5 と 2.7 の手順で説明するように、dsDNA を固定します。
    4. 明らかな漏れ (lk) およびアクセプター漂白イベントを示す分子の痕跡から明らかなガンマ (ag) の補正係数を計算します。
  3. ペグ/ビオチン ・ ペッグ パッシベーションされた石英スライドのサンドイッチの流れ区域、側面とカバー スリップの両方に接着剤を薄いフィルムを構築します。詳細プロトコル石英のクリーニングのためのスライドとパッシベーション参照9を参照してください。
    1. 使用厚 (3 mm) 水晶は石英グリセロール水晶プリズムと機能性石英スライド界面散乱レーザー光の収集を防ぐ幾何学的にスライドします。
    2. 薄いの (40 μ m) を使用して、非接着剤側に接着剤を散布、フィルム シールします。薄膜では、表面接続型分子と目的との間の距離を短縮します。80 ° C に加熱し押します。
    3. カバー スリップ上の場所。80 ° C に加熱し押します。プリズム上流れ区域を配置するときは、グリセロールのドロップを使用します。
      注: プリズム、石英スライド、グリセロールの材料、屈折率整合します。
  4. D61 または Q385 位置 2 つ単一システイン ポイント突然変異体の形態の酵母から Hsp90 を表現します。分からなかった濃度で二量体の解離を防ぐために C ターミナル コイルド コイル モチーフを追加します。別に突然変異体蛋白質のラベルし、するアミノ酸位置 61 Atto488 とアミノ酸位置 3859時 Atto550 ラベルを取得するモノマーを交換します。

2. 測定

  1. カメラのソフトウェアを起動し、以下に指定した画像のパラメーターを設定します。
    1. 暗電流ノイズを減らすため、できるだけ (外部の水冷却を用いる-95 ° C) 低冷却センサーの温度を設定します。
    2. 単一分子の録音のために最適化されたカメラの設定を使用: 3.3 μ 秒垂直シフト速度、通常垂直クロック電圧利得 17 MHz 16 ビット水平読み出し、中古増幅利得 3、電子増倍 1,000。
    3. 750 の取得サイクルの長さに「外部」を獲得、露光時間は 70 さん記録映画のトリガーを設定します。
      注: は、EMCCD センサーの飽和を防ぐためにカメラを取得する場合部屋の光をオフに。
  2. 測定のためのローカルの SSD にフォルダーを作成します。ソフトウェアの設定は、< 自動保存 > ライダーに行く < 自動保存 > を有効にしてムービー獲得のためファイル形式に「Tiff」を選択。自動保存場所として SSD 上のフォルダーを選択します。
  3. 検出パス、およびカメラのシャッター コントロール音響光学波長可変フィルター (AOTF)、レーザーの動作を制御するソフトウェア、レーザー、AOTF、同期トリガー ソフトウェア ソフトウェアを開始します。(Ca. 3 mW、プリズムに入る前に) AOTF を用いたレーザー パワーを調整し、適切なトリガー パターンをロードします。
  4. プリズムと流れ区域サンプル ホルダーをマウント、チューブを接続、遠心カップでインレット チューブを配置し、アウトレット チューブをシリンジ ポンプに接続します。チャンバー内に約 150 μ L バッファーをフラッシュでは、励起を合わせ梁、およびフォーカス。約 10 のレーザー パワーとスライドの完全な検出範囲に沿ってゆっくりと移動することによって表面に蛍光汚染物を漂白剤すべてレーザー用 mW。これに約 1 時間かかります。
    注: それ以外の場合記載されていない場合、使用されるバッファーが含まれています 40 mM HEPES pH 7.5、KCl、150 mM と 10 mM MgCl2。
  5. 商工会議所に NeutrAvidin ソリューション (バッファーに 0.25 mg/mL) の約 300 μ L をフラッシュし、商工会議所を通じて BSA 溶液 (バッファーで 0.5 mg/mL) の 1 分バッファーとフラッシュの約 300 μ L で非連結 NeutrAvidin 洗い流す間インキュベートします。
    注: このブロックの残りの表面機能化は、表面に BSA の非特異的吸着による欠陥します。
  6. ビオチン標識の約 150 μ L での流れ区域を読み込むことによってサンプルを固定し、(希釈バッファー + 0.5 mg/mL BSA) 上昇濃度で Hsp90 をラベル濃度の場合では通常十分な表面密度に到達するまで5-22。約 300 μ L バッファー + 0.5 mg/mL BSA 自由な蛋白質を洗浄します。
  7. 25 の 150 μ L にフラッシュ AMP-PNP nM * バッファー + 0.5 mg/mL BSA。それは 5 分間インキュベートし、正しい塩基濃度を確保するため一度このステップを繰り返してみましょう。
    注意: 追加、ラベルのない AMP-PNP 存在下での実験用追加 250 μ M AMP-PNP。
  8. データ集録を開始します。データの適切な量の約 1.5 時間がかかる約 20 の映画を取得します。
    1. ビューのフィールドを変更するピエゾ ステッピングと励起光に垂直な試料室の位置を移動します。
    2. 必要な場合は、目的の高さを制御する z ピエゾとフォーカスを調整します。これ必要ないはずなく傾斜測定チャンバーがマウントされたときにあまりにも頻繁です。
    3. < を取る信号 > を押すとカメラのソフトウェアのカメラの記録を準備し、トリガー ソフトウェアで < スタート >] ボタンを使用して励起/集録サイクルを開始します。これは蛍光強度の集録を開始します。
  9. チャネルの登録を実行するには、最初のセットアップのすべての検出チャンネルのスペクトル範囲の蛍光性の放出を示す蛍光ビーズと一緒に映画を記録します。明るいスポットを検索して校正映画でビードの位置を検出し、ガウス分布から中央位置合わせ強度プロファイルを決定します。すべてのチャンネルである、x のと度 3 つ9の 2次元多項式と y 方向の両方のマッピングのオフセットに合わせてビーズの座標を保存します。

