方法論記事

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

DOI：

10.3791/57390

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2018年5月4日

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1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

この記事について

サマリー

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この記事では、RNA 干渉 (RNAi) 昆虫を摂食する師管液中の植物の維管束組織を通して二本鎖 RNA (dsRNA) の口頭配達のために開発する手法を示します。

要約

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師部と植物の sap 餌昆虫は侵入作物、食用作物の損傷プロセスの栄養素を取得するために果物の整合性です。半翅目の昆虫は、経済的に相当な害虫植物師管液を摂食による農作物の被害を引き起こす可能性の数を占めています。クサギカメムシ (BMSB)、クサギカメムシ越冬(カメムシ亜目: カメムシ科) と、ミカンキジラミ (ACP)、ミカンキジラミ桑山 (半翅目: Liviidae) が北アメリカに導入された半翅目害虫、彼ら屋内では、柑橘系の果物と主食行、付加価値の高い専門の侵襲性の農業害虫として不快害虫が。多くの種の殺虫剤抵抗性は害虫管理戦略の代替法の開発につながっています。二本鎖 RNA (dsRNA)-仲介された RNA 干渉 (RNAi) はジーンサイレンシングの害虫の管理のためのツールは、潜在的なアプリケーション機能ゲノム研究機構。外因合成 dsRNA または小さい干渉の RNA (siRNA) は、非常に効率的な遺伝子サイレンシング提示に相同である内因性 RNA の分解を介してトリガーできます。RNAi の半翅目昆虫の生物的防除のための分子バイオ農薬として効果的かつ環境使用を介して供給二本鎖 rna の生体内で配信が必要です。昆虫への dsRNA の配信方法を示す: 浸漬、緑の豆に dsRNA の読み込みと摂取を介して口頭配達と遺伝子特異的 dsRNA の吸収します。我々 はまた粘土顆粒と同様、葉面散布、根の水薬、トランク注射 dsRNA の徐放に不可欠なすべての可能性がありますを使用して非遺伝子組換え植物配信アプローチを概説しました。経口摂取の dsRNA によって効率的な配信は、ターゲット遺伝子"幼若ホルモン酸-o-メチルトランスフェラーゼ"(JHAMT) と (vg) の発現低下を誘導するために効果的な投与量として確認されました。これらの革新的な方法を表す作物保護で使用し、害虫管理のための環境の課題を克服する dsRNA の配達のための戦略。

概要

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半翅目の昆虫は、高い人口成長を達成し、植物の病気を広める能力を agriculturebecause の最も経済的に重要な害虫の一部を構成します。BMSB、 H. 越冬態は 1996年1で報告された最初の目撃にアジア (中国、台湾、韓国、および日本) からペンシルベニア州アレンタウンで西半球で偶然持ち込まれた外来の害虫です。導入以来、BMSB 43 の州で最高の人口だけでなく、カナダ、ヨーロッパ、大西洋 (デ、MD、ペンシルバニア、ニュージャージー州、バージニア、およびウェスト バージニア州) で検出されました、そして農業2へ潜在的な脅威を表します。食性の害虫として BMSB は、リンゴ、ブドウ、観賞植物、種子作物、大豆、トウモロコシなどの高付加価値の作物を含む約 300 の識別された植物ホストへの損傷をしかけることができ。主に動物と維管束組織2,3から栄養素にアクセスを得るために、針のようなスタイレット ホスト作物を貫き、裂くとフラッシュとして知られている餌のモードによる被害です。BMSB 学校など地域生活に住居を見つける可能性があります、また屋内害虫ではあり秋から冬2。化学物質やアレルゲン BMSB によってリリースは、果実収穫労働者の違法なアレルギー....

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プロトコル

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1. BMSB 飼育

  1. 標準的なラボ実習と説明した63あたりリア BMSB 昆虫。
  2. グラスハウス (22 ° C) と自然光で柑橘系のアジサイの ACP (黒点) 昆虫を上げます。大人の ACP を使用、約 5-7 日で羽化を投稿します。

2. 各種遺伝子領域、dsRNAの試験管内合成

  1. 以前に発行されたトランスクリプトームのプロファイル32から BMSB に特定の遺伝子を選択します。
  2. 選択した関心領域によって異なります 200 に 500 塩基対を確認します。
  3. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ゲノム DNA からの興味の選択した遺伝子に関連付けられているフラグメントを生成する次の条件を使用してを実行します。遺伝子特定のオリゴヌクレオチドの表 1を参照してください。
    1. PCR の反作用: 0.25 mL PCR チューブ PCR バッファー、dNTP (2.5 mM) の混合物の 4 μ L、2 μ L の DNA のテンプレート (50 ng/μ L)、プライマー 1 と 2 (10 μ M)、0.25 μ L の DNA ポリメラーゼ (5 U/μ L) の 2.5 ....

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結果

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BMSB 4th齢幼虫の摂食による野菜の仲介された dsRNA 配信は侵襲的な害虫の RNAi を用いた分子バイオ農薬の開発のテストされました。BMSBs フィードと呼ばれるメカニズムによって、針のようなスタイレットを使用して裂くし、フラッシュ、作物にかなりの被害が発生します。細長い有機緑豆、 P. 尋常性L、栄養素や dsRNA が体内BMSB を通じて届け餌3かをテストする使用されました。緑色の豆のセグメントは、DNase/RNase フリー水または BMSB (図 1 a) で配信をテストする緑の食品着色料と水の溶液に浸漬した.緑の食品着色料は、dsRNA を模倣する表示として使用されました。緑豆の維管束組織された毛細管62師部を通じて緑着色溶液の流れのため緑の食品着色料と飽和状態。BMSB ニンフは、緑豆 (図 .......

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ディスカッション

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RNAi は、遺伝子生物学的機能と規制の害虫19,68,69,70,の管理のために利用するための大きな可能性を探索するための重要なツールであること証明されています71. デザインおよび特定の昆虫種の虫に対応する dsRNA(s) の配信方法を黙らせるための適切な遺伝子の選択が最も重要なの両方です。昆虫に dsRNA を配信する最適な方法は長所とその他の制限を提供するかもしれない特定のメソッドとして配信、相対的な線量の選択と共にの経験的に決定する必要があります。環境リリースに適して可能性があります最終的に分子 biopesticide の開発、実現可能な効率的で有利な配信方法が必要です。たとえば、局所的に適用される dsRNA は柑橘類に防虫のブドウ42,

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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作者は感謝して実験のため BMSB と HB を提供し、植民地の維持のドナルド ・ ウェーバーとミーガン ハーリヒ (アルス ベルツヴィル, メリーランド、米国農務省) を認めるマリア ・ T ・ ゴンザレス、サルバドール p. ロペス、(米国農務省、アルス、フォート ピアス、フロリダ) と植民地維持、試料調製及び分析ジャッキー ・ l ・ メッツ (フロリダ大学、フォート ピアス、フロリダ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BMSB(H.ハリス)昆虫 USDA
ACP(D. citri)昆虫 USDA
有機インゲン/ A
柑橘類植物USDA
次亜塩素酸ナトリウム溶液JTベイカー
グリーン食品着色料 McCormick & Co., Inc
サーモフォーマチャンバー サーモフィッシャーサイエンティフィック
マゼンタ容器(培養)Sigma
Primers IDT DNA
SensiMix SYBRBioline
qPCR ABI 7500Applied Biosystems 
スプレーボトルN/A
パラフィルムアメリカン缶会社
TaKaRa Ex TaqClontech
QIAquickQiagen
N

参考文献

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  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys i....

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