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方法論記事

急速なIn Vivo評価補助の細胞傷害性 T リンパ球生成機能のワクチン開発のため

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DOI:

10.3791/57401

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2018年6月19日

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1Department of Vaccinology and Applied Microbiology, Helmholtz Centre for Infection Research

この記事について

サマリー

標準的な免疫学的技術のアプリケーションをご紹介 (CFSE 染色 OT-私増殖) 急速に補助を介した細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) の生成をモニターするつもり体内。CTL 容量の高速推定、がん治療用ワクチンと同様に、細胞内の病原体に対する予防ワクチンの開発に役立つ。

要約

モダンなサブユニット ワクチンの評価では、中和抗体の生成は重要ですがアジュバントの選択は不十分であることを明らかにします。したがって、細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) の反応を促進することができる体液性および細胞免疫促進機能を備えたアジュバントが急務します。したがって、忠実な監視クロスプライミングを誘導し、その CTL 世代を強化補助候補者のワクチンの開発の重要なステップを表します。ここで提案する SIINFEKL 固有を使用するメソッドのアプリケーション (OT-私) T 細胞モデル抗原卵白アルブミン (OVA) は、生体内で異なる補助候補の存在下でのクロス プレゼンテーションを監視します。このメソッドは、最高のクロス プライミング機能を備えたアジュバントを選択する急速なテストを表します。CD8 の増殖+ T 細胞クロスプライミングの最も貴重な徴候、また、アジュバント クロス プレゼンテーションの相互関係として考えています。この機能は、リンパ節や脾臓のようなさまざまな免疫器官で評価できます。CTL 世代の範囲も監視できます、それによりローカルの性質に洞察を与えて (主にリンパ節をドレイン) または全身性反応 (遠くのリンパ節や脾臓)。さらにこの手法も従来型と遺伝子組み換えマウスの系統に使用される可能性を提供していますクロス プレゼンテーションの特定の経路を阻害することができます薬をテストするための複数の変更をことができます。要約すると、ここで紹介するアプリケーションは業界や学界でワクチンの研究所で、開発または化学のアジュバント ワクチンの研究と開発のための変更のため役に立つでしょう。

概要

細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) を誘導するワクチンは、がん1の特定の種類を戦うために開発されているキーの治療です。CTL はまた細胞内病原体2に対する予防ワクチンのため重要です。また、CTL は、初期の生活の感染症5と戦うための CTL はまた決まる人新生児3,4などリスク集団の機能的アクティブないくつかの免疫防御機構の 1 つです。この点では、CTL 応答 (ミョウバン) は発生しませんするアジュバント開発された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) に対するワクチンは乳児6感染症時に重篤な合併症につながるワクチンの完全な失敗に終わった。予防接種のこれらの負の影響は CD8 によって反転できます+ T 細胞応答7。我々 は以前、インターフェロン遺伝子 (スティング) 作動薬のいくつかの刺激によって誘発される (タイプ I のインターフェロン) 主なサイトカインの増殖を測定することによって部分的にこれらのアジェバントの8、によって生成された CTL 応答のため不可欠であることを示しています。OT-T 細胞ワクチン接種と CTL 誘導機能の測定で観測されたこれらの結果を使用して拡張予防接種スケジュール9後。OT の拡散の測定-私は CD8+ T 細胞の野生型 (WT) C57BL/6 受信者マウス carboxyfluorescein 染色エステル (CFSE) 色素希釈が生成するワクチンのアジュバントの機能の推定SIINFEKL (OVA 卵白アルブミンの免疫支配的なペプチド) のクロス プライミング。この手法のバリエーションが広く OT の増殖の評価-私は CD8+と OT II CD4+ T 細胞。たとえば、それはいない選択したサイトカイン (KO マウス)、あるいは WT 動物抗原リコール後ワクチンの有効性を測定するために使用されています。CFSE 染色 OT の受身伝達後、短いプロトコル (4 日間実験) を考案-私は CD8+ T 細胞、50 の 1 つの線量から成る皮下皮下接種試験アジュバントを添加したエンドトキシン OVA の μ g を投与(図 1)。フォロー アップの結果ワクチン接種後 48 時間は、CTL 応答を生成するアジュバントの能力の信頼性の高い証拠を提供します。この戦略によって脾臓 (または遠隔リンパ節) に CTL 活性を測定することによって応答の範囲と同様、予防接種後排出リンパ節における局所免疫応答の効力を評価することが可能です。

