三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Summary

本研究は、リバーシブルの組織免疫染色、3 D レンダリングやひと胎盤絨毛サンプル 1-2 mm³程度の血管ネットワークの解析をクリアするためのプロトコルを示します。

Abstract

母と胎児間の栄養とガス交換に母体絨毛間血とひと胎盤の実質の多くを占める広大な絨毛の毛細血管網の界面で発生します。遠位の絨毛の毛細血管網は、臍帯から延びる血管の分岐の数世代後の胎児の血液供給の末端です。このネットワークは、それが継続的に浸されて母体血と胎児血液の混合を防ぐ栄養膜合胞体バリア層連続細胞鞘です。母体の糖尿病、高血圧、肥満などの疾患で発生する胎盤の毛細血管網の整合性への侮辱結果胎児、幼児、および大人のため、現在の深刻な健康リスクがあります。これらの侮辱の構造的な効果を定義するためのプロトコルは 1-2 mm³前記 1 つの完全な複雑さのトポロジカルな特徴を調べることができます順序毛細血管網構造をキャプチャするこの研究のため開発されました。これを達成するために胎盤から終末絨毛のクラスターは解剖、および栄養膜と毛細血管内皮細胞、カルビンディン抗体。これらのサンプルは、クリア処理 〜 1 mm の z 深さに共焦点画像のスタックを取得することが可能になる新しいティッシュで明らかにしました。これらのスタックの 3次元のレンダリングが処理し、分析し、このアプローチのための適合性の検証としてキャピラリー店舗・ キャピラリーのブランチ終了ポイント、ボリュームなど基本的な毛細血管網メジャーを生成します毛細血管網の特性。

Introduction

発展途上の胎盤とその病態の理解は、大規模な測定では隣接する絨毛と含まれている毛細血管に由来する組織学的セクション間の空間関係を推論する制限されます。この研究では、毛細血管のネットワーク機能 (例えば分岐、堅さ) の解析に適している人間の胎盤毛細血管網の三次元 (3 D) のレンダリングを生成するための手段を開発することによってこの問題に取り組んでまいりました。これを行うに、我々 は 2 つの商業組織クリア製品、Visikol 1、Visikol 2 (以下ソリューション 1 と解決策 2) 蛍光抗体染色を組み合わせています。

ひと胎盤血管母親の絨毛間血液と胎児間のインターフェイスに位置する広大な複合体であります。絨毛のプレートの挿入から延びる、臍帯は、動脈と精巧な血管網と絨毛の表面をカバーする枝分かれ静脈のネットワークに分岐します。その両端は、インテリアや胎盤のディスク数より分岐世代を経るし、終末絨毛で、含まれている毛細血管網、ガス、栄養素、交換サイト終了の場所の深さにダウン浸透と代謝胎児と母体血を無駄に。

開発中に胎盤の毛細血管網への侮辱は、胎児、新生児、創発大人^1,2,3の健康のため永続的な影響を持ちます。流産、子宮内胎児発育制限などの妊娠関連病態の観点から子癇前症、母体糖尿病^4,5,6は測定方法の開発に置かれる高い値と胎盤絨毛の毛細血管網の特性。主要な障害は胎盤の血管網にスケールの広い範囲が含まれています。表面の血管網は直径 4-5 mm と同じくらい偉大ですることができます。ターミナルの絨毛の毛細血管では、直径 10 -20 μ m 程度、します。胎盤には血管⁷の 300 キロ以上が含まれています。現時点では、艦船スケールのこれらの極端をキャプチャすることができますほとんどを使用して簡単かつ迅速なテクニックがありません。日には、顕微鏡による絨毛の小さい数だけを表示できます。たとえば、Jirkovskaらに焦点を当てた胎盤絨毛期では、120 μ m 厚いセクションから取得した 1 μ m 間隔でシリアル光学セクションと共焦点顕微鏡を組み合わせること⁸が提供された研究のサンプルも統計の数上のデータはないです。毛細血管の構造、および絨毛と毛細血管の輪郭手描きトレース画像解析のエクスポートと。著者は、「成長している絨毛血管ネットワーク」の彼らの調査結果影響を議論のみの「期間」(36 + 週妊娠年齢) 組織を検討したときそのような結論問題となります。同様に、メイヨー et、l. ピアースらの血流と酸素転送のシミュレーションのための同じ年齢の組織に依存して、彼らの分析は、いくつか用語のみ終末絨毛^9,10に限られていた.ステレオロジーは、絨毛血管の構造の研究にも適用されています。しかし、再び、フォーカスは一般的に産児 1 つ以上妊娠合併症^11,12を提供することで後の妊娠にされています。

