方法論記事

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

DOI：

10.3791/57012

⸱

2018年4月20日

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1Department of Otorhinolaryngology, Johannes-Gutenberg University Medical Center, 2Department of Otorhinolaryngology, Technical University of Munich Medical Center, 3Department of Otorhinolaryngology, Ludwig-Maximilian-University Medical Center, 4Department of Otorhinolaryngology, University of Goettingen Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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療法の評価を目指して私たち頭頸部扁平上皮癌細胞株に対する実験的治療レジメンの現在の規格をテストすることができる回転楕円体に基づく、三次元の in vitroモデルの進化について述べる感受性と将来的に人体標本からの一次電池に抵抗。

要約

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進行・再発の頭頸部扁平上皮癌 (各種) に対する現在の治療法の選択肢は、放射線と化学療法放射線アプローチ手術の有無を囲みます。一方、プラチナ ベースの化学療法レジメンは現在効果の面でゴールド スタンダードを表し、ほとんどの場合、新しい化学療法レジメンは、すなわち免疫療法が浮上しています。しかし、奏効率と化学療法の治療抵抗性機構を予測し、理解が不十分なままにするは難しい。化学療法と放射線耐性機構の広範なバリエーションは、日付に知られています。この調査は記述するパーソナライズされた腫瘍の将来のツールとして個々 の患者からの各種セル行の応答様々 な治療レジメンとうまくいけば初代培養細胞を評価するために標準化された、高スループットの in vitroアッセイの開発療法。アッセイは、三次医療センターでの各種患者のため品質管理の標準のアルゴリズムに統合されているためただし、これは今後の研究の対象となります。技術的な実現可能性は、実際の患者から腫瘍生検から一次電池の有望に見えます。試料は、実験室に転送されます。生検は、酵素消化によって続いて機械的に分かれています。セル、三次元の回転楕円体の形をしたセルのコングロマリットの再現性、標準化、自発的な形成を促進する超低接着細胞文化バイアルに培養されます。回転楕円体は、放射線化学療法プロトコルと必要に応じて免疫療法プロトコルに公開する準備がされます。最終的な細胞生存率および回転楕円体サイズ療法感受性の指標をしたがって将来の患者の可能性が高い治療応答を評価するために考慮に引き込まれる可能性があります。このモデルは、頭頸部癌の個別化治療に向けた貴重なコスト効率の高いツールを使用できます。

概要

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頭頸部扁平上皮癌 (各種) は第 6 最も一般的な癌の過剰なニコチンやアルコールによって引き起こされるケースの大半の横にある、粘膜ヒトパピ ローマ ウイルス (HPV) 感染症関連病態の上昇率で世界消費1,2。進行期および再発の各種の治療と積極的な腫瘍浸潤によるやりがいのまま小さい腫瘍や前侵略的な段階は、通常、通常は頸部リンパ節郭清と組み合わせて、外科的切除も治療中転移と放射線と化学療法プロトコル3,4,5,6,7,8への抵抗。最近の研究は、細胞の表現型の高い変動と循環のサブ特性を示唆しているし、9,10播種性腫瘍細胞は始まったばかり。制服、固体腫瘍の以前の信念質量が過去の最近の研究に照らして修正されなければならなかった年11,12,13,14。腫瘍の特性とキーの突然変異の同定のための現在のアプローチは、治療抵抗と関連付けられるが、コストのかかるアプローチを維持するように見えるいくつかの遺伝子を識別できます。さらに、遺伝子型の知識では表現型とその治療応答の信頼性の高い予測が必ずしも許可しません。

進行期および再発性疾患の全体および無病生存率を向上させるいくつかの進歩がずっとあります。ニコチン-と同様ウイルス関連癌、手術以外にも現在の治療法の選択肢は、積極的な放射線とプラチナ ベースの化学療法レジメンを囲みます。HPV 陰性と陽性の癌; 間別反応率に影響があったしかし、これは未だ一般的な療法のガイドラインの変更をもたらします。プラチナ ベース化学療法だけでなく対象療法 (抗 EGFR; 広範な現象は、すべての腫瘍の段階あり、放射線や化学療法への抵抗表皮成長因子受容体)最近浮上してチェックポイント阻害15。効果が放射線と化学療法、嚥下障害、粘膜炎、口渇、とりわけ腎臓や心臓の機能の低下のリスクの観点から重要な患者の罹患率の高い費用で来る。療法前に応答を予測、個々 の患者のための一般的な治療概念の決定は、不必要な治療概念、副作用やコストを防ぐ重要な目標であるようです。