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プロトコル

本研究で使用されるすべてのマウスは、C57BL/6 背景からあった。すべての動物は、病原体フリーの条件の下で保たれました。(TierSchG BGBl ドイツの動物保護法の規範に従ってすべての実験が行われました。私 S 1105;25.05.1998) 許可番号 33.4-42502-04-13/1281 と 162280 の下で動物実験の倫理および州のオフィス (低いザクセン州事務所の消費者保護、食の安全) 低いザクセン州委員会によって承認されました。

1. CFSE 染色 OT-私は T 細胞と養子の転送

注: OT-私マウス固定 α と β 鎖一緒に OVA の免疫支配的なペプチドを認識する T 細胞受容体 (TCR) を表す transgenically 生成された動物は、SIINFEKL10,11。その結果、これらのマウスはかなり高い SIINFEKL 固有 CD8 数を持っている+ T 細胞 (97%)12通常または OVA 接種マウス (≤ 1%)13と比較した場合。

  1. トレーサブルな CD8 の分離 OT から+ T 細胞-私 T リンパ球特定Thy1 (Thy1.1) の対立遺伝子を発現するマウス。
    1. 6-9 週齢の OT を安楽死させる-私 CO2吸入によるマウスに続いて頚部転位14。手術ペンチや鉗子の助けを借りて体から皮膚を切り離す手術のハサミで皮膚を切断することによって脾臓および主要なリンパ節 (鼠径部、腋窩、頸部ペアのみ) を分析し、各を含むペトリ皿 (60 x 15 mm) に配置、100 μ m 孔メッシュ カップ組織研削やセル リリース。
    2. 3-5 mL の完全 RPMI 培 (RPMI 1640 年 10 %v/v FCS、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 50 μ G/ml) 氷で保たれるペトリ皿 (それぞれ 1 つのメッシュ カップ) で維持されます。
    3. シリンジのプランジャーまたは同様の滅菌器の助けを借りて、臓器をマッシュ (前の切断は必要ありません) 15 mL 遠沈管の結果単一細胞懸濁液を収集し、。
    4. 4 ° C で 10 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。遠心分離で 10 mL の冷 PBS のセルを洗浄し、塩化アンモニウムのバッファー (ACK バッファー、市販) の 1 mL/脾臓にペレットを再懸濁による脾臓から赤血球を溶解させます。氷の上 1.5 分細胞をインキュベートし、その後 (前に、と) は遠心分離によって 10 ml の冷 PBS のセルを洗ってください。
    5. 再 1 ml の PBS (pH 7.2) 含む 5% ウシ胎児血清磁気分離のための同じ管でペレットを中断します。
  2. 磁気分離を実行する CD8 の負の淘汰に進みます+ T の製造元の指示に従って磁気分離キットを使用してセルまたはプロトコル15を公開します。
  3. CFSE 染色するには、まずカウント CD8 の数+ T OT から得られた細胞-私自動化された細胞カウンター (パーティクル カウンター) を使用してマウス。1-5 107セル/mL 37 ° C、15 ml の隼の管の光から保護で 7 分の 5 μ m CFSE PBS で 1-5 mL の量 x を染色します。
  4. 牛胎児血清の同じボリューム (1:1) をセルに追加することによって CFSE 染色を癒やす、光から保護されている 37 ° C でさらに 7 分間インキュベートするそれら。10 ml の PBS のセルを 2 回洗います。
  5. 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。3-5 x の 100 μ L の 10 の6セル/マウスを静脈内に注入するために 3-5 x 107セル/mL の PBS のセル番号を設定 (静注) 尾静脈を介して。
  6. 尾静脈注射を実行するには、適切な restrainers でマウスを固定します。背部区域と尾静脈血管拡張を許可する 1 〜 3 分のマウスから 20 〜 25 cm の間置かれた赤い光ランプを使用して注入するマウスの尾を温めます。
    注: これは簡単静脈検出と細胞懸濁液の管理に役立ちます。
  7. (マウスとランプの間に置かれた手) でもマウスのホットし、尾静脈がはっきりと見える、インジェクションに進むではないです。25 ゲージ針161 mL 注射器を使用して水平または背の尾静脈にセルを挿入します。

2. 予防接種 (補助 + 遠藤無料 OVA)

  1. OT を移植されたマウスを置く-私は麻酔室で (ステップ 1.7、図 1) を細胞し、酸素のイソフルラン麻酔マシン14管理します。
  2. マウスを麻酔下で完全に眠っているとき、チャンバーから取り出すし、臀筋浅(外側腰部) にきれいな注入を行うために電気髪のナイフを使用して領域のマウスの毛皮を剃るアプリケーション領域の景色の良い。
  3. ワクチン、25 ゲージ針を使用して剃毛エリアでサウスカロライナの 50 μ L を注入します。