最近まで、共焦点顕微鏡に限られていた 100-200 μ m の組織の深さにイメージング蛍光の励起の吸収と放出のため上を覆う組織¹³ 。3 D オフ組織学を広く文献に記載されている、組織だろうと何のための多数のメソッドがない組織での使用に適した一般、細胞形態、水分過剰による不可逆損害を与えるのでタンパク質や脂質の除去。したがって、これらの結果、組織自体の処理プロセスをクリア私たちの組織は伝統的な組織に対して検証することができる可逆的手法からはアーティファクトを示すことを確認することはないです。組織の清算は一般的に 3 つの主要なアプローチの 1 つを含む: 1) 連続による重力レンズから引き起こされる累積的な光散乱を除去する RI マッチング ソリューションによる組織成分の屈折率 (RI) の制服と一致します。低 RI (細胞質) の高い RI (タンパク質/脂質) 成分の変動2) ハイドロゲルを埋め込むと脂質成分; を削除する電気泳動/拡散を利用した脂質成分を削除します。3) RI ¹³の均一性を促進する溶媒の普及率の増加を許可する蛋白質の構造の拡大/変性。一方、これらのアプローチは、組織を透明にレンダリングすることができ、生成するバイオ マーカーの 3 D 表現を可能にする、これらの 3 D 表現は、疑わしい臨床値のそれはこれらの画像が組織プロパティを示しているかどうかを決定するために挑戦や組織のプロセスをクリアします。一方でオフ私たちの組織はリバーシブルなので標準組織学的および免疫組織化学的に適用できる変更が臨床的に重要かどうかを評価する同じ組織。

本稿では 23 の臨床的に正常とされる終端妊娠 9-23 週以降の妊娠と 2 つの満期正常分娩の間の合計 47 遠位絨毛試料の分析。胎盤絨毛細胞と内皮細胞の蛍光標識と、絨毛血管網とその複雑さの変化の定量的および自動分析を可能にしました。

このプロトコルでは、分離され、以前終末絨毛と可能ではない規模で自分の毛細血管網を分析します。このアプローチは、妊娠全体の絨毛と毛細血管のネットワークの開発に適用した場合は、健康な子供の生れのための基盤は、これらのプロパティを識別します。複雑な妊娠の研究に適用されるときと胎盤病理絨毛の木と彼らが鞘毛細血管網の変更どのようにこれらは胎児の幸福に影響を与える方法とまた明白にします。

Protocol

このプロトコルは、発達障害人間研究倫理委員会の基本的な研究のためニューヨーク州研究所のガイドラインを続きます。

1. 絨毛木郭清

1. バフ リン酸生理食塩水 (PBS)¹⁴ホルマリンを除去し、解剖顕微鏡のステージにシャーレに置きに胎盤組織を固定ホルマリンをすすいでください。メスと微細鉗子を使用して胎盤組織を離れて、絨毛木 (白い糸のような分岐構造) を探します。絨毛ツリー (数 mm 長い) の部分を解剖し、組織をマイクロ チューブ含む 〜 1 mL PBS に転送します。

2. 免疫蛍光染色

1. 、ピペットと PBS を削除し、新鮮な PBS で置き換えます。時折旋回 10 分立ってみましょう。もう一度繰り返します。
   注: この手順および以降のすべての手順は、一次抗体の孵化を除く室温で行われます。
2. ピペットを使用して、削除し、PBS を置き換えます PBS 0.1% トリトン X100 + 2% ヤギ血清 (PBS-T-GS) 二次抗体の組織とブロック非特異的結合を permeabilize。30 分間インキュベートします。
3. 両方のマウス モノクローナル抗 CK7 とウサギ抗 CK7、2% ヤギ血清を含む PBS PBS T GS 交換します。
   1. 4 ° C で一晩組織を孵化させなさい
   2. 残りの抗体を削除するには、時折旋回 10 分 PBS GS で洗浄します。
   3. PBS GS を削除し、両方のヤギ抗マウス IgG 結合緑色発光を含む PBS GS に置き換える (520 nm) fluorophore ヤギ抗うさぎ IgG 結合赤外線発光 (652 nm) 蛍光。
   4. 2.1 のステップを繰り返すことによって抗体を削除します。
   5. 暗闇の中で常温カルビンディン抗体組織を保存します。

