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方法論記事

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

8.3K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/57442

⸱

2018年4月10日

 ,  ,  , 
1IVI-RMA New Jersey, 2Jefferson College of Biomedical Sciences, Thomas Jefferson University, 3Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。

要約

異数性胚は人間の不妊の主要な遺伝的原因です。これらのイベントのほとんどが女性の減数分裂の間としています、時代だけでが常に異数性胚の生成の危険性の予測ではないとはいえ、母親の年齢との相関します。したがって、遺伝子変異は卵形成中に不適切な染色体分配を考慮可能性があります。人間の卵子へのアクセスが研究目的に限られていることを考える私マウス卵母細胞減数分裂の間人間遺伝子の働きを研究するアッセイのシリーズが開発されました。まず、興味の遺伝子の変異と遺伝子のメッセンジャー RNA (mRNA)、前期私逮捕マウス卵母細胞に microinjected します。式のための時間を許可すると後、卵子は同期的に成熟減数分裂を完了するために放出される私。緑色蛍光タンパク質 (Gfp) などの蛍光レポーターのシーケンスを持つ mRNA をタグによって表現型の変化に加えて人間蛋白質のローカリゼーションを評価できます。たとえば、ゲインまたは機能の損失は、減数分裂エラーを修正する遺伝子プロダクトを挑戦実験の条件を確立することによって調べることができます。蛋白質の表現は内因性のレベルでないことを考えると、(すなわちノック制御しない限り、結果の適切な解釈を行わなければならないこのシステムはとりこませた人間蛋白質機能の調査に有利であるが、うち上下)、マウスのホモログがシステムに存在も。

概要

不妊症は、生殖年齢の1、そこからほぼ半分を求める医療2人の人口の 10-15% に影響を与える条件です。不妊症の病因は多様であるが、多因子の多くの場合、人間の最も一般的な遺伝的異常は異数性胚3です。異数性は、細胞内の染色体の正しい数の偏差 (ゲインまたはロス) として定義されます。ヒト胎芽における異数性の現象は、一般的な高齢出産4、5と増加します。この戦略の結果、増加注入率、流産率の低下と時間の短縮のため子宮の転送の唯一の染色体正常 (欠) 胚の選択の利点を強調している 4 つのランダム化比較試験妊娠6,7,8,9を達成します。したがって、人間の異数性の病因を理解すること、生殖補助医療に重要な意味を持つことができます。

染色体異常で着床前遺伝子検査は不妊治療に有益であるが、染色体異常の発生の理解はまだ欠けています。減数分裂期の染色体異常 (配偶子生産の間に由来) と母親の年齢、しかし、いくつか女性存在異数性胚率の恵まれた時代4の平均レートを逸脱した正の相関関係があることを広く受け入れられています。これらのケースは、年齢だけが常に異数性胚を生成するリスクの予測ではないことをお勧めします。他の要因は遺伝子変異など胎児の異数性のリスクを増加させる役割を果たす可能性があります。

卵母細胞の減数分裂の間に異数性の遺伝子の変形の潜在的な貢献の調査の重要な側面は、減数分裂遺伝子機能を迅速に評価するシステムを設計することです。倫理的な制約と制限付きアクセスのため、卵子を使用してこれらのテストを実行する実用的ではありません。マウス卵母細胞を使用して、これらの問題を回避ことができます、ここで減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために試金のシリーズ私は説明しました。マウス卵人間蛋白質の局在化の可視化し、野生型および変異人間蛋白質の異所性発現結果いずれかのかどうかを判断するために使用によって興味の遺伝子の変形のためメッセンジャー RNA (mRNA) のコーディングを microinjecting、異数性につながることができる表現型の変化。これらの表現型は、動原体と重要な減数分裂 i 中期の染色体の整列をサポートすることができない妹に不適切に接続する微小管の増加、利得と機能の損失を調査するこのプロトコルを使用することができます。よう卵母細胞の減数分裂のキー イベントに挑戦する実験的条件を確立することによって遺伝的変異は、建物と染色体の整列10 をスピンドルします。