3 フローサイトメトリー解析のための汚損およびリンパ球の分離

  1. 脾細胞およびリンパ球の分離
    1. 頚部転位続いて CO2吸入ワクチン接種マウスを安楽死させます。
    2. 排水、遠くのリンパ節や脾臓を抽出し、100 μ m 孔メッシュ カップ組織研削と細胞のリリースを含む別のペトリ皿に配置します。1.1.2 1.1.3 からの手順に従います。
    3. 遠心分離後、上清をデカントし、再残骸 PBS の同じボリューム (約 100 μ L) の細胞ペレットを中断します。
  2. フローサイトメトリー解析のため染色
    1. 15 mL 遠心管中の表 1に示されている濃度で染色抗体を含むマスター ミックスを調製、染色ミックスを集中してこのように 2 倍を降伏します。サンプルあたり 100 μ L を持っているマスター ミックスの十分な量を準備します。セルと 1:1 のマスターの組合せをミックスし、4 の ° c で 30 分間インキュベートします。
      注: サンプルあたり最終染色巻 200 μ L (抗体のマスターの組合せの細胞ペレット 100 μ L の 100 μ L) をする必要があります。
    2. 1.1.3、10 mL の PBS を 2 回追加するで説明するよう 2 回遠心分離によって細胞を洗ってください。
    3. 0.5 - 1 染色細胞を再停止集録および流れの cytometer チューブへの転送停止用 mL の PBS。常に氷の上のサンプルを維持し、光から保護されています。

4. フローサイトメトリー

  1. 常に 70-100 μ m のフィルターを使用してセルのサンプルがプレフィルターです。
  2. 表 1 (ビーズまたは細胞) に詳細な fluorophores の単一の染色補正コントロールを準備します。
    注: 補償する必要がありますの cytometer または分析ソフトウェア17,18,19で実行し、すべてのサンプルに適用されます。
  3. 図 2にゲートの戦略に従います。前方散乱領域 (図 2 a)、もう一度広い側の散布面積 (SSA は、図 2 b) ダブレットを除外するために対側方散乱と前方散乱の高さで簡単にゲート集団。
  4. 門真 CFSE を差別するために BV 650 (自動蛍光) FITC (CFSE) 対をプロットすることによって図 2 bから人口は高自動蛍光細胞から細胞を染色しました。ビーズや補正コントロールに BV 650 に共役抗体で染色のセルが含まれます。OT を門に FITC 対 BV 650 のこのプロット (図 2) を使用-私 CFSE は細胞を染色します。
  5. 受信者マウス対ドナー由来細胞を区別するために Pe Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) を APC (CD8) 対の図 2 Cから人口をゲートします。
    注: セルに由来する OT-私 WT (C57BL/6、受信者) マウス由来細胞は Thy1.2+ (CD90.2) (図 2 D) に対し、ドナーのマウスは Thy1.1+ (CD90.1)。いくつかの研究所がある OT-私 Thy1.2 バック グラウンドで WT (C57BL/6)、Thy1.1 のマウス。この場合は OT の Thy1.2 抗体を使用する必要が-ゲート携帯ですね。
  6. CD8 を再ゲート+細胞 Thy1.1+人口 APC (CD8) 対 BV 450 (CD4) で構成されるゲートにプロットして (図 2 e)。
  7. CD8 のヒストグラム表示を使用して、図2 e ゲート人口を表示+ CFSE (FITC、530/15 チャンネル - 青色レーザー-)、細胞増殖の人口門 10 から強度を含む2レベルまで、コントロール分裂していない人口は (強度 10 〜5、CFSE 染色と流れの cytometer の電圧設定の有効性に応じて) (図 2 f)。
  8. マーカーにする、(図 2 には表示されません) 付加ゲート プロット FITC 対 L/D (450/20 チャンネル、紫外レーザー) 増殖の評価に並列に死んだ細胞を評価するために。
  9. 補正コントロールのイベントの少なくとも 5000 と流れの cytometer でサンプルから 10.000 イベント (図 2E、ゲート) を取得します。低または中程度の流れの cytometer を実行 (20.000 イベント/秒の流量を超えない)。

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結果

CTL の発電容量をに対して転送 OT の増殖を測定することによって評価我々 異なるアジュバント (その ADJ1 および ADJ2) の組み合わせを使用して治療法をテストするために-私は CD8+ T 細胞のフローサイトメトリー (図 2)。このため、以前ドレイン リンパ節および脾臓 (表 1) から分離された細胞を染色しました。CD8 の増殖を測定することによって+ T 細胞リンパ節および脾臓、その ADJ1、単独で OVA または PBS コントロールに比較するとドレイン リンパ節 (図 3) の ADJ2 の容量世代より高い CTL を確証することができました。対照的に、我々 が観察している+ T ない細胞その ADJ1 だった脾 CD8 による増殖の高いレベルを示すに対し、ADJ2 全身コンパートメント (脾臓) の CTL 応答を生成することが...

