方法論記事

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

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DOI：

10.3791/57278

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2018年4月10日

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cells & Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine, 2Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, 3Centro di Ricerca Emato-Oncologica (CREO), University of Perugia, 4Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Texas Children's Hospital & Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9 を介して生成されたとエレクトロポレーションを介して紹介しています。限られた時間と金銭的コスト高の編集効率を実現します。

要約

造血幹細胞 (造血) 分野の進歩は、動物モデルと同様に主要な前駆細胞を作りだすための方法によって支援されています。HSCs の完全な遺伝子アブレーションは、ノックアウト マウスの HSCs が分離できるし、主な人間の遺伝子アブレーションは不可能だった世代を必要です。ノックダウンのアプローチにウイルス伝達を使用できるが、これらは変数の効果に苦しんだ。人間の一般的な遺伝子操作でマウスの造血細胞低効率と膨大な時間とコストのコミットメントに阻まれました。最近、CRISPR/Cas9 は、哺乳類細胞の DNA を設計する能力を劇的に拡大しています。ただし、CRISPR/Cas9 の造血細胞への応用にチャレンジしております、その低トランスフェクションの効率は、主にためプラスミド ベースのアプローチの毒性とウイルス ベースのプロトコルの低速ターンアラウンド タイム。

編集マウスと人間の造血幹・前駆細胞の 90% までの効率をノックアウト CRISPR/Cas9 を介した遺伝子を実行する迅速なメソッドは、この資料で提供されます。このアプローチは、3 日間ワークフローの合理化とリボ核タンパク質 (RNP) 配信の戦略を採用しています。Cas9 sgRNA RNP の使用ひき逃げアプローチ、編集したセルのゲノムの外因性 dna を導入ないとオフのターゲットの影響の低減が可能します。RNP 方式は高速かつ簡単です: sgRNAs、ウイルスの準備または特定の sgRNA 化学修飾のクローンは必要ありません。このプロトコルで科学者はオリゴヌクレオチド合成のためのダウンタイムを含む、一週間以内一次造血細胞の興味の遺伝子のノックアウトを正常に生成することができるはず。このアプローチは、このプロトコルに自分のニーズに合わせてユーザーのより広範なグループになります。

概要

CRISPR/Cas9 の出現が根本的に哺乳類細胞で遺伝子の編集を簡素化します。プラスミッドまたはウイルス ベースの配信 Cas9 タンパク質と sgRNA1,2,3の CRISPR/Cas9 の初期のプロトコルが利用されます。これらのアプローチは、細胞・動物モデルの開発は画期的な証明し、プライマリ造血幹・前駆細胞 (HSPCs)4,5にも正常に適用されています。ただし、これらのメソッドは、欠点の数を持っています。まず、遺伝子破壊効率は 504,5以下頻繁に残ります。これは細胞にノックアウト (KO) のクローンを生成するために十分な短期培養の必要性はこのような戦略に従わない HSPCs を作る。第二に、クローン作成の要件は、単一の実験でテストすることができますし、大規模な構造を transfect に困難を生成する sgRNAs の量を制限します。第三に、これらのアプローチは、科学者が納期を遅くを強制します。

これらの制限を克服するために私たちのグループが開発し、最近 Cas9 sgRNA ribonucleoproteins (結合) を使用して HSPCs に CRISPR/Cas9 の代替アプローチを公開-配信6をベースします。CRISPR の生のコンポーネントは、この戦略で (Cas9 蛋白質との in vitro転写 sgRNA) 前複合体、電気穿孔法 (図 1) を介して標的細胞に直接配信します。Cas9 sgRNA RNP 複合体の半減期は、時間よりも短いそのプラスミッドまたはウイルス核酸を転写、オフのターゲット率は初期のアプローチ7に比べて低い。また、RNP アプローチは携帯変換につながるターゲット細胞のゲノムに統合することができますランダムに外因性 DNA のすべてのソースを排除することの利点を追加します。

このプロトコルは、図 1に表される RNP 遺伝子破壊実験のための合理化されたワークフローに基づいています。最初のステップは設計、各 sgRNA のためのプライマーを注文します。これらのプライマーを駆使して、sgRNAs を取得するための in vitro転写 (IVT) 用 sgRNA DNA テンプレートをします。精製 sgRNAs は、以前購入した Cas9 蛋白質、フォーム Cas9 sgRNA RNP 複合体と孵化させます。最後に、pre 複合 Cas9 sgRNA 結合、セルに electroporated です。効率を編集をテストする次の穿孔と体外/ニーズに応じて、生体内で実験を開始することができます。この革新的な実験的アプローチの詳細な説明を見つけることができます。

プロトコル

薬の Baylor の大学倫理委員会のガイドラインをプロトコルに従います。マウスで実行されるすべての実験手順は、ベイラー大学の医学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されます。