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プロトコル

1. 分子クローニング

  1. 興味の遺伝子のフルレングスのコード配列を取得およびプラスミッドの in vitro転写 (pIVT) ベクトル11。
    注: 完全長 cDNA クローンは、さまざまなベンダーから市販されているまたは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を生成することができます。国立生物工学情報 (NCBI) オンライン リソース センターがヌクレオチドから遺伝子のトラン スクリプトのシーケンスを提供し、タグ付きの発現順序 (EST) データベース。蛋白質の容易にするため、可視化と表現のレベル、緑色蛍光タンパク質 (Gfp) の融合または別の適切な蛍光タグの解析クローニング法で必要があります。
  2. 検証済みのクローニング法を使用して、pIVT の複数のクローン作成領域に興味の遺伝子のコーディングのシーケンスを挿入します。分子クローニングの詳細な説明と必要な手順は以前説明した12をされています。
    注: 遺伝子融合製品を生成する場合は、クローニングが適切なリーディング ・ フレームであることを確認します。
  3. グロビンのプライマーを使用して正しい遺伝子挿入、適切なフレームの融合およびポリメラーゼ誘導点突然変異が作成されなかったことを確保するため、構成をシーケンスします。
    注: サンガー DNA シークエンス装置が利用できない場合、多くの企業は、低コストの DNA シーケンス オプションを提供します。
  4. 単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) または挿入/削除 (オクターリピート) を生成する場合は、DNA を mutagenize します。DNA の変異は、以下手順 1.5 1.7 で説明されます。野生型のコンス トラクターに 1.7 の線形化手順に進みます。
  5. 突然変異誘発のプライマーを設計し、製造元のプロトコルごとの変異の構造を生成する突然変異誘発 PCR の反作用を完了します。Pcr のサイト指示された突然変異誘発は前述の13をされています。さらに、多くの企業は、プロトコルを含むサイト指示された突然変異誘発キットを提供しています。
  6. 人為の DNA を細菌のホストに変換します。分離し、プラスミドを浄化します。
    注: 多くの企業は、簡単に分離し、プラスミド DNA を浄化するために使用できるキットを作る。に応じてメーカー プロトコルに従ってください。大腸菌などのグラム陰性細菌株を使用している場合は、エンドトキシンを除去するキットを使用することをお勧めします。
  7. 目的の SNP または塩基の導入を確認する標準のサンガー DNA シーケンスを用いた細菌の形質転換体からの DNA の分離をシーケンスします。
  8. 精製の DNA の単一の制限の酵素の消化力を使用して最終製品をリニア化します。
    注: pIVT ベクトルには複数単一酵素プラスミド Addgene 14地図に記載されているサイトをカットが含まれています。
  9. 製品は agarose のゲルの電気泳動による線形であることを確認します。Agarose のゲルの電気泳動の方法論は、定義された14を以前されて。
    メモ: すべての残りの手順使用してバリア (フィルター) ピペット ヒントと RNase フリー材料安定かつ高品質な RNA の生産を確保するため。