我々 は現在標準的な化学療法放射線という技術的な立場から定期的かつ品質制御腫瘍治療アルゴリズムに統合されることに対する個々 の患者の治療感受性をテストするモデルを確立しようとしました。遠い目標は、彼らは不完全にしか変動せず実際のひと腫瘍細胞を表せないし、不均一性我々 はプロトコルの確立中、今知っていると様々 な細胞で行われていた大きく変化と高齢者の細胞株を使用せずモデルを使用していた。市販の細胞からのみ独立するには、我々 最近正常に「異食症」と呼ばれる中間細胞ライン細胞から生成プライマリ各種人間腫瘍標本からその表面と限られた通路に保存された細胞マーカー16. このパイカ セルラインが腫瘍生検から新鮮なひと癌細胞の試験を後で次に道路上のモデルの開発のための準備として役立つべきであります。それは文化が異なる反応三次元細胞とより多く体内細胞を示されている-これらの単分子膜17,18,19,20 の増大よりも抗がん剤の投与に ,21, 主に渡り鳥の保全のため、特定の細胞のサブセットの22,23,の24のサブ分化特性。ここでは、中間細胞から回転楕円体に基づく、三次元モデルのプロトコルについて述べるし、そのようなモデル統合がん治療、頭頸部外科医と腫瘍内科医 (どのようにプライマリひと扁平上皮癌細胞と方法図 1)。

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プロトコル

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本稿では、すなわち、人間の腫瘍の標本の使用に示すようにすべての研究は、事前決定から大学医学のマインツ/大学ミュンヘン医療センター倫理委員会の同意の下に保護されています。患者は、その治療の過程で得られた余剰の生物材料の科学上の利用に同意すること国民の法的なガイドラインに従ってインフォームド・コンセントを与えています。研究は、人間の福祉のためすべての機関、国家および国際的ガイドラインに準拠して行われています。

1. 頭から一体扁平上皮癌腫瘍生検を取ってください。

  1. 一般 (プロポ フォールとセボフルラン、筋肉リラックス エージェント) または局所浸潤 (2 %ultracaine, アドレナリン) を実行/手術室や耳鼻咽喉科検査椅子 (キシロカイン) 麻酔を表面。標準的な機器を運用と上部消化器、呼吸器管部の口腔空洞/咽頭/喉頭/その他の腫瘍を可視化し、顕微鏡下で必要な場合。
  2. 鈍・切断器癌病変の周囲から新鮮な腫瘍生検を取る。この分野での豊富な壊死のため病変の中心は避けてください。等張の塩化ナトリウム溶液を滅菌した容器に得られた組織を置きます。
  3. 必要に応じて、例えば生検後止血を実行します。、バイポーラ、モノポーラ凝固装置血管収縮物質の使用に加えて。
  4. 隣接する研究所の管に直接培養システムを使用するため腫瘍生検の結果をもたらします。他の腫瘍生検をいつものように癌を除外する病理学者に送信します。
  5. 検査技師が標本を直接処理する準備ができていることを確認します。

2. 腫瘍標本の処理

  1. 適切な滅菌面上腫瘍標本を置き、可能な限り小さな作品に滅菌の単回使用メスを徹底的にカットします。
    注意: 感染症・血液媒介性疾患の状態はよくとり上げられるし、技術者は、標準機関の注目を防ぐためにプロトコル針棒または潜在的バイオハザード患者材料切断傷害を確認し、可能な傷害後に従うプロトコル。
  2. 主な組織を十分に機械的分離後、バイアル コラゲナーゼに組織を置く私/II、37 ° C で 1 時間インキュベート70 μ m ファルコン携帯こし器を通ってふるいし、ハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) と懸濁液を洗います。
  3. 正常な分離、その後洗濯後 5% CO2と 37 ° c. の温度でサブ confluency に成長する T75 の細胞培養フラスコ (75 cm2) に 1-2 × 106セルを含む懸濁液を場所します。この手順は、10 日間をかかる場合があります。
    1. 次から成る特別な表皮細胞培養培地を使用して: ダルベッコの 125 mL のケラチノ サイトの補完媒体 (補完中 500 mL ケラチノ サイト SF 媒体のウシの下垂体の 15 mg から成るの 250 mL イーグルス培地 (DMEM) を更新抽出 (BPE) ペニシリン/ストレプトマイシン、150 ng 組換えひと上皮成長因子 (EGF)、300 mm CaCl2516 μ L、前もって準備するストック ミックスの 2.5 mL)、F12 栄養組合せ、BPE (0.75 mL) 75 ng 組換えヒト EGF の 10 mg の 125 mL (2 μ L)、200 mM L-アラニル-L-ーゼ-ジペプチド (材料表) の 3.75 mL。