1. sgRNA Fwd デザイン

  1. Http://www.crisprscan.org/?page=track8興味の sgRNAs の設計を開始するに移動します。
  2. 「マウス」または興味の細胞の種類に応じて「人間」のボタンをクリックします。
  3. UCSC の検索ボックスに興味の遺伝子を入力し、移動を押します。
  4. ズームインし、遺伝子の領域への移動 (すなわち。 特定のエクソン) ターゲットに関心が。
    注:ターゲットはお勧め効率的な遺伝子破壊を達成するために最も早い exon(s) はあなたの特定のセルの型すべて転写アイソ フォームに存在します。
  5. 「遺伝子 (CD) に CRISPRscan の予測」の下で潜在的な sgRNA ターゲット シーケンスが表示されていることを確認見出し。
  6. 比較的高いスコアを持つターゲット シーケンスを検索してクリックとオフ ターゲットのいくつか (明るい緑色で強調表示されます)。「オリゴ シーケンス」セクションの下に表示、完全なシーケンスをコピーしてテキスト文書に貼り付けます。シーケンスの 3' 末端に"ATAGC"を追加します。完了すると、フルの長さのシーケンスの順序を配置します。
    注:各ターゲット シーケンスの CRISPRscan8は T7 プロモーター、protospacer (ターゲット) のシーケンス、および普遍的な足場の重複のシーケンスが含まれています「統合」前方 sgRNA プライマーを提供します (図 1A参照)。フルレングスのシーケンスは、56 か 57 のヌクレオチドの protospacer の長さに応じて作られています。

2. sgRNA DNA 鋳型合成

  1. 溶解し、希釈 sgRNA Fwd と Rev の普遍的なプライマー (完全なシーケンスの表 1 を参照)。10 μ M の最終濃度を得るために 100 μ M にプライマーを希釈し、1:10 を作る方法についてメーカー指示に従ってヌクレアーゼ フリー水で希釈します。
  2. PCR をオーバー ラップを実行する (図 1B参照)、ミックス PCR ストリップ管次: 2 μ L 前方 sgRNA プライマー (10 μ M)、2 μ L 回転足場の普遍的なプライマー (HPLC 精製) (10 μ M)、10 μ L 高忠実度 DNA ポリメラーゼ マスター ミックス (2 倍)、6 μ L ヌクレアーゼ フリー水。
  3. 次のプログラムで PCR を実行: 95 ° C、3 分、98 ° C、5 s、60 ° C、5 s 72 ° C、10 s、2 に 6 サイクル、72 ° C 1 分、永遠の 4 ° C のために行く。
  4. DNA 精製カラム (材料の表を参照してください) を使用して PCR の製品を浄化します。メーカーの指示に従い、11.5 μ L の溶出バッファーで溶出します。
  5. 分光光度計に PCR の製品の濃度を測定します。空白の溶出バッファーを持つ楽器。
    注:DNA 濃度は、50 〜 と 〜 120 ng/μ L の間する必要があります。

3. sgRNA のin Vitro転写

  1. (試薬は RNA 合成キットで提供されます) PCR ストリップ管の次のコンポーネントをミックス: 溶離された DNA や dNTPs の 4 μ、1 μ L 反応バッファー x 10 の T7 RNA ポリメラーゼ酵素ミックスの 1 μ L の 4 μ L。
  2. 少なくとも 4 時間のための 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
  3. 手袋をはめた手から RNase を削除する RNase 洗浄剤を適用します。
  4. ヌクレアーゼ フリー水で 50 μ L の総ボリュームまで各 RNA サンプルを持参 (製造元の指示に従っての RNA の浄化の第一歩)。
  5. 製造元の指示に従っての RNA の浄化と進み、キット提供のヌクレアーゼ フリー水の 50 μ L の溶出します。
  6. 分光光度計で溶離された sgRNA の濃度を測定します。ヌクレアーゼ フリー水と楽器がブランクです。
    注:浄化後利回りは、RNA (すなわち 1.0 1.5 μ g/μ L の濃度) の 50-80 μ g です。
  7. すぐに浄化された sgRNA を使用または-80 ° c 2 4 μ L の因数で長期的に保存します。