  10. 検証済みの DNA クリーンアップ プロトコルまたはキットを使用して消化製品を浄化し、30 μ L RNase/DNase 自由な水に溶出します。
    注: シリカ マトリックス スピン列ベースのキットは高品質でお勧めは、DNA を精製しました。に応じてメーカー プロトコルに従ってください。
  11. 体外製造元のプロトコルに続く T7 ポリメラーゼを用いた DNA を転写します。
  12. 浄化し、RNase/DNase 自由水製造元のプロトコルに続くシリカ マトリックス スピン列に基づく核酸精製キットを使用しての 30 μ L の RNA を溶出します。
  13. 変性アガロース電気泳動ホルムアルデヒドを使用して最終的な RNA 製品サイズを確認するを実行します。1.13 1.22 手順14を参照してください。(図 1)。
  14. 水、溶解するまで 72 mL に 1 g アガロースを加熱してゲルを準備し、60 ° C に冷却
  15. 10 X モップ 0.4 M モップ (pH 7.0)、0.1 M 酢酸ナトリウム、0.01 M EDTA を追加して連続したバッファーを準備します。
  16. 10 X モップ冷却アガロース溶液をバッファー、および 37% ホルムアルデヒド (12.3 M) の 18 mL を実行しての 10 mL を追加します。
  17. カースト ゲル ゲル化コンテナーにアガロース溶液を注ぐことによって。10 μ L を収容できる大きさのくしを使用します。後ゲルを設定している、触れること会社、櫛を慎重に取り外します。
  18. ゲル電気泳動槽をアセンブルし、十分な 1 X モップ連続したバッファー、ゲルが完全に覆われていることを確認を追加します。
  19. RNA のサンプルを準備するには、ホルムアルデヒドを含むローディングの染料の 0.5 X ボリュームに RNA の 1 μ g を追加します。
  20. エチジウム ブロマイドを 10 μ G/ml の濃度で RNA ソリューションに追加します。
  21. 70 ° C、5 分の RNA 試料溶液を変化させなさい。
  22. 滅菌を使用して、10 の μ L フィルターのヒントについては、ロードの分子量マーカー 5 μ L、5 μ L の RNA のゲルの別の井戸に試料や、色素がゲルの長さの少なくとも 3 分の 2 を移行まで 5 V/cm で electrophorese。
  23. UV トランス照明のゲルで RNA を視覚化します。RNA は、分子量マーカーを比較することによって適切なサイズを確認します。
  24. 濃度と RNA の純度を測定するには、紫外線分光光度計の上で滅菌 10 μ L フィルター チップを使用して浄化された RNA の 1.2 μ L を転送します。
    高品質の RNA には A260/280 (1.8 2.2) ・ 260/230 の吸光度比は (> 1.7) それぞれ。
  25. 滅菌 0.5 μ L 遠沈管 (3-5 μ L/チューブ) に 10 μ L フィルター ヒント、因数の残りの浄化された RNA を使用してください。マイクロインジェクションの準備ができるまで-80 ° c チューブを格納します。
    注: 500 ng/μ L の最終注入濃度は最適な出発点です。1:2 で RNase フリー H20 マイクロインジェクション マイクロインジェクション ピペットで RNA の粘着性を減らすために前に RNA を希釈することをお勧めします。

