方法論記事

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

DOI：

10.3791/56901

⸱

2018年1月26日

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

この記事について

サマリー

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例として枯草菌を使用して個々 の細菌細胞系譜のマイクロ流体解析手法を提案します。メソッドは、しっかりと制御し、均一な生育条件下で細胞世代の何百もの観察を許可することで微生物学の伝統的な分析手法の欠点を克服します。

要約

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マイクロ流体技術は、微生物学の伝統的な分析手法を制限の多くを克服します。単一セルの解像度との世代の数百に及ぶ時間長い観察併設して大量培養方法とは異なりアガロース パッドを用いた顕微鏡とは異なり厳密に管理することができる均一な生育条件があります。成長媒体の連続的な流れを分離細胞の増殖と代謝、増殖への応答と遺伝子発現の本格的な変化によって引き起こされるローカル化学環境で予測不可能な変化からマイクロ流体デバイスの細胞をから特定の刺激より自信を持って観察できます。枯草を使用ここでは「マザーマシン」を示すモデルの菌種として-細胞解析法を入力します。構築しマイクロ流体デバイスを垂直、細胞でそれをロード、顕微鏡イメージングを開始、1 つの成長媒体から別に切り替えることによって刺激する細胞を公開する方法を示します。ストレス応答の記者は、このメソッドによって得られるデータの種類を明らかにするための例として使用されます。我々 も簡単にさらに実験、細菌の胞子形成の分析などの他の種類のこのメソッドのアプリケーションを議論します。

概要

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地球上の生命の最も顕著な特徴の 1 つは、偉大な回復力と様々 な。分子生物学の中心的な目標は、細胞の遺伝子そして蛋白質を最大限に使用彼らの成長とさまざまな環境条件下でフィットネス ロジックを理解します。この目標を達成するために科学者が、自信を持ってを確認できる必要がありますどのように個々 の細胞は、成長、分類し、特定の条件セットの下で彼らの遺伝子を表現、細胞がその後の環境の変化に反応する方法注意すること。しかし、微生物学の従来の分析方法は対処できる質問の種類に影響を与える技術的な限界にあります。たとえば、一括文化に基づく分析は長年にわたって非常に有用されているまだ意味のある細胞に変化または総人口の細胞の小さいサブ集団の行動を隠すことができる人口レベルのデータのみを提供します。光顕的観察に基づく生きた細菌の単一細胞解析は単一細胞の挙動を明らかにするも技術的に限られています。細菌成長培地を含む agarose パッドに固定されている通常細胞の成長と分裂の群衆ミクロな視点、、観測時刻1を実質的に制限するちょうど少数の細胞周期後利用できる栄養素を使い果たす 2。さらに、ローカル栄養素の枯渇と細胞増殖による代謝副産物の併用の蓄積は常に測定や予測が難しい方法でローカル セル成長環境を変化します。アガロースのパッドを使用してこのような環境変化の定常状態の動作または成長条件3の特定の....

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プロトコル

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1. PDMS 装置鋳造

  1. 埃のない環境で PDMS ポリマーと 10:1 の比率で硬化剤を混ぜるし、ドガの少なくとも 10 分のための真空の下で。
  2. ポリスチレン ペトリ板に切れ目のないアルミ箔の部分にシリコン マスター (またはのエポキシまたはポリウレタン レプリカ) を配置します。表面の泡を破るに空気の穏やかな流れの深さの約 5 mm. ドガ ペトリ プレートで少なくとも 10 分間使用するマスター シェイプの上脱 PDMS 混合物を注ぐ。
    注: 使用する 2 層デバイスの寸法に表示される付随 CAD ファイル5 (補足のファイル 1を参照してください)。プラスチック製レプリカ マスターが脱ガス; 中のフロートの一部このような場合は、きれいなプラスチック アプリケーター付きレプリカを押し下げます。
  3. 60 ° C のオーブンで 1 時間、少なくとも PDMS を治すし、室温に冷却します。ペトリ プレートからマスターと硬化 PDMS を含むアルミ箔を削除します。マスターの後ろからアルミ箔を慎重に剥がし、慎重にマスターから PDMS の皮をむきます。
    注: また、PDMS が治るかもしれない一晩室温で。シリコン ・ ウェハ マスターの相対的な脆弱性エポキシ接着剤を使用して 1/16 インチのウエハーを恒久的に結合することで解決できます-ウェハと同じサイズの厚いアルミ ディスク。

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結果

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すべてまたはほぼすべてを含む 1 つまたは複数の細菌細胞 (マイクロ流体側チャンネルの読み込み、デバイス、マイクロ流体配管を取り付ける前に位相差顕微鏡により評価した成功の最初のセルと見なされる3 a を図)。各チャンネル内の複数のセルを表示する最適な読み込みが、チャンネルはそれにもかかわらず平衡期間 (図 3 b) 細胞の増殖により細胞を詰めます。貧しい人々 を読み込むで比較的車線数 (< 50%) チャンネルがセル搭載側は使用されるかもしれませんが、結果のデータ密度が少ないセル血統各画像の位置に描画されるため低くなります。

デバイスが読み込まれる最初、マイクロ流体配管を取り付けると、中を流れる比較的高い 35 μ L/分の流量でデバイスによって平衡です。平衡のステップでは、デバイスから供給チャネルの空気の泡や余分なセルを削除し.......