3. 単一分子のトレースの選択

  1. データ分析は、Igor Pro を使用してスクリプトを内部で行われます。"IniTIRF.ipf"を開くことによってすべての必要なスクリプトをロードし、実験の適切な型を選択します。
    注: 以下では、<] ボタン > メニューまたはユーザー インターフェイスのクリック可能な要素を指定します。関数呼び出しは、引用符、例えば、 「印刷「こんにちは世界」」で示されます。これらのコマンドは、(それを囲む引用符) Igor Pro のコマンドラインに貼り付けることができます。
  2. 検出チャンネル登録パラメーターが読み込まれていることを確認します。
  3. クリックして GUI を開始 < 新しい smFRET |GUI の分析 >。
  4. それぞれのチャンネルの強度を保持する (すなわち512 × 512 ピクセル 16 ビット TIFF スタックとして格納されますとフレームのシーケンス) のムービーをロードします。< ロード フィルム > ボタンを押すと他の後いわゆる「マスター」と「スレーブ」カメラの 1 つからファイルを選択することによってこれを行います。
  5. 特定のチャネルの検出の最初の 5 フレームの合計の最も明るい部分を捜すことによって潜在的な分子の位置を識別します。チャンネル マッピングからの他のすべての検出チャンネルに対応する位置を計算します。蛍光強度のトレースを取得するには、各フレームの中央の位置の周囲ピクセルの正方形の強さを合計します。GUI で < 検索トレース > ボタンを押すことによってこれを行います。
    注: (ピクセル) の正方形の側面の長さによって与えられる: 2 * < 合計 Pxs > + 1。
  6. 各分子の励起同色の場所のすべてのトレースの合計として共同生強度トレースを計算します。次の条件のすべてのチャンネルで分子の強度プロファイルを評価します。
    1. 共同生強度と単一漂白でほぼ平らな台地がすべて励起色、適切な検出チャンネルで anticorrelated 現象は、赤い蛍光性の検出のステップ (バインドされたアンプ PNP にフレットを示す *) 以内に、トレース、および 2 アンプ PNP の存在を示す赤い蛍光性のない複数のステップ * 1 つの Hsp90 ダイマーにバインドします。
  7. これらの条件が満たされている場合は、さらなる分析のためのスポットの蛍光トレースを保存します。カーソルのトレースを選択して「タイムライン」グラフの < 保存 >] ボタンを押すことによってこれを行います。青い映画あたり約 200 分子励起後 3 つの検出チャンネル強度トレースを手動で検査します。