4. HSPC の分離と培養

  1. マウスの HSPCs の分離と培養
    注:男性と女性の Ubc GFP マウス (JAX004353) および Rosa26-LSL-tdTomato (JAX007914) 2-6 ヶ月歳の Vav 本院 (JAX008610) と交配は、以下に示す結果を得るため使用されました。
    1. 頚部転位による麻酔下マウスを安楽死させます。
      注:2 つの訓練を受けた人が独立して確認成功安楽死呼吸の不足に注意して、少なくとも 5 分のハートビートは動物から皮膚を削除します。
    2. 脛骨、大腿骨、およびマウスの腸骨稜を解剖し、すべての筋肉や解剖の骨の周りの結合組織を削除します。HBSS 2% を添加した氷の上の組織培養皿にそのまま骨を配置 FBS (HBSS +)。アル骨は洗浄され、細胞培養用ディッシュに転送としてすぐに層流フードに移動します。
    3. 転送洗浄は滅菌モルタル、含む 2 mL に骨冷えた HBSS + 3 骨あたり。乳棒を使用して、骨片、内から骨髄を解放に骨をつぶします。Pestling 骨が杵の下で割れを止めるまで続けます。
    4. 40 μ m の細胞ストレーナーを使用して 50 mL の円錐管にモルタルとフィルターから上澄みを収集します。5 mL の残りの骨片をリンス冷たい HBSS + と同じ 40 μ m ストレーナを使用して同じ 50 mL の円錐管にフィルターします。
    5. 締めくくりは冷たい HBSS + チューブおよび 7 分破棄上清 400 × g で遠心分離によって 2 回細胞を洗ってください。
    6. 次の 2 番目の洗浄は、20 mL の氷冷 PBS で細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー排除9によって実行可能なセルを数えます。
    7. 1 mL あたり 1 x 10 の8実行可能なセルを孵化させなさい冷たい HBSS + 氷の上の 45 分の 1: 100 希釈で c キット抗体をビオチン化します。
    8. 7 分間 400 × g で遠心分離し、上清を廃棄冷たい HBSS + 細胞を洗います。
    9. 製造元の指示に従って反ビオチン マグネティック ビーズを用いて細胞を孵化させなさい。
    10. 磁気列または製造元の指示に従って磁気活性化細胞選別機を使用して c キット陽性細胞を分離します。15 mL の円錐管に c キット陽性細胞を収集します。
    11. 15 mL の円錐管オフにトッピングで PBS で 2 回細胞を洗浄し、上澄みを廃棄 7 分 400 × g で遠心分離します。2 つの洗浄の間には、トリパン ブルー色素排除9実行可能なセルの合計数を計算します。
    12. C を再停止しなさい-キット + 2 %fbs、50 ng/mL マウス幹細胞因子 (SCF)、50 ng/mL マウス トロンボポエチン (TPO)、10 ng/mL マウスと IL-3、10 ng/mL マウス IL 6 補足マウス HSPCs の培養液 100 μ L につき最大 10 の6 viablecells の濃度で細胞。
    13. 37 ° c、5% CO2エレクトロポレーションの前に 24 時間の最大値を少なくとも 1 時間のセルを孵化させなさい。
  2. 人間の HSPCs の分離と培養
    注:層流フードには、これらの手順を実行する必要があります。
    1. 40 μ m 携帯こし器を通って骨髄・臍帯血の細胞をフィルターします。
    2. 1:2 フィルター選択された骨髄・臍帯血の細胞を 1 mM EDTA (PBS/EDTA) を添加した PBS で希釈します。
    3. 密度勾配媒体の 15 mL を 50 mL の円錐管に分配します。優しく密度勾配培地表面に希釈した骨髄・臍帯血の 30 mL を注ぐ。細胞懸濁液の量が 30 mL より大きい場合は複数のチューブを用意します。
      注:血と密度勾配媒体間のインターフェイスをできるだけシャープに維持することを確認します。
    4. スローダウンしないと 30 分 750 x g でチューブをスピンします。
    5. きれいな 50 mL の円錐管に媒体のインターフェイスで転送検出単核細胞層を収集します。PBS/EDTA 管を埋めるし、280 g で 15 分間破棄で細胞の上清をスピンします。
    6. 上清を廃棄、PBS/EDTA スピン 7 分 400 x g での 2 回セルを洗浄します。
    7. 製造元の指示に従って抗 CD34 磁気ビーズの単核細胞を孵化させなさい。
    8. CD34 陽性細胞磁気列または製造元の指示に従って磁気活性化細胞選別機を使用して分離します。15 mL の円錐管に CD34 陽性細胞を収集します。
    9. 洗浄は、2 回での締めくくりは PBS でチューブとは 7 分間 400 x g で回転し、上清を廃棄 CD34 陽性細胞を収集しました。2 つの洗浄の間には、トリパン ブルー色素排除9実行可能なセルの合計数を計算します。
    10. 100 ng/mL 添加培養液中の細胞を再懸濁します人間 SCF、100 ng/mL 人間 FLT3 リガンド (FLT3L) 100 ng/mL ~2.5 x 105の生菌数濃度で人間の TPO/ml. 文化 37 ° C、最大 48 時間前に 24 h の 5 %co2 で CD34 陽性細胞を分離しました。エレクトロポレーション。
      注:エレクトロポレーションの前にフローサイトメトリーによる CD34 陽性人口濃縮の純度を確認してください。