3. 組織の明確化

1. 10 分間隔で 3 回 PBS でサンプルを洗います。
2. ピペットと PBS を除去し、50% エタノールに置き換えることによって組織を脱水 (メタノールとしても使用することがあります)。インキュベート新鮮な 50% エタノールに置き換えて 10 分、10 分が 3 孵化の合計はこれをもう一度繰り返すを孵化させなさい。70% の孵化を繰り返します。その後、100% エタノールに置き換えて、15 分間インキュベート (またはメタノールが使用されるかもしれない)。
3. 細いの鉗子で組織を転送、新鮮なマイクロ チューブを含む 〜 1 mL ソリューション 1 4 時間。
4. 新鮮なマイクロ チューブ含むソリューション - 2 の組織を転送先の細いピンセットで 〜 4 h。
   注: 暗闇の中で保存されると、螢光抗体は、室温で安定して少なくとも 6 ヶ月間です。
5. クリアが失われると、任意の水溶液、(例えばマウント中) を混在させないでください。

4. 顕微鏡用取付

1. 組織が柔らかく、変形しやすい標準的なガラスのスライドと観察間の組織をマウントしないでください。
2. 図 5Bを参照し、サイクス-ムーアの商工会議所で組織を次のようにマウント
   1. 先の細いピンセットで、基本室内の 25 mm ラウンド coverslip を配置しています。
   2. 先の細いピンセットで、coverslip のベースにゴム製のガスケットを配置します。
   3. ピペットと、カバーガラスのセンターのソリューション 2 のドロップ (~ 40 μ L) を配置します。
   4. 先の細いピンセットで、coverslip の中央にドロップするソリューション 2 からワンピース ティッシュを転送します。
   5. ガスケットの上に 2 番目の coverslip の場所。
   6. 会社まで coverslips とガスケットを圧縮ベースの上部にロッキング リングを通します。
      注: を締めすぎないように注意してくださいまたは、coverslip が粉々 になります。
   7. ベースとガスケットを介してポートに 22 g 針を挿入します。
   8. 3 mL 注射器を埋める 〜 ソリューション 2 の 1.5 mL。
   9. 25 ゲージの針を注射器にマウントします。
   10. ガスケット、反対側のポートに注射針を挿入します。
   11. その他の 25 ゲージの針を通して室内の空気を抜き、確保するため、ソリューション 2 and 塗りつぶし商工会議所を優しく挿入します。
   12. 針と注射器を取り外し、共焦点顕微鏡段階の大きなガラスのスライドの商工会議所。
3. また、PDMS シリコーン シートからカスタムの井戸をカットします。
   1. はさみは、PDMS シートからの 25.4 × 25.4 mm²枚にカットします。
   2. メスでカット 〜 12.7 × 12.7 mm²ピースで。
   3. 顕微鏡スライドの上にしっかりと作品を押します。
   4. ソリューション 2 でトップに井戸を埋めます。
   5. 井戸の中心にマイクロ チューブから組織の一部を転送します。
   6. 先の細いピンセットで、カバーガラスの下部がソリューション 2 接液部井戸の上に観察を配置します。
   7. 共焦点顕微鏡段階の組織でサイクス ムーア商工会議所アセンブリをマウントします。

5. 共焦点顕微鏡

1. 10 × 対物フォーカスに商工会議所の組織をもたらします。
2. 組織の上下間の距離を測定する焦点面を顕微鏡ステージを上下に移動します。
3. 上から下への組織を介して画像のセットを含む共焦点画像ファイルを収集するために 2.5 μ m のステップでステージを移動します。

6. 逆転クリア

1. 100% エタノール量 x マイクロ チューブ含む > 20 組織を転送することによって逆にクリア。1 h の間隔は、70% エタノール、50% エタノールそして PBS で置き換えます。暗闇の中で 4 ° C で保存します。
   注: 処理区分および組織学的標準的なパラフィンを埋め込む、組織や免疫組織化学的染色します。