4. 部分的な蛍光の計算トレースします。

  1. 保存された分子の 1 つのためのすべての蛍光強度トレースを表示します。グラフでカーソルを使用すると、時間範囲を選択します。
  2. すべて fluorophores が既に漂白されている時間間隔を選択します。平均背景強度は、この範囲から計算され、各チャンネルの輝度トレースから減算します。< 背景 >] ボタンを押すことによってこれを行います。
  3. とも染料が Hsp90 に添付 FRET 効率範囲を選択 (Atto488 と Atto550) があります。点滅のイベントを含むトレースを除外するを確認してください (図 3B参照)。これらのイベントは、他のチャネルに伴う増加なしの 1 つのチャネルでドロップイン蛍光強度が特徴です。
  4. PFトレースを計算します。< PF Calc >] ボタンを押すことによってこれを行います。明らかな漏れ (lk) および明白なガンマ (ag) の定義済み補正係数は、光物理の修正するために生の強度に適用されるセットアップ プロパティと。

5. 人口の選択および 3 D ヒストグラムの当てはめ

  1. PFトレースで低信号対雑音比を示す分子を削除します。間隔を超える [-1; 2] 任意のPFのトレースでフレームの 10% 以上の分子は、データ セットから削除されます。これを行うには、コマンド ウィンドウから"RemoveTracesLowSNR()"を実行します。
  2. PFデータのビン分割投影を計算します。プロットfigure-protocol-1をfigure-protocol-2とfigure-protocol-3をfigure-protocol-4100 × 100 箱の解像度を持つ範囲 [-0.5; 1.5]。これを行うには、次のコマンドを実行します。
    1. "HistFret2D (「r_b」、"r_g"binHist = 100)」
    2. "HistFret2D (「r_b」、"g_b"、binHist = 100);MoveWindow 553.5、42.5、1055.25、508.25」
  3. 各区別、投影州の相対的な人口を決定します。
    1. 適切なグラフを前面に移動し、"panelHist2DCount()"を実行します。
    2. < Init > ボタンを押すし、ピークの周り無料手多角形を描きます。
    3. [< カウント >] ボタンをクリックします。多角形のデータ ポイントの数と投影のデータ ポイントの合計数は、コマンド ウィンドウに出力されます。
  4. 実行してPFデータの 3次元ヒストグラムを準備"HistFret3D ("g_b、""r_b"、「r_g」)」。
  5. 1 の整数を 3 D ヒストグラムを正規化します。次のコマンドを実行します。
    1. 「NewDataFolder/S fit0」
    2. 「重複/O:: フレット: Hist3D、Hist3D」
    3. "可変/G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^3」
    4. 「Hist3D = div;/印刷部"
  6. 3 D ガウスの初期パラメーターに合わせて、必要なデータ構造を準備を提供します。
    1. "Gauss3D_initParam(); を実行します。"W_coef_old を編集します。
    2. 状態の人口をパラメーターのベクターの末尾に追加します。
    3. "Gauss3D_prepareFit()"を実行します。
      注:W_coef_old は、フィットの初期パラメーターを保持するベクトルです。つまり、状態ごとfigure-protocol-5と同州の人口は、ベクターの末尾に連結します。共分散マトリックスは対称であることを確認します。
  7. S区別できる状態の数をされていると 3 D のPFヒストグラムとS 3 D ガウス関数の和に合います。
    1. "Do3D()"を実行します。これは初期パラメーターの品質に応じて通常のオフィスの PC で 1 時間以上かかることがあります。
    2. "PostprocessFitMultiGauss3D(); を実行します。evalFitMultiGauss3D();"W_coef を編集します。
  8. フィットの結果を表示します。2 2D プロジェクションのそれぞれに対して、次のコマンドを使用します。
    1. 「contourPF3D_new(0)。contourPF3D_new(1);contourPF3D_new(2);contourPF3D_new(3);contourPF3D_new(4)」
    2. "contourPF3D_colorize()"