5. エレクトロポレーション

注:次のプロトコルは、10 μ L の電気穿孔法のヒントに最適です。層流フードのすべての手順を行わなければなりません。

  1. トリパン ブルー色素排除9セルをカウントします。(例: 6 x 105セル 3 electroporations のために収集) あたり 2 × 105生菌を収集します。
  2. 7 分慎重に 300 x g で回転、PBS で 2 回洗って細胞上清を削除します。
  3. 並行して、PCR チューブ Cas9 唯一のコントロールを除く、各複製の合計 sgRNA の 1 μ g で RT 1.5 μ g Cas9 で 20-30 分のための孵化によって Cas9 sgRNA RNP 複合体を準備します。
    注:Cas9 タンパク質は、10 μ g/μ l の濃度で提供しています。確実に正確な分注、希釈 1:10 ヌクレアーゼ フリー水で必要な Cas9 タンパク質の総量 (10 electroporations のための例えば Cas9 蛋白質の 1 μ l を取るとヌクレアーゼ フリー水の 9 μ l で希釈し、1 μ l あたりの希薄化後の Cas9 を孵化させなさい。SgRNA の濃度に応じてあたり 1.7 と 2 μ l の間 Cas9 と sgRNA の合計量を構成する必要があります。2 つを使用している場合 sgRNAs インキュベート 500 あたりの各 sgRNA の ng3 を使用している場合 sgRNAs インキュベート 330 複製、1 各 sgRNA の ng。
  4. 合計数 10 μ L を乗じて必要バッファー T 複製再懸濁量必要 (例えば 3 複製の 30 μ L) を計算します。バッファー t. は、細胞懸濁液の最終濃度が 2 x 107セル/mL であることを確認の計算された容積を小球形にされた細胞を再懸濁します。
  5. 分注 10 μ L、pre 複合 sgRNA/Cas9 RNP (例えば中古複合 Cas9 sgRNA を含む PCR チューブに細胞懸濁液の 3 通因数 30 μ L) を含む各 PCR チューブに再懸濁細胞/複製。
  6. 設定するには、エレクトロポレーション システムは楽器をオンに、エレクトロポレーション キュベット、E バッファーの 3 mL を加えるし、キュヴェットをキュベット ホルダーに差し込みます。
  7. デバイスに必要なエレクトロポレーション条件を設定: 人間 HSPCs (1600 V、10 ms、3 パルス) またはマウス HSPCs (1700 V、20 ms、1 パルス)。
    注:CD34 陽性 HSPCs の実験を実行する前に、希望と sgRNA 効率が急性骨髄性白血病 (AML) 細胞 (例えば HL60) 次のエレクトロポレーション条件で同じ戦略 (急性骨髄性白血病細胞株中無料の抗生物質使用) を使用でテストします。R、1350 V、35 ミリ秒、1 パルスをバッファーします。
  8. エレクトロポレーションのピペット チップにラッチ爪を持っている特別なエレクトロポレーション ピペット、エレクトロポレーション、実行されます。エレクトロポレーションのピペットなどを保持、爪を拡張、ピペット チップの中にディスクをつかむし、しっかりと押しますボードコネクター ピペット先端。
  9. ピペットのミックスに 10 回上下サンプル。泡がないことを確かめて、10 μ L を取り出して、エレクトロポレーション キュベットに電解のバッファーに直接ピペット チップを挿入します。キュヴェットの壁に触れないようにしてください。画面の「スタート」を押します。「完了」のメッセージが表示されたら、ピペットを削除し、新しい HSPC 培とに内容を分配します。
  10. すべてのサンプルに対して繰り返します。必要な場合のみ変更ピペットの間サンプル、ヒントします。

結果

このプロトコルの目的は、遺伝子ノックアウト (KO) マウスと人間 HSPCs Cas9 sgRNA 結合を使用して実行することです。ワークフローは、簡単かつ迅速、KO 効率の評価に実験的なデザインからの週未満に実験が完成できます。

SgRNA 結合の組み合わせとエレクトロポレーションにプラスミッドまたはウイルス ベースのアプローチと比較して、プロトコルの成功を作成します。このクローニング-無料戦略大幅を使ってコンポーネントを取得するために必要な時間が短縮されます。また、エレクトロポレーションにより、細胞の 95% までの transfection のため結合。 sgRNAs の配信を最大化することができます。の in vitro転写 (IVT) を通じてラボで synthetized いくつかの企業 (から Cas9 の浄化された蛋白質を購入ことができます。プロトコルを見なさい)。sgRNA Fwd プライマー (図 1 a, B) を使用して短い PCR を行う IVT のための sgRNA DNA テンプレートを取得され、普遍的な足場 Rev プライマー (図 1 bのプロトコルを見なさい)。PCR の製品は、IVT (図 1) のテンプレートとして使用されます。SgRNAs と、Cas9、15-30 分間インキュベート Cas9 sgRNA RNP 複合体が生成されます (図 1)。最後に、sgRNA 結合は細胞に electroporated です。編集した HSPCs は、両方の in vitroとin vivoの実験を実行する使用できます。