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ディスカッション

現代のワクチンは、理想的にしまいこむ精製抗原とアジュバント、リポソーム、ウイルス様粒子、ナノ粒子やライブのベクトルのような配信システムの可能な追加です。ワクチンを設計するときの重要な側面は、臨床医学のニーズによると右の補助を選択することです。範囲の一部は好む細胞性免疫応答 (またはその両方) と体液性、全身性免疫反応 (またはその両方)、対ローカルの選挙とターゲット人口のワクチンを生成する必要がありますメモリの種類を含むことができます。術後評価の 1 つの重要な側面は、急速に CTL を生成する能力を決定することです。ここで急速に OT を測定することによって CTL 応答の体内マウス モデルの機能を特定するための既に知られている手法に基づく方法を提案-私は CD8 T 細胞増殖。このメソッドは、アジュバントによって免疫応答能の予測 (OT の増殖-私は T 細胞) だけ 4 日間。このメソッドをさらにアジュバント免疫応答 (全身対ローカル) の観点からの操作とその効果的な行動の比較が容易になります。ここでは、異なるアジュバント治療 (その ADJ1 対 ADJ2) 予防接種、免疫応答に及ぼす影響について例を示した我々...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

私たちの技術的な助手にお世話になっております: u. Bröder、h. Shkarlet 実験手順の中で私たちを助けた。この作品は、部分的 (UniVax、契約番号 601738、TRANSVAC2、契約番号730964) EU 補助金及びヘルムホルツ協会助成金 (ハイ-IDR) によって賄われていた。資金源に影響しなかった研究デザイン、原稿や文書の提出する決定の世代。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BD LSR Fortessa Cell AnalyzerBDスペシャルオーダーフローサイトメーター
CFSEMolecular ProbesC34554Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation KitBiolegend480007手つかずのCD8 T細胞のネガティブセレクションのための磁気分離ビーズと抗体。
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitationMolecular ProbesL23105Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7eBioscience25-0900-82抗体
APC 抗マウス CD8a 抗体BioLegend100712抗体
BV421 ラット 抗マウス CD4BD740007抗体
Z2コールター 粒子数およびサイズアナライザーベックマン・コールター9914591DAセルカウンター。Z2 全自動粒子/細胞カウンター
EndoGrade オボアルブミン (10 mg)Hyglos(ドイツ)321000オボアルブミン エンドトキシンフリー試験済み。
セルストレーナー100µm ナイロンCorning352360セルストレーナー (100 & micro;mポアメッシュカップ)。
サンプルバイアルベックマン・コールター899366014Z2自動
カウンターC57BL/6マウス用サンプルバイアル (CD90.2)ハーラン(ロスドルフ、ドイツ)会社は現在、Envigo
OT-I(C57BL/6バックグラウンド、CD90.1)ハーラン(ロスドルフ、ドイツ)私たちの動物施設で近親交配しています。現在、Envigo
FACSチューブFischer(Corning)14-959-5Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubesFischer(Corning)05-527-90Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS(500 mL)Fischer(Gibco)20-012-027Gibco PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、pH 7.2
赤色ランプ(加熱ランプ)Dirk RossmannGmbH(ドイツ)405096加熱赤外線ランプ(100ワット)
IsoFlo(イソフルラン)Abbott Laboratories(米国)5260.04-05。イソフルラン麻酔薬(250mLフラスコ)。
卓上麻酔器/CO2吸収剤付き移動式麻酔器Parkland ScientificV3000PKイソフルラン麻酔器。
RPMI 1640培地Gibco (ThermoFischer社製)11-875-093グルタミン配合塩基培地 (500 mL)
Pen-Strept 抗生物質溶液 (Gibco)Gibco (ThermoFischer社製)15-140-148Gibco ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco)Gibco (ThermoFischer社製)10082147ウシ胎児血清、認証済み、熱不活化、米国原産
ACK Lysing Buffer (100 ml)Gibco (ThermoFischer社製)A1049201塩化アモニウム ポタシウム (ACK) 全血溶解緩衝液、脾臓懸濁液中の赤血球溶解にも適しており、
プラスチック製ペトリ皿Nunc (ThermoFischer社製配布)15034060 x 15mm プラスチックペトリ皿、未処理
細胞塊フィルターCellTrics (Sysmex)04-004-2317セルトリクス®50 μM, 滅菌

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