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ディスカッション

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このマイクロ プロトコルは柔軟性手順の多くは、特定の種やひずみ、あるいは特定の目的のための使用を最適化するために変更する場合があります。確かに、このプロトコルでは我々 は枯草と使用を最適化するために元の「マザーマシン」コンセプト4に変更を加えました。多くの場合、セルの限定トレンチはこのプロトコルでセルを囲む浅いチャネルと 2 層セル トレンチを使用に対し単一レイヤー機能を構成します。2 層の設計は特に長いに栄養素や枯草の細胞からの代謝物質のフラックスを最大にする方法として導入されました (> 75 μ m) トレンチ5;ただし、単一レイヤー機能しばしば最適な細胞の成長のために足りるし、一般的用途エシェリヒア属大腸菌、特に短い (〜 25 μ m)4のとき。主な供給チャネル5の中型の流れによってのトレンチから引き出されている枯草セル チェーンは、確率的に発生する、頻度が少なく、私.......

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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このプロジェクトは、GM018568 の下で健康の国民の協会によって賄われていた。このプロトコルで行われた一部中心ナノスケール システム (CNS)、メンバーの国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ ネットワーク (NNCI)、全米科学財団 NSF 賞第 1541959 の下でサポートされているの。中枢神経系は、ハーバード大学の一部です。多くのおかげでは、妊娠とここと装置の元のバージョンのビルドに示されるデバイスに使用されるマスター テンプレートを加工で自分の仕事のトーマス ・ ノーマンとネイサンの主原因です。また、ヨハン ・ アンデルセンと彼の貴重なコラボレーション アドバイスをありがとう、彼らのアドバイスや細菌マイクロ流体装置の継続的な改善の彼の研究室のメンバーに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning(240)4019862これはプロトコルではPDMSと呼ばれています。10:1の比率で混合された2つの成分
0.75mm生検パンチワールド精密機器504529
22×40mm No.1.5 カバーガラスVWR48393 172
プラズマエッチング PE-50プラズマエッチング株式会社PE-50酸素プラズマ処理を使用してPDMSをガラスに結合するために使用される機器
Tygonフレキシブルチューブ ID 0.02", OD 0.06"サンゴバンPPLコーポレーションAAD04103チューブの主要部分、例えば針に取り付けられる部分用
シリコーンチューブ、0.04インチ内径、0.085インチ 外径HelixMark 標準シリコーンチューブ60-795-05ピンチバルブおよびYジャンクション接続用
牛血清アルブミンSigma-AldrichA7906-100G不動態化剤として使用
ARTゲルピペットチップ(P200)Molecular BioProducts2155培地および細胞をデバイスにロードするための
Acrodisc 32-mmシリンジフィルター、5-μm Supor 膜ポール ライフサイエンス4560
21 ga の鈍い針、1 インチMcMaster-Carr75165A681
Y コネクタ、200 シリーズ バーブ、1/16 インチ ID チューブ、ポリプロピレンノードソンメディカル Y210-6005AKA Value Plastics Eclipse
Ti-E 倒立顕微鏡ニコンですこのユニットはメーカーによって製造中止になり、Ti 2 Eに置き換えられました。
LB LennoxSigma-AldrichL3022
Microfuge 18Beckman Coulter367160
Bacillus subtilis株 NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1野生型の親株は、このプロトコルで示されている実験で使用するために変更
されました 重力対流オーブンVWR414005-106PDMSを硬化させ、ベーキングするために組み立てられましたデバイス
スコッチ溶接エポキシキット3M2216 B / Aは、シリコンウェーハをアルミニウムバッキングプレート
スコッチマジックテープ、3/4インチ幅3MPDMSデバイスからほこりをきれいにし、視認性を高めるために機能の上に置くために(プロトコルで「オフィステープ」または「粘着テープ」と表示)
実体顕微鏡ニコンSMZ800N例としてここにリストされています。ほぼすべての実体顕微鏡は、
イソプロピルアルコールシグマアルドリッチW292907カバーガラスシ
リングポンプ、6チャンネルニューエラポンプシステム株式会社NE-1600
Kimwipes Kimberly-Clark34120ダストフリーワイプのブランド
があります をロードする前に培養をろ過します 同社は に接着するために使用することができますをきれいにするために行います。

参考文献

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  1. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  2. Young, J. W., et al.

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タグ

PDMS

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