多孔体 microcarriers のセル拡張プロトコル 310 マトリックスをシードする灌流型バイオリアクターにおける情報配信システムとしての利用を提案しています。我々 は、細胞の増殖と microcarriers 上で培養した細胞の生存率を決定するさまざまなテクニックがあります。さらに、バイオリアクター培養後の細胞の機能を示します。
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方法論記事
組換えコラーゲン ペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。
この記事について
サマリー
要約
ティッシュ ・ エンジニア リングは、組織や臓器移植の目的についての需要の増加のためのソリューションを開発に焦点を当てて、有望な分野です。このような組織を生成するプロセスは複雑であり、特定の細胞型、足場、および身体的または生化学的刺激細胞の成長と分化を導くための適切な組み合わせが含まれています。Microcarriers は、以来、彼らはより高い表面に体積比を提供し、二次元の伝統的な方法と比較して体内の状況をもっと密接に模倣、三次元 (3 D) の微小環境のセルを展開する魅力的なツールを表します。組織設計を生成するとき、血管、細胞に酸素と栄養を供給し、廃棄物の除去は重要なビルディング ブロックを構成します。実際には、ほとんどの構成体は血管サポートの欠乏のために注入されて失敗します。本研究ではスピナー フラスコ、バイオリアクター、動的条件の下で遺伝子組換えコラーゲン ベース microcarriers の内皮細胞の拡張のためのプロトコルを提案する、この設定セル実行可能性と機能を決定する方法について述べる。さらに、血管新生目的で必要な追加の取り外し手順携帯配信のための方法を提案する.さらに、我々 は decellularized 生物学的マトリックスの灌流型バイオリアクターの潜在的な細胞血管新生を評価するための戦略を提供します。提示方法の使用は、組織工学実習におけるアプリケーションの大規模な範囲の新しい細胞を用いた治療法の開発につながることを考えています。
概要
組織エンジニア リング アプリケーションで一般的な問題の 1 つはの場所で正しい分化型高細胞塊を生成する必要があります。この問題に対処するため microcarriers のアプリケーションは、これまで大規模な世代の皮膚、骨、軟骨、腱1整形外科組織工学などの分野で重要性を増して、1967 年に開始。彼らを許可する付着性文化の取り扱い方法でサスペンション文化2のようなマイクロ三次元 (3 D) 基板上への細胞の拡大によって。それにより細胞は均質な栄養供給や3,4分化はしばしば失われる 2 D で時間をかけて生体内でのより良いメンテナンスにつながる5に接近する細胞マトリックスの相互作用を経験します。最終的に高いセルの利回り6、7、高いガスにつながる - より高い表面-容積比と静的なシステムに8、規制、物理的な文化を対象とする可能性を比較する栄養の為替レート刺激9、および拡張のプロセス7のスケール アップ....
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プロトコル
hBMSCs は、変形性関節症患者の大腿骨頭置換術大腿骨頭から分離されました。ヴュルツブルク大学のローカル倫理委員会および患者のインフォームド コンセントの承認の下でプロシージャを行った。主な血管内皮細胞は、少年ドナーの包皮生検から分離された.その法的日付には、書面によるインフォームド コンセントが用意されています。研究は、ヴュルツブルク大学 (投票数 182/10) のローカル倫理委員会によって承認されました。
1. hBMSCs と HDMECs の単離
- ひと骨髄由来間葉系間質細胞 (hBMSCs)
- 海綿骨を大腿骨頭から削除するには、滅菌スプーンを使用します。
注: 海綿状骨は堅く、堅いである皮質骨内の緩みや粒状物質として表示されます。メスを用いた海綿骨のスクラッチ部分に皮質骨から必要があります。 - 2 つの 50 mL チューブに削除された海綿骨を挿入します。海綿骨量人工股関節置換手術中に削除された大腿骨頭の寸法によると 10 mL までが 5 からあります。
- DMEM F12 (DMEM とハム F12 媒体の 1:1 混合物) で洗浄充填中の約 30 ml チューブ。
- 5 のための縦方向の方法で手動で、チューブを振る s 海綿骨から脂肪細胞をさせる。5 分間 300 x g で 22 ° C に遠心します。
- 卒業プラスチック ピペット、脂肪....