遺伝子破壊マウスの細胞

Cas9 sgRNA RNP エレクトロポレーション戦略、濃度の有効性を発揮する-キット + HSPCs 普遍的 GFP または tdTomato を発現するマウスから分離した GFP または tdTomato に対して sgRNA と electroporated をされています。GFP に対して設計されています 3 つの sgRNA、間、GFP sg1 はフローサイトメトリー (図 2 a, B) によって決定される GFP 式の約 70-75% 中断を出展最も効率的に実行されます。Electroporated 細胞からゲノム DNA が分離されたゲノムのレベルで遺伝子の中断頻度を定量化して T7 エンドヌクレアーゼによる (T7EI) 測定を行った。図 2のように、T7EI の試金は 60% 塩基形成を検出しました。T7EI 試金オクターリピートの頻度を過小評価する傾向にあることに注意してください。我々 はまた、Rosa26 軌跡から tdTomato を表現する tdTomato と electroporated の HSPCs に対して sgRNA を生成されます。図 2 Dのように、tdTomato sg1 は tdTomato の表現を効率的に蒸散。

ひと細胞での遺伝子破壊

ここでは、CD45、造血細胞に発現する細胞表面マーカーをターゲット単一 sgRNA アプローチで得られた効率的な停止が表示されます。3 sgRNAs CD45 の異なるエクソンを対象とした設計 (CD45 sg1、sg2、sg3)。HL60 急性骨髄性白血病細胞株 (図 3 a)、sgRNAs の効率化を行った。タンパク質 KO は、エレクトロポレーション後 5 日フローサイトメトリーによって評価されました。CD45 sg1、最も効率的な (KO 効率が 98% -図 3 a)、さらに実験に使用されました。図 3 bは、プライマリ ヒト CD34 陽性前駆細胞 CD45 sg1 のフローサイトメトリー評価エレクトロポレーション後 5 日を使用しての CD45 島を示しています。CD34 発現が影響を受ける、CD45 表現が約 80% の細胞で失われました。200.000 編集のプライマリ CD34 陽性細胞がレトロな軌道エレクトロポレーション後 6 時間の NSG マウスに移植しました。骨髄や脾臓細胞移植後 3 ヶ月収穫をしました。編集されたセル (HLA ABC 正、CD45 陰性は赤で強調表示されている)、検出のみで扱われる sgRNA サンプルと Cas9 のみコントロール (図 3) ではないです。

必要な場合に、削除を生成する 2 つ sgRNAs は、近くのシーケンスのターゲットに使用できます。このアプローチは PCR と編集効率の高速推定でき、高い破壊効率がよく。図 3 D DNMT3Aのエクソン 10 58 bp 削除の効率的な生成を示しています。200.000 編集 CD34 陽性細胞はエレクトロポレーション後 6 時間 NSG マウスに移植されました。58 bp 削除明確に検出された明らかな移植の NSG マウスの末梢血 CD34 陽性細胞と長期生着の機能の編集を確認する (図 3E) の注射後 5 ヶ月。