3. 超低接着細胞培養皿に細胞を播種

  1. 顕微鏡下で腫瘍細胞の増殖を確認します。培養細胞をカウント (プライマリまたは細胞培養) 5,000 原発腫瘍細胞や中間細胞ラインの 1,000-2,000 細胞を播くと、凹面、超低付着板にメディア (手順 3.2.) の 200-300 μ L で他の細胞ラインの丸いお尻 (96 ウェル)/。
  2. 1% 5% CO2等分 DMEM と気道上皮細胞用培地 (BEGM)、10% 牛胎児血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム 1%、1% 非本質的なアミノ酸、37 ° C での細胞の培養 L-グルタミン (ステップ 2.3)。セルの行を使用している場合、DMEM に基づいてメディアは十分です。
    1. 一日おきにメディアの変更を実行します。メディア変更時にピペットで回転楕円体を吸引しないように注意を払います。3.3 の天体に到達する (約 7-10 日) 成長のレベルまで、回転楕円体の文化.
  3. 三次元回転楕円体状の細胞集塊を探して顕微鏡下で自発スフェロイドの形成を確認します。不規則なおよび/またはさらなる調査から複数のスフェロイド形成と井戸を除外します。
    注: 回転楕円体が表示されます、肉眼でも、さらなる処理とメディアの変更を下記のとおりを促進します。

4. マルチ モーダル標準または実験的腫瘍治療する回転楕円体を公開します。

  1. 必要な療法を選択します。未処理の回転楕円体または楕円など、部分的な治療レジメンのみを受信するための治療法の比較を許可する十分な大きさのコントロール グループを設計します。放射線単独で。コントロール グループのサイズは、実験グループのデザインに依存し、普遍的に定義することはできません。
  2. 添加剤とメディアにメディア、化学療法および/または必要な濃度でモノクローナル抗体を意味メディアを交換します。2.5/5/10 μ M の 5 fluoruracil (5 fu) を 30 μ M の濃度でシスプラチンを追加します。
    注: 高スループット実験や大規模なグループのサイズ/グループの数は、1 つを使用できます自動分注ロボット、さらに実験を確立していきます。
  3. また、適当な放射線施設を用いた 2 Gy で回転楕円体と細胞培養皿を放射します。
    注意: は、従業員の有害な放射線被ばくの防止に関する機関のプロトコルを尊重します。電波防護指針に従って指定し、訓練を受けた技術者でのみ動作します。必要な場合は、化学療法に従って下 4.2 を追加します。その後。
  4. 前述の培養条件 (37 ° C, 3.2) で 24 時間のセルを孵化させなさい。
  5. 、孵化後一日おきにメディアの変更と、少なくとも 6 日間培養を続けます。

5. 回転楕円体サイズおよび細胞増殖アッセイ読出しを行なうのための範囲の評価

  1. 回転楕円体のサイズを測定後 6 日目のデジタル フォト ドキュメント領域の観点から (10 日目、16 日目) グラフィック ソフトウェア (パラメーター 1)。
  2. プレートの 2.5 分の 520 × g で遠心分離後、上清を削除します。1 × PBS と遠心分離機プレート再び前述のように、続いて清 (PBS) を削除するの十分な量の血球を洗浄します。
  3. 溶解する回転楕円体を許可する各バイアルに酵素細胞剥離液 100 μ L を追加します。37 ° C で 8 分板を孵化させなさい
  4. 成功した顕微鏡下で回転楕円体の溶解を確認します。DMEM の 100 μ L を追加します。520 x g で 2.5 分間削除でプレート上澄みを遠心し、DMEM の 100 μ L のセルを中断します。
  5. 25製造元の指示に従って各バイアルに例 8 WST アッセイで市販の測色的増殖アッセイを実行します。酵素免疫測定法 (ELISA) リーダー (パラメーター 2) 試金を読みます。