6. 動態解析 3 D アンサンブルうーん

  1. アンサンブル HMM 運動情報を抽出するために実行を準備します。1 つの HMM は、データ セット内のすべての分子から最適です。前の手順で取得した情報を使用して、3 D のPF空間の位置と各状態の幅を定義します。
    1. HMM のユーザー インターフェイスを初期化 (< HMM |Init うーん >) 状態の適切な数を選択 (Hsp90 データの場合、これは < NumStates > を意味 = 5)、入力信号の次元の数 (< NumDims > = 3)、および入力の種類 (< 入力 > =「フレット 3 D bgr」)。
  2. HMM の尤度が収束ソフトウェアをさせることにより、HMM のパラメーターを最適化 (実行"prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1)、-14)」) 前のイテレーションと比較して遷移行列の変更 (10-14 しきい値を下回るまで各遷移確率の絶対変更の合計)。これは、通常のオフィスの PC に約 1 時間の遷移確率の MLE を得られます。
  3. データ (例えば、データ セット全体の 75%) のサブセットの人口の選択、ガウス継手と HMM 最適化を繰り返します。さまざまな実験から完全なデータ セットがマージされた場合、また各単一の実験の最適化を繰り返します。サブセットの解析マニュアルの人口の選択、データ セット内のばらつきの不確かさを推定することができます。
  4. データ セットの不均一性と HMM の精度について報告する遷移確率の CI を計算します。
    1. 「Cd $(ルート: path3Dimport +"うーん"); を実行して CI 境界の大まかな推定値を得るloop_getCI_estimate_limits()."
    2. 実行することにより、CI の正確な制限値を計算します。
    3. "loop_getCI_HMM_converge(1)"
    4. "CIresults_conv_new()"
    5. 「cd:: HMM_CIresult;reportCI_conv()」
    6. 「cd:: cmp_CI_conv;CI_plot2 (「うーん」、doAppend = 0)"
  5. 解釈を簡素化する運動情報を凝縮します。
    1. 標識ヌクレオチド Hsp90 にバインドされたまま時刻に関する情報を収集します。崩壊アンプ PNP にバインドされている状態でこれを行う * (すなわちS1S2 S3、また図 2を参照)、ドエル時間ヒストグラムをコンパイルします。「Cd $(ルート: path3Dimport +"うーん"); を実行します。collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0})」、S0と S4 S1、2S、S3の状態を組み合わせたの宿る。
    2. 関心の各状態のビタビ復号のパスから滞留時間を抽出し、異なる実験条件の結果のドエル時間ヒストグラムを比較します。「Plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)」を実行します。
    3. 詳細な画像を個別にPFが容易、さらにデータ分析、例えば、ラベル付き Hsp90 とヌクレオチド、状態 S2 S と 3 色の実験の場合と機能的に同じ状態を折りたたむ3を折りたたむことができます。"Collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})"を実行します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マルチカラー smFRET 測定は、2 つ以上の異なる相互作用部位との相関の直接検出を許可します。これは蛋白質の複合体などの多成分システムを検討するユニークな技術をレンダリングします。具体例として 3 色 smFRET 実験がここでは、プレゼンテーションに着目します。

図 1にメソッドの一般的なワークフローを示します。最初の部分には、プリズム式全反射顕微鏡にマルチカラーの smFRET データの記録が装備されています。付着戦略とセットアップの回路図は、図 2 aに描かれています。セットアップの詳細な説明、9を参照を参照してください。提示されたメソッドの 2 番目の部分は、データの分析に焦点を当てください。図 2 bには、模範的な...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

複雑なタンパク質系のこれらの測定値の分析の手順を追って説明 3色 smFRET データを取得する実験を紹介します。このアプローチでは、直接複数の相互作用部位や構造変化との相関を評価するユニークな可能性を提供しています。