figure-results-1
図 1: sgRNA 結合を生成する高速かつ簡単な方法です。A) sgRNA Fwd プライマーの表現。SgRNA Fwd プライマーは、T7 プロモーター、protospacer シーケンスおよび sgRNA 足場と重複シーケンスを含んでいる DNA のオリゴヌクレオチドです。3' で終わり、赤で強調表示されます、CRISPRscan で得られる sgRNA Fwd プライマー シーケンスに追加する必要がある"ATAGC"シーケンスです。B) PCR を行い IVT テンプレート重複の模式図。SgRNA Fwd プライマーおよび普遍的な足場 Rev のプライマー間の重複は、拡張子と PCR による増幅します。C)漫画 IVT 反応と sgRNA RNP pre 錯化を記述します。PCR の製品は精製し、IVT のためのテンプレートとして使用します。IVT は、(プロトコルを見なさい) 複数のレプリケートに使用することができます sgRNAs の高い金額を生成します。インキュベート IVT 以前に購入した Cas9 タンパク質から精製 sgRNA sgRNA 結合が生成されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2: マウス造血前駆細胞の効率的な遺伝子破壊。A) 、sgRNA Cas9 タンパク質と GFP (GFP sg1) を対象としたマウス c に electroporated-キット + HSPCs、gfp とエレクトロポレーション後 24 時間フローサイトメトリーで分析しました。B) GFP sg1 の異なる量は 1 μ g Cas9 タンパク質と electroporated の複合体。わずか 200 GFP sg1 の ng が GFP 発現を効率的に蒸散します。C) T7EI 試金 A B で使用される細胞由来ゲノム DNA 上で実行PCR 増幅にまたがる Cas9 sgRNA 胸の谷間サイト希釈 1:4 で 1 x 2 と熱 cycler でゆっくりと交配させられたバッファー。交配させられたフラグメントが 1.25 U の T7 エンドヌクレアーゼで消化された、私は 37 ° C で 10 分消化フラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離しました。バンド強度の各車線のバンド強度をプロットすることによって ImageJ ソフトウェアを用いていた。% 胸の谷間は、分解されていないバンドに裂かれたバンドの強度の比を算出しました。D) c-キット + tdTomato を発現するマウスから分離された HSPCs は Cas9 蛋白質複合体 tdTomato に対して sgRNA と electroporated。フローサイトメトリーは、エレクトロポレーションは、細胞の約 74% が tdTomato を削除することを明らかにした後、24 時間を実行されます。R26 Rosa26 を =。* p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001。この図は、Gundryらから適応されています。6この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-3
図 3: ひと造血細胞の効率的な遺伝子破壊。A)ターゲット CD45 3 sgRNAs (CD45 sg1、sg2、sg3) 設計され、HL60 急性骨髄性白血病細胞株でテスト (エレクトロポレーション条件のプロトコルを見なさい)。フローサイトメトリーは、エレクトロポレーション後 5 日間行った。CD45 sg1 は (KO 効率 98%) 3 つの sgRNAs の中で最も効率的な選択されました。B)プライマリ ヒト CD45 KO 臍帯血 CD34 陽性 HSPCs CD45 sg1 を使用します。CD45 損失は、約 80% の細胞で検出できます。編集後 CD34 式が変更でされていないことに注意してください。C)編集人間 HSPCs は NSG マウスに効率的にへ生着することができます。有核細胞が通常 HLA を表示 + CD45 sg1 としみ込んでマウス CD34 陽性細胞、両方の HLA を扱われるに対し、CD45 + 表現型 Cas9 専用にしみ込んでマウス、+ CD45 + と HLA + ヒト CD45 島細胞の生着を示す CD45 の個体が観察されます。D) 2% アガロースゲル (CB1、CB2、CB3) 3 の異なる臍帯血から人間 HSPCs のDNMT3Aのエクソン 10 の 2 sgRNAs (デュアル ガイド アプローチ) によって生成された 58 bp 削除を示します。PCR は、エレクトロポレーション後 3 日に行った。E) 2% アガロースゲル NSG マウスへの移植後 5 ヶ月 58 bp 削除の永続性を示します。この図は Gundryらから適応されています。6この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

オリゴヌクレオチドシーケンスメモ
回転足場の普遍的なプライマーgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct普遍的な逆プライマー PCR をオーバー ラップします。
hCD45 sgRNA 1taatacgactcactataGGTGCTGGTGTTGGGCGCACgttttagagctagaaatagcsgRNA PCR の重複の Fwd プライマー シーケンス
hCD45 sgRNA 2taatacgactcactataGGGAGCAAGTGAGGATCCTCgttttagagctagaaatagcsgRNA PCR の重複の Fwd プライマー シーケンス
hCD45 sgRNA 3taatacgactcactataGGGATGCTTGTTCCCTTCAGgttttagagctagaaatagcsgRNA PCR の重複の Fwd プライマー シーケンス
hDNMT3A Ex10 sg1taatacgactcactataGGACACTGCCAAGGCCGTGGgttttagagctagaaatagcsgRNA PCR の重複の Fwd プライマー シーケンス
hDNMT3A Ex10 sg2taatacgactcactataGGGTGGCCAGCAGCCGCGCGgttttagagctagaaatagcsgRNA PCR の重複の Fwd プライマー シーケンス
Rosa26 sgRNAtaatacgactcactataGGACACTGCCAAGGCCGTGGgttttagagctagaaatagcsgRNA PCR の重複の Fwd プライマー シーケンス
GFP sg1taatacgactcactataGGGCGAGGAGCTGTTCACCGgttttagagctagaaatagcsgRNA PCR の重複の Fwd プライマー シーケンス
tdTomato sg1taatacgactcactataGGGGTACAGGCGCTCGGTGGgtttaagagctagaaatagcsgRNA PCR の重複の Fwd プライマー シーケンス

表 1:の実験で普遍的な Rev プライマー sgRNA Fwd プライマー シーケンスを完了します。

ディスカッション

この詳細なプロトコルで説明 RNP アプローチを効率的な遺伝子ノックアウト マウスおよびひと造血細胞も懸濁液細胞ラインのように使用できます。非常に高い KO 効率よく取得すると、いくつかの重要な変数と見なされる必要があります。まず、適切なエクソンですキーで効率的な塩基の取り込みが遺伝子に対応することを保証します。エキソンの選択に関連する 2 つの重要な要因はトラン スクリプト内のアイソ フォームとエクソンの位置間で保全です。アイソ フォーム発現細胞のタイプ間で変数、型をターゲットとするので、細胞のタイプ間で遺伝子 KO を使用する場合は、セルの間不変エクソン。アイソ フォーム パターンは、q PCR または RNA シーケンス データを使用して検証できます。成績証明書内のエクソンの位置、それはターミナルでフレーム シフト突然変異として初期のエクソンをターゲットにする最善または最後から二番目のエクソンは、ナンセンス変異を介した崩壊10、真の null ではなく、小説や未知の機能が付いている蛋白質の生産を免れることが。