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結果

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再現性をもってハーゲマンらで説明するように新鮮な腫瘍生検から派生したひと癌細胞から後は、独自の PiCa セルの行を含む異なる細胞から最初単一細胞懸濁液から回転楕円体を生成することができました.26. 回転楕円体の生成の 2 つの確立された方法を行った。いわゆる吊りをされて 2 (HD) 法と超低付着性 (ULA) 法、後者がより効果的かつ安全な 1 つを削除します。高速回転楕円体の成長を含むの HD と比較して ULA 方法の利点は、プレート処理、重い振動 (の均一性の面でより再現性のある回転楕円体成長と回転楕円体の結果の損失の少ない問題を強調することができました図 2)。バイアルあたり複数回転楕円体の発生は、HD 方式の方が一般的だった。回転楕円体の形態のより明瞭な特性を調べた。キ67、異食症細胞から楕円体の増殖マーカーの染色、免疫を図 3に示します。文献に記載されている、回転楕円体は...

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ディスカッション

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細胞懸濁液、両方の細胞についての予備的実験、ひと腫瘍細胞から再現可能な回転楕円体を生成するプロトコルを確立することができました。まず上記 2 つの方法を評価し、ULA メソッド、制服の三次元回転楕円体の生成のより安全でより信頼性の高いものにする、超低接着面を有する培養皿は使用法を識別しました。アッセイ読み出し (サイズ/地域と細胞生存率) の 2 つの独立した方法を組み合わせることによって、このマルチ モーダル分析はグループ間の小さい相違を識別するために十分に敏感。これは、アッセイの三次医療センターでクリニカルパスへの統合後の技術的可能性の証拠への第一歩です。将来的には、(i) 一般的な最初または第 2-/3 rd ライン療法プロトコル (化学試薬、放射線) 個々 の腫瘍感受性を評価するために使用可能性があり、実験療法プロトコル、(ii) さらに新鮮な標本から腫瘍細胞の特徴治療反応する分子の表面や細胞質パターンを洗い出し。異なる腫瘍局在化、例えば、プライマリおよびリンパ節転移からの標本から回転楕円体が想像できます。

プロトコルと方法の確立、全体は、いくつかされて何...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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このプロジェクトは、ミュンヘン大学の助成金によって賄われていた (FöFoLe プロジェクト号: 789-781)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコス修飾イーグルスミディアム(DMEM)Biochrom、ベルリン、ドイツF 0425
Fetal wevine serumGibco Life Technologies、Paisley、UK10500-064
ペニシリン/ストレプトマイシンBiochrom、ベルリン、ドイツA2212
ピルビン酸ナトリウムBiochrom、ベルリン、ドイツL0473
非必須アミノ酸Biochrom, Berlin, GermanyK0293
L-GlutamineBiochrom, Berlin, GermanyK0293
LiberaseRoche Life Sciences, Basel, Switzerland5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay PlatformInSphero, Schlieren, SwitzerlandPB-CS 06-001
GravityTRAP plateInSphero, Schlieren, SwitzerlandPB-CS-01-001
超低接着(ULA)培養プレートCorning, Corning, NY, USA4520
airway epithelial cell growth mediumPromocell, Heidelberg, GermanyC-21060
amphotericin BBiochrom, Berlin, GermanyA 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mixPromocell, Heidelberg, GermanyC39165
WST-8 testPromocell, Heidelberg, GermanyPC PK-CA705-CK04
ケラチノサイト SFMedium + L-Glutamine 500mLInvitrogen#17005-034
ウシ下垂体抽出物 (BPE), 25mgInvitrogen#37000015
組換えヒト上皮成長因子 2.5 & マイクロ;gInvitrogen#37000015
DMEM High GlucoseInvitrogen#21068-028
ペニシリン ストレプトマイシン 10000U/mL ペニシリン/ 10000µg/mL StreptomycinInvitrogen#15140-122
F12 Nutrient MixInvitrogen#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)Invitrogen#35050087
HBSS (Ca, Mg)Life Technologies#14025-092(フェノールレッドなし)
1x TrypLE Expres EnzymeInvitrogen#12604-013(フェノールレッドなし)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)革新的な細胞技術Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainerBD Biosciences, USA#352350

参考文献

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