7. デコンボリューション

注: 次の手順では、ソフトウェア コマンド、タブ、ドロップ ダウン メニューの斜体で示します。

1. デコンボリューション ソフトウェアを起動してイメージ ファイルを開きます。
2. 'Summary' ウィンドウに表示されているパラメーターを入力します。
   1. '間隔は、ボクセルを入力 x、y、および z 次元 μ m。
   2. 各カラー チャンネルのドロップ ダウン メニューから免疫染色用蛍光染料を選択します。
   3. 'モダリティ'、レーザー走査型共焦点をドロップ ダウン メニューから選択します。
   4. 「対物レンズのドロップ ダウン メニューから 10 倍を選択。
   5. '浸漬媒体'、空気をドロップ ダウン メニューから選択します。
   6. クリックして、'適用 'ボタン。
3. 'Deconvolution' タブをクリックします。
4. クリックして '3 D デコンボリューション'ドロップ ダウン メニュー。
5. '- 3 D デコンボリューション'ウィンドウでは、設定が保証するため: 1) 適応 PSF ブラインド、2) 理論的 PSF、3) 使用 (既定適応 PSF、10 のイテレーション、媒体ノイズ)、4) ベース名。
6. クリックして、'緑色のチェック ボタン 'プログラムを起動します。
7. 終了すると、7.3-7.6 プログラムを再起動する手順を繰り返します。終了したら 3 番目と最後の時間を再起動します。
8. 'データ マネージャー'ウィンドウで、付けファイルをクリック"10-10 - 10-」。
9. クリックして、'ファイル ' ] タブをクリックしをクリックして'Save As'。
10. 'S のA を保存'ウィンドウを選択 '8 ビット符号なし整数'から、'データ型 'ドロップ ダウン メニューとクリック セーブを。

8. 画像処理

1. フィジーのソフトウェアを起動します。
   1. クリックして 'ファイル'をクリックして 'オープン' Deconvolved イメージ ファイルを選択し、クリックして、、'オープン 'ボタンを'オープン 'ウィンドウ。
   2. クリックして 'イメージ/色/分割チャネルおよび変換 3 色の画像ファイルの 1 つだけの色を含む 3 つの新しいファイルに。カルビンディン抗体には絨毛の毛管イメージ セットを含む赤いイメージ ファイルを保存します。緑および青のイメージ ファイルを削除します。
   3. 赤いイメージ ファイルからのバック グラウンド蛍光を減算: 'バック グラウンド プロセス/削除'。
   4. ドロップ ダウン メニューでローリング ボール半径を 10 ピクセルに設定します。
   5. 4 メニュー オプションをオフのまま、クリックして '[ok]'。
   6. クリックして ' プロセス スタック メニューの「イエス」 。
   7. 開くことによって本来の組織蛍光 (蛍光) を削除、'画像/調整/明るさ-コントラスト 'メニューの最小値、最大値、明るさおよびコントラストの設定を調整します。キャピラリーの蛍光抗体のいずれかを削除しないように注意します。
   8. 開くことによって無関係な蛍光を残りを最小限に抑える、'画像/調整/しきい値 'メニューとキャピラリーの蛍光を強調表示するようにスライダーを調整します。チェックの '暗い背景'ボックスし、をクリックして '適用'。'バイナリ ドロップダウンに変換'メニュー チェック、'黒の背景 'ボックスし、をクリックして'[ok] '。分析の下の黒と白 (バイナリ) イメージ ファイルを保存します。

9. 分析

1. オブジェクトのカウントと細線化。
   1. 8.1.8 のステップで作成したバイナリ イメージ ファイルを選択します。
   2. クリックして '分析/3 D OC オプションとチェックのみ'ボリューム 'と'ストア結果...'ボックスをドロップ ダウン メニューで。「表示番号」ボックスにチェック マークが付いていないことを確認してください。クリックして、'[ok] ' ボタン。
   3. Click '分析/3 D オブジェクト カウンター'。ドロップ ダウン メニューで設定 'サイズ フィルター: 分' 5000。保証する、'エッジ上のオブジェクトを除外する] ボックスがチェックされていません。確認、'オブジェクトs、統計の'概要'ボックスがチェックされます。クリックして、'[ok] ' ボタン。
      注: これは、ファイルのサイズとコンピューターの構成によっては数分をかかることがあります。
   4. 統計情報の表、オブジェクト ・ マップ ・ ファイルを保存します。
   5. オブジェクト ・ マップ ・ ファイルを選択します。クリックして 'プラグイン/スケルトン/Skeletonize 2 D ・ 3 D'バイナリ ファイルに毛細血管を収縮します。クリックして 'ファイル/保存として。選択 '... Tiff'ドロップ ダウン メニュー。[名前を付けて保存 [TIFF] ウィンドウで「麻薬の売人-」オブジェクト マップ ファイル名に追加し、クリックして、、'を保存 'ボタン
   6. クリックして '分析/スケルトン/分析スケルトン 2 D 3-D'。ドロップ ダウン メニューで既定の設定をクリックして、'[ok] ' ボタン。ブランチ'情報'テーブルを保存、'結果テーブルと 2 つの出力ファイル (Skel オブジェクト ラベル - スケルトンとタグ付きスケルトン)。