周波数は、実験の生物学的結果を正しく解釈して KO 効率を推定する重要なステップ、塩基を決定します。酵素試金 (例えば測量法) には、比較的高速かつ簡単に実行であることの利点があります。しかし、重要な背景のシグナルが不正確になりがちで、結果は再現が難しく、しばしば。さらに、実験で (例えば削除と挿入の長さ) 生成オクターリピートの品質に関する情報を提供しません。サンガー シーケンス エンドヌクレアーゼの試金に貴重な代替を提供します。潮11 (https://tide.nki.nl/) などのプラットフォームは、サンガーのトレースを分解し、また個々 オクターリピートの周波数を提供しながら、対立遺伝子破壊効率の正確な見積もりを生成するのに役立ちます。主な欠点は、絶対的な高品質サンガー シーケンス トレース依存です。私アンプリコン高スループット シーケンスは、これらの問題のほとんどを克服します。DNA の非常に低い入力から始まる私アンプリコン ライブラリを準備することができます、高いカバレッジにより、信頼性の高い結果。私アンプリコン シーケンスのコストを減らすためには、我々 は通常合計読み込みの 1 1.5% だけを使用してより大きいシーケンス実行 (例えば RNA シーケンス) に私アンプリコン ライブラリのスパイクします。最後に、成功したノックアウトを確認する西部のしみによるタンパク質レベルの評価をお勧めします、または強くフローサイトメトリー、可能な場合。

前述のよう、ここで紹介した方法は、高速で簡単です、マウスと人間 HSPCs 遺伝子のノックアウトを勉強する新しいツールを表します。我々 のプロトコルを提供しますヒント ベース エレクトロポレーションを用いた遺伝子ノックアウトの指示が、非常に効果的な12,13をする他のシステムを実証されています。

2 つの主要な制限は、RNP アプローチに関して認められる必要があります。まず、前述した当社グループに、HSPCs electroporated 体外での生存率転写 sgRNAs 条件は最適な6ではない場合は特ににエレクトロポレーション、実質的に損なわれることができます。必要な場合、市販合成 sgRNAs (すなわち排除の in vitro転写) 可能性がありますこの問題を克服します。これらは時間とより少なく高価になって、いくつかのベンダーから購入することができます。このシナリオでは有効性のためのスクリーンに sgRNA のプールを生成するための in vitro転写をされる可能性があります、最も効率的な sgRNA(s) 合成用に選択することができます。RNP アプローチの 2 番目の主要な制限は、ウイルス ベースのアプローチのように、正常に transfected セルを追跡することができないことです。ただし、高性能 KO と Cas9 sgRNA 結合で得られた急速な編集は、多くの実験的シナリオでこれらの欠点を上回る可能性があります。各実験で破壊効率を正確に判断する私アンプリコン高スループット シーケンスを用いたをお勧めします。査定する興味の遺伝子のノックアウト増殖表現型 (すなわちどちらかは低下または野生型細胞に比べて増殖を増加) を授与する場合は、複数の時点で塩基の間隔を決定することができますかセルを KO濃縮 (すなわち塩基周波数が高くなる時間の経過) を受けるか、または、outcompeted (すなわち。 塩基減少時間の経過と共に)。

遺伝子の機能の喪失の生物学的効果を理解する体内または試験管内での実験を実行するには、適切なコントロールが必要です。前述したとおり生体外で転写される sgRNAs は細胞に有害である可能性があります、特に主前駆細胞は6。さらに、Cas9 蛋白質による DNA 二重鎖切断は遺伝子独立した抗増殖応答14にあります。したがって、私たちはしばしば CRISPR 実験の制御 sgRNAs の番号を使用し、細胞型と表現されていない 2 番目のターゲット遺伝子発現細胞表面マーカーをお勧めします。

サイトカインの存在下での人間の HSPCs の短期文化遺伝子破壊効率6を増加し、KO の高効率を達成するために必要です。36-48 時間エレクトロポレーション6より前の文化の理想的な期間であることがわかりました。エレクトロポレーション、次のセルをすることができますさらに培養を念頭に長くの文化長生着容量を失うことのリスクが高い。したがって、通常行います移植エレクトロポレーション後決してエレクトロポレーション後 24 時間以降の 6 時間。

CRISPR/Cas9 は、哺乳類細胞のゲノムを正常に編集する科学者たちの能力を飛躍的に高めた。プライマリの造血前駆細胞における遺伝子破壊をより現実的で作る HSPCs と血液疾患の分野で科学的な知識を急速に強化と予測されます。重要なは、ここで説明されているプロトコルはそれにまた白血病の病気でよく見かける、複雑な遺伝的風景のモデリングを可能にする高効率で複数のノックアウトを同時に生成することが可能。