2 動原体微小管添付ファイルの分析

  1. 卵母細胞をマイクロインジェクションの等しいグループに分割します。
    注: 採卵、転送、マイクロインジェクション、成熟の詳細に説明されてゼウスで以前15。
  2. 実験的 mRNA に 1 つのグループと WT コントロールと PBS またはGfpとその他のグループを microinject mRNA。
    注: 500 ng/μ L は10で始まるに推奨される注入濃度です。注入量を制御するために picoinjector を使用できます。5-10 pL の注入量は15をお勧め。
  3. 胚品質鉱物油で卵 (100-150 μ m)、シャーレでの培養液のミルリノン無料 100 μ L ドロップに転送卵子の直径より大きいカバーの手またはガラス ピペットのオープニング式分注装置は少し口を使用して卵母細胞の減数分裂中期に十分な成熟を許可する 5% C02の 37 ° C で 7 時間孵化させなさいと私 (私に会った) 15。
  4. 上記のように、同じピペット装置を用いた培養後転送中古冷蔵最低限不可欠なメディア (MEM) コレクション中よくセンターの 700 μ L と 500 μ L H20 外リングを含むセンターよく器官培養皿に卵と場所は 7 分間氷の上の皿。
    注: 事前 MEM メディアをリラックスして卵子の治療前に少なくとも 20 分-20 ° C で臓器の培養皿でセンターもそれをお勧めします。
  5. 室温で 20 分間 1x PBS で 2% パラホルムアルデヒドの 400 μ L を含む透明なガラス スポット プレートのウェルにピペットの装置を使用してそれらを移すことによって卵子を修正します。
  6. 同じを使用して装置のピペット、400 μ L ブロッキング液 (PBS + 0.3 %bsa + 0.01% Tween 20 + 0.02% ナン3) とストアを含むスポット プレートに別のウェルに卵子を転送免疫染色を処理する準備ができるまで 4 ° c。
    注: の 4 ° C、カバーガラス スポット板パラフィルム蒸発を防ぐために、卵を保存します。
  7. 同じピペットなどの器具を使用して、スポットの新しい井戸に転送を卵母細胞含んでいる 400 μ L 透過ソリューション (PBS + 0.3 %bsa + 0.1% TritonX 100 + 0.02% ナン3) をプレートし、3 つを素早く転送卵子で 20 分間室温でインキュベート滴 400 μ L の任意の残留洗剤を削除する解決を妨げます。
    注: 9 も透明なガラス スポット プレートは単一の皿 (ステップ 2.4 2.5) 複数の治療を通じてグループを移動に適しています。
  8. 室温で光から保護加湿チャンバーで残りの各種手順を実行します。中型のプラスチック容器の使用は、湿気があるペーパー タオルとアルミ箔でカバーが並んでいます。
  9. 卵母細胞を 30 μ L ピペット装置を使用して、転送 96 ウェル プレートと 10 分加湿チャンバ内の場所の蓋の解決を妨げます。
    注: 滴板に円形のインデントに配置されます。
  10. セントロメアとスピンドル、ピペットなどの器具を使用してラベルを付け、卵を 30 μ に転送する (ACA、クレスト) 抗セントロメア抗原を含む溶液をブロック (1:30) と抗アセチル化チューブリン (1: 1000) し、少なくとも 1 時間インキュベートします。
  11. 10 分解決を妨げる 3 つの 30 μ L 滴を介して転送することによって卵子をすすいでください。
  12. ピペット装置、転送卵子を用いて 30 μ L にブロッキング溶液で二次抗体抗体 (抗ひと IgG 1: 200、1: 200 抗マウス IgG) 上で使用する無料のドロップし、1 時間孵化させなさい。
  13. 3、30 μ L の 10 分洗浄手順を繰り返します手順 2.11 で説明したソリューションをブロックします。
  14. 3-5 μ L 中含む DAPI をマウントにピペットの装置を使用して、卵を転送 (5.9 μ g/μ L) ガラス顕微鏡スライドの上。
  15. 卵母細胞の破砕を防ぐためカバー スリップのコーナーにワセリンの 4 小滴 (ピンの頭のサイズ) を配置します。
  16. ダウン スライドにカバー スリップ石油ゼリー側をそっと置きます。
  17. シールの coverslip のエッジ マニキュアをオフにし 5 分間乾かします。
  18. 共焦点顕微鏡による処理まで、光から保護されて、4 ° C でスライドを保存します。
    注: は、取り付け中、coverslip、マッチの屈折を利用されている顕微鏡の対物レンズを確認します。材料は以前されている推奨の取り付けは、 15をについて説明します。
  19. 画像の小さなステップをキャプチャ、共焦点顕微鏡による 40 63 × 対物卵母細胞 (≤ 1 μ m) 作業目的とイメージ中期スピンドルの地域全体の最適化された z 平面で。
    注: 2.11 のステップで使用される特定の二次抗体に基づくすべての 3 チャンネルのイメージを確認します。≥ 4 と 3 のズーム画像は十分な解像度に最適です。1 μ m のステップ サイズは、微小管と体マウス卵母細胞で明確に可視化を提供します。イメージをキャプチャするための手順は、顕微鏡から異なります。顕微鏡設定の構成方法の手順については特定メーカー共焦点のユーザーズ ガイドを参照してください。
  20. 次の以下の手順による 2.21 2.23 イメージング ソフトウェアを使用して動原体微小管の添付の状態を識別します。
    注: 次の手順説明画像 J (NIH) 無料ダウンロード可能なソフトウェアを使用してこの手順は、ただし、代替のイメージング ソフトウェアを使用できます。されていた種類の添付の状態は、 16を定義されています。
  21. 画像 J ツール バーにファイルをドラッグすると、画像を開く。
  22. 開設の z シリーズを全チャンネル表示 (DNA、動原体、及びスピンドル) [サブ] タブで「色」「チャンネル統合を」、「イメージ」のドロップ ダウン メニューで利用可能なをクリックして。
  23. 切り替えを使用すると、画像の下部に、各 z スライスを移動し、動原体微小管添付ファイルを決定します。以前の説明はされている詳細な添付ファイル説明16