Results

ターミナルに納期 8 週間胎からひと胎盤絨毛のクラスターで毛細血管の生成された 3 D レンダリングは個々 のクラスターとしてカウントされ、ネットワーク解析の白骨します。(図 1A) 胎盤の機能ユニットは、表面の血管 (図 1Bと1 Cで拡大) 胎盤実質を浸透している彼らの延長にある絨毛木です。切り裂かれたツリー (Figure1D ・ 1 e) の遠位部分の部分は当時カルビンディン抗体に絨毛トロホブ ラスト層とその毛細血管 (図 2) を表示します。3 D レンダリングの重要な組織をクリアのこのシステムを使用する能力であった。

Discussion

治験審査委員会は、整復終了妊娠からホルマリン固定の胎盤絨毛組織のコレクションを承認しました。医療記録の簡単なレビュー パリティ、母体年齢を指摘したし、基になる医療 (例えば、高血圧、糖尿病、狼瘡) または胎児 (構造または染色体の異常の不在を確認した手順を行う前に異常な成長) を行った。データ シートおよび任意の収集標本研究 ID だけにラベル付けされました。したがって、すべての標本をした手術室を出発する前に匿名化しました。訓練を受けた観察者 (CMS); で絨毛を採取脱落膜と絨毛のプレートは削除され、自由浮遊絨毛塊を採取しました。

溶剤を用いて組織をクリアするとき、いくつかの重要な考慮事項があります。まず、組織は、100% エタノール (またはメタノール) の勾配によって洗浄する必要がありますので、組織が十分に脱水をオフにする必要があります。エタノールを使用している場合に使用する重要です"乾燥試薬グレード エタノール、水を含まない。また、各ステップでのソリューションのステータス退避の十分な量を使用することが重要です。組織の約 10-20 x のボリュームは、成功...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% ホルムアルデヒド溶液 (w/v) リン酸水溶液	マクロン ファイン ケミカルズ	H-121-08	一般的な固定剤、すぐに使用できるフォーミュラ、蒸気が有毒であるため注意して使用
メスの刃	サーモフィッシャー サイエンティフィ	08-916-5B No. 11
メス	サーモフィッシャー サイエンティフィ	08-913-5
ファイン フォーセプス	電子顕微鏡サービス	78354-119
マイクロチューブ (1.7 mL)	PGC Scientifics	505-201
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma	D8537	PBS
ピペット	VWR	52947-948	使い捨て、3ml トランスファーピペット
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	から 0.1% に希釈
	Gibco	16210-064	に希釈2% in PBS solution
マウスモノクローナル抗 ck7 ケラチン 7 Ab-2 (クローン OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody	Abcam	ab28364
緑色発光 (520 nm) 蛍光色素	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
赤外発光 (652 nm) 蛍光色素	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
エタノールアルコール 200 プルーフ	Pharmco-Aaper	111000200	必要に応じてPBSを使用して低濃度に希釈
Solution-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc. (英語)		Visikol Histo-2
スカイズ・ムーア室、	BellCo Glass Inc.	P/N 1943-11111
25ゲージ針	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Needes
3 mL syringe	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD 使い捨てシリンジ
PDMS シリコンシート	McMaster-Carr	P/N 578T31
共焦点顕微鏡	ニコン株式会社		Nikon C1 共焦点顕微鏡
デコンボリューションソフトウェア	Media Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji 画像処理ソフトウェア			無料、オープンソース  ヘ
マトキシリン	ライカバイオシステムズ	3801570	SelecTech H& のコンポーネント 1 で https://fiji.sc 入手可能なソフトウェアE染色システム
Alcoholic Eosin	Leica Biosystems	3801615	SelecTech H& のコンポーネント 2E染色システム
Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	SelecTech H&E染色システム
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	SelecTech H&E染色システム
免疫組織化学検出システム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	TL-125-QHD	UltraVision Quanto検出システム HRP DAB