タンパク質の適切なマルチカラー分子データを得るために低ノイズ レベルで再現可能な測定を行うことが重要です。これは、フロー商工会議所9効率的かつ信頼性の高い表面不活性化プロトコルを使用して実現できます。表面に固定化された分子の十分な密度は分子記録映画あたりの収量を高めるために使わなければなりません。これは、光の単一分子からの蛍光が記録されたイメージのピクセルの約 5-10% に当たるべきことを意味します。同時にオーバー ロードしないようにする、隣接する分子の重複になりますので。ラベルの付いた種がソリューションで無料 (AMP-PNP * 提示における)、濃度が低く、短い波長をもつレーザーから直接励起による測定に干渉されていないかどうかを確認 (すなわち、通常、マイクロモル以下も濃度)。また、これらの化合...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、ドイツ研究振興協会 (INST 39/969-1) し ERC 助成契約 n. 681891 を通じて欧州研究評議会によって資金を供給します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Setup
振動減衰光学テーブル  米国カリフォルニア州アーバイン市ニューポートRS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1196625
レーザー制御ユニットCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1234465Scientific Remote
非球面望遠鏡レンズThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAd=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1AHF analysentechnik AG, Tübingen,ドイツ ZET 473/10クリーンアップフィルター励起
CF ex2AHF analysentechnik AG, Tübingen,ドイツ ZET 532/10クリーンアップフィルター励起
CF ex3AHF analysentechnik AG, Tübingen,Germany ZET 594/10クリーンアップフィルター励起
CF ex4Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAFL635-10クリーンアップフィルター励起
DM ex1AHF analysentechnik AG, Tübingen, ドイツZQ594RDCダイクロイックミラー励起
DM ex2AHF analysentechnik AG, Tübingen、ドイツ570DCXRダイクロイックミラー励起
DM ex3AHF analysentechnik AG、Tübingen, GermanyZQ491RDCダイクロイックミラー励起
AOTFnC-VisAA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plateThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAAQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100xNikon Instruments Inc, Melville, NY, USAhigh-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAPpiezosystem jena GmbH, Jena,ドイツピエゾコントローラー NV 40/1 CLE
ピエゾステッパーニューポート、アーバイン、カリフォルニア州、米国PZA12PZC200-KT NanoPZ アクチュエータキット
アクロマティック非球面レンズQioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, GermanyG322-304-000d=50mm, f=200mm
adjustable optical slitOwis GmbH, Staufen i. Br., Germany27.160.1212max. aperture 12 x 12 mm
DM det1AHF analysentechnik AG, Tübingen, ドイツT 600 LPXRダイクロイックミラー検出
DM det2AHF analysentechnik AG, Tüビンゲン、ドイツH 560 LPXR スーパーフラットダイクロイック ミラー検出
DM det3AHF analysentechnik AG、Tüビンゲン、ドイツHC BS R635ダイクロイックミラー検出
BP det1AHF analysentechnik AG、Tübingen, ドイツ525/40 BrightLine HCバンドパス フィルター検出
BP det2AHF analysentechnik AG, Tübingen, ドイツ586/20 BrightLine HCバンドパス フィルター検出
BP det3AHF analysentechnik AG, Tübingen, ドイツ631/36 BrightLine HCバンドパス フィルター検出
BP det4AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany700/75 ET Bandpassbandpass filter detection
optical shutters detectionVincent Associates, Rochester, NY, USAUniblitz VS25S2T0 
EMCCD iXon Ultra 897Andor Technology Ltd、ベルファスト、北アイルランド
デジタルI / Oカード、PCIe-6535National Instruments、テキサス州オースティン、米国
リンジポンプハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン、米国PHD22 / 2000
名前会社カタログ番号Comments
Flow chamber
quartz slidesG. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USASpectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany1626W10 x 12cm
spray adhesive3M Deutschland GmbH, Neuss, Germanyフォトマウント 050777
グリセロールCarl Zeiss AG, Oberkochen, GermanyImmersol G
immersion oilOLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, GermanyIMMOIL-F30CC
prismVogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, GermanySuprasil1
アルミプリズムホルダー特注の中
空止めネジThorlabs Inc、ニュートン、ニュージャージー、米国、カスタムドリル
Tygon S3 E-3603チューブneoLab Migge GmbH、ハイデルベルク、ドイツ2-4450
ACF00001 PTFEチューブBohlender GmbH、Grünsfeld、ドイツS1810-08
名前会社カタログ番号コメント
Sample
yeast Hsp90 D61C、Q385C_biotinUniProt ID P02829
Atto488のマレイミド誘導体、Atto550ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP*Jena Bioscience, Jena, Germanyγ-[(6-アミノヘキシル)-イミド]-AMP-PNP-Atto647N
FluospheresThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAF8764amine-modified, 0.2 μm, 黄緑色の蛍光
名前会社カタログ番号コメント
strongSoftware
AndorSolis Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Irelandversion 4.30
LabVIEWNationalInstruments, Austin, Texas, USAversion 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control softwareAA Opto-Electronic, Orsay, Franceversion 2.03a
Coherent ConnectionCoherent Inc, Santa Clara, CA, USAversion 3
IgorPro WaveMetrics Inc, Portland, OR, USAversion 6.37
シ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
  5. Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
  6. Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
  7. Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
  8. Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192(2014).
  9. Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
  10. Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
  11. Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
  12. Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782(2017).
  13. Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
  14. Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
  15. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  16. Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
  17. Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  18. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
  19. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
  20. Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
  21. Fink, G. A. Markov Models for Pattern Recognition. , Springer London. London. (2014).
  22. Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
  23. Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
  24. McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
  25. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  26. Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024(2012).
  27. Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
  28. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
  29. Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
  30. Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
  31. Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
  32. Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
  33. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  34. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  35. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  36. Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
  37. Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
  38. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  39. Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  40. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

3 smFRET TIRF Hsp90

関連記事