- 海綿骨を大腿骨頭から削除するには、滅菌スプーンを使用します。
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結果
図 1 aのように、生きているかデッドの汚損によって決定されるカルチャの 7 日後 RCP microcarriers に実行可能なセルの数が多いを得た.これらの結果は、部分的に (図 1 b) を短期、毛穴周り完全に植民地化された microcarriers を認め、SEM 分析によって確認されました。その一方で、実験で細胞ない均等に播種したいくつかの空 microcarriers 結果になった失敗した実験は、以上合計セル量 (図 1) の 10% をしないで死んだ細胞の異常に高い数が特徴です。さらに、HDMECs の DNA の内容数量は時間 (図 1) をかけて dsDNA の増加を示した。
また、RFP HD.......
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ディスカッション
マイクロ ・ キャリアの 1 つの主な目的は、必要な場所にセルを提供するために、分化を維持しながら細胞の拡大です。表されたメソッドは、セルを添付し、増殖、細胞密度の高いと、microcarriers を植民地化しできた RCP microcarriers をご紹介します。これはライブ/デッド染色、生菌の 90% 以上が動的文化の 7 日後のみいくつかの死んだ細胞が得られた中に検出されたで観測されました。同様に、SEM 画像はセルが文化の 7 日後、microcarriers の全体の表面をカバーすることを確認しました。
3 D モデルの細胞の存続を確保するため、廃棄物の除去ができ、細胞に酸素と栄養の供給を維持することが重要です。血管は、以来、彼らは血管23の内側の部分の内側を覆う細胞に内皮細胞が重要な役割を再生、この exchange プロセスの責任がある構造です。彼らは増殖、移行、付着、スプラウト、および24血管のような構造を形成する能力を持っています。これらのプロパティは、セルを発芽.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
これらの結果につながる研究資金から、欧州連合第 7 フレームワーク プログラム FP7/2007-2013 付与契約 n ° 607051 の下で (バイオ刺激) を受けています。私たちは、SEM 分析支援のためケイ酸塩研究 ISC の RCP 製造とフラウンホーファー研究所からヴェルナー ・ ストラックの間に技術援助から富士フイルム製造ヨーロッパ BV、キャロライン ・ ヴァン ・ Spreuwel Goossens を感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルリンドルジ塩酸塩 (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 酢酸 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| 分析天びん Kern EG 2200-2NM | Kern &Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, ヴュルツブルク, ドイツ | ||
| 明視野顕微鏡 Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| コラーゲンR溶液0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbeccoのリン酸塩緩衝生理食塩水 | Sigma-Aldrich | D8537 | 塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなしで変性 |
| エオシン1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| エタノール96% | カールRoth GmbH | T171.4 | 変性 |
| 子牛胎児血清(FCS) | バイオ&FCSを売る | 。ADD.0500 | 非熱不活性化 |
| 蛍光顕微鏡BZ-9000 | エンス | ||
| ヘマトキシリン | モルフィスト | 10231.01000 | |
| ヘキサメチルジシラザン | シグマアルドリッチ | 440191 | 試薬グレード、≥99% |
| バイオリアクター用インキュベーター | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, ヴュルツブルク, ドイツ | ||
| 生細胞/死細胞二重染色キット | Fluka | 04511KT-F | |
| マグネチックスターラープレート | 2Mag | 80002 | |
| メディウム 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 | Tecan | ||
| 針 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| パパイン パパイヤ ラテックス | Sigma-Aldrich | P4762 | 凍結乾燥粉末、≥ 10 units/mg タンパク質 |
| パラフィン | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 蠕動ポンプ | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| 走査型電子顕微鏡 スープラ 25 | Carl Zeiss AG | ||
| 水酸化ナトリウム溶液 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| スピナーフラスコ (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| 組織培養フラスコ(25 cm2、75 cm2、150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline細胞技術 | LL-0005 |
参考文献
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods ....
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