記載プロトコルは、遺伝子破壊に焦点を当てている、遺伝子ノックアウトの実験のため容易に適応させることがあります。つまり、相同監督修理6,13 (HDR) の一本鎖オリゴヌクレオチド テンプレートの共同配送や細胞のポスト-エレクトロポレーションの伝達を通じて AAV6 ベクトルが含まれていると、相同性テンプレート12。修復または HSPCs の特定の突然変異を導入する能力は遺伝子治療やがんドライバー変異急性骨髄性白血病とその他の血液疾患の拡大された研究の新しい治療戦略を促進します。人間 HSPCs の HDR は、成功した6,12,13をされている、マウス HSPCs はこの戦略6を使用して編集することは困難されています。人間、特にマウス HSPCs HDR プロトコルの最適化より詳細な編集と内因性のタグを使用して編集されたセルを追跡するツールの開発に有効になります。

最後に、それはまた対立遺伝子の機能獲得変異が中断可能性があります先天性および後天性造血疾患の潜在的な治療アプローチを表す想定されます。このシナリオでは、変換を促進することが可能な統合を避けるために無料の DNA アプローチお勧めします。また、「ヒットして実行する」アプローチは望ましくないオフターゲット効果の可能性を低減できます。悪性と非悪性血液疾患の治療のための新しい道を開くと特定の配信システムを開発するためにより多くの努力が必要です。

開示事項

ない利益相反を開示するには

謝辞

この作品は、がんの予防によって支えられた、がん研究、エドワード ・ p. エヴァンス財団 (DK092883、CA183252、CA125123、P50CA126752、NIH にガブリエルのエンジェル財団 (RP160283、RP140001、および R1201) はテキサス州の研究所CA193235、および DK107413)。M.C.G. は学生科学者のベイラー研究を提唱しています。フローサイトメトリーは薬の Baylor の大学、NIH (国立研究資源グラント S10RR024574、国立研究所のアレルギー ・感染症 AI036211、国立癌研究所 P30CA125123 のセンター) で部分的に支持されました。また、フローサイトメトリーおよび細胞選別コア。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
に応じた組織培養プレート
1.5 ml エッペンドルフ マイクロチューブSigmaZ606340-1000EA
50ml ファルコンチューブCorning352070
ヌクレアーゼフリー 水 - DEPC 処理サーモフィッシャー サイエンティフィAM9915G
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)KAPA BiosystemsKK2600
MinElute PCR 精製キットQiagen28004
RNAse Zap RNAse 除染溶液ThermoFisher ScientificAM9780
RNA Clean and Concentrator-25ZymoR1017
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040S
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 & micro;gIDT1074181
40 mm セルストレーナーVWR352340
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)GenDEPOTCA008-050
ウシ胎児血清 (FBS)、レギュラーCorning35010CV
AutoMACS Pro セパレーターまたは MACS 手動 セルセパレーションカラムMiltenyi
ネオントランスフェクションシステムデバイスサーモフィッシャーサイエンティフィック
ネオントランスフェクションシステム 10mLキットサーモフィッシャーサイエンティフィックMPK1025より多くの細胞に(プロトコルを参照) ネオントランスフェクションシステム 100mLキット(#MPK10025)を使用できます
名前会社カタログ番号strong>コメント
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0サーモフィッシャー サイエンティフィック15575020人体実験専用
LymphoprepStem Cell Technologies7851人体実験専用
CD34 MicroBead Kit UltraPure humanMiltenyi Biotec130-100-453ヒト実験専用
Stem Span SFEM IIStem Cell Technologies9605ヒト実験専用
組換えヒトSCFMiltenyi Biotec130-096-695人体実験のみ
組換えヒトTPOMiltenyi Biotec130-094-013人体実験のみ
組換えヒトFLT3LMiltenyi Biotec130-096-479人体実験のみ
名前会社カタログ番号コメント
マウス解剖ツールマウス実験専用
乳鉢と乳棒マウス実験専用
ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)Gibco14170112マウス実験専用
ビオチン標識抗c-kit抗体eBioscience13-1171-82マウス実験専用
抗ビオチンマイクロビーズMiltenyi Biotec130-090-485マウス実験専用
X VIVO-15、L-グルタミン、ゲナトマイシン、フェノールレッドロンザ04-418Qマウス実験専用
マウスIL-6Peprotech216-16マウス実験専用
マウスTPOPeprotech315-14マウス実験のみ
マウスIL-3Peprotech213-13マウス実験のみ
マウスSCFPeprotech250-03マウス実験のみ
細胞番号ック

参考文献

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
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  8. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature methods. 12, 982-988 (2015).
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  10. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 665-677 (2015).
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CRISPR Cas9 T7 RNA Cas9 sgRNA RNP

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