3. 染色体配置の課題分析

  1. 2.3 の手順で説明されているようにピペットの装置を使用して、ミルリノン無料文化中油滴 100 μ L に卵子を転送し、卵母細胞の減数分裂中期に十分な成熟を許可するように 7 時間孵化させなさい私 (私に会った) 2.3 17 の手順で前述のよう.
    注: 卵母細胞成熟、マイクロインジェクション、コレクションの手順を概説した15。手順 2.1 2.2 コントロール、および RNA マイクロインジェクション濃度で添付ファイルの試金のプロトコルを参照してください。
  2. 同じピペットなどの器具を使用して、転送センターよく器官培養卵母細胞でセンターも、400 μ L H20 周囲のリングである [100 μ M] を含む含む 700 μ L 培養液中の料理し、37 ° C 2 時間インキュベートします。
  3. モナス トロール 100 μ CZB 培地の 3 つの滴を上記としてピペット装置を用いて卵を移すことによって洗い落として、700 μ L 培養培地 + MG132 を含む新しいセンターも器官培養皿に卵を転送 [5 μ M] 中心の 3 時間リング。外リングに 400 μ L H20 を追加します。
  4. 室温で 20 分間 PBS で 400 μ L 2% パラホルムアルデヒドを含む透明なガラス スポット プレートのウェルにピペットの装置を使用して、それらを転送することによって卵子を修正します。
  5. 転送の卵母細胞を固定後、400 μ L を含む、透明なガラスのスポット プレートの新しい井戸にピペットの装置を使用してブロッキング液およびストアまで 4 ° C での免疫染色の処理します。
    注: の 4 ° C、カバーガラス スポット板パラフィルム蒸発を防ぐために、卵を保存します。
  6. Permeabilize し、免疫細胞化学を介して卵母細胞 2.6 2.16 の手順で説明するようにラベルを付けます。
  7. 卵母細胞を共焦点顕微鏡 40 63 x 目的を使用して、キャプチャを画像 < 中期紡錘体の全体の地域をイメージを確かめて z 平面の 1 μ m のステップします。
  8. 染色体の整列を識別するためには、状態は、イメージング ソフトウェアを使用してイメージ ファイルを開きます。
    注: 次の手順説明画像 J (NIH) 無料ダウンロード可能なソフトウェアを使用してこの手順は、ただし、代替のイメージング ソフトウェアを使用できます。
  9. イメージをイメージ J コントロール パネルにドラッグします。
  10. 開設の z シリーズ (コントロール バーで画像 J ポイント ツール アイコンをクリックして利用可能な) ポイント ツールを使用してイメージをクリックすると画像でスピンドル極上にツールを置く彼らのそれぞれの z スライスで各スピンドル極端ポイントをマークします。キーボードのコマンド + t を押すことによって利益 (率 ROI) マネージャーの地域にこれらのポイントを追加します。
  11. 各 ROI マネージャーの特定のポイントを強調表示し、測定ボタンをクリックすると手順 3.10 で設定位置の特定の座標を決定します。これは、結果を提供するテーブルを含む x と各ポイントの y 座標。これらそれぞれ X1、Y1、および Y2、X1 のポイントになります。
  12. 次に、true Z 座標を決定します。これはスピンドル極が識別された z スタックで特定の z スライスのスライス数を乗算することによって (すなわち6 スライス #2) 個々 の各ポイントは、スタックの厚さ (すなわち1 μ m) を (例: スライス 2 x 1 μ m = 2)。これらそれぞれ Z1 と Z2 のポイントになります。
  13. ピタゴラスの定理の式を使ってスピンドル長さを決定 (2 + b2 = c の2) 以前に定義したを使用して x、y、および z 座標を 3.11 3.13 の手順から。最終的な長さは、各スピンドルに等しい。
    √((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)
  14. スピンドル midzone を決定します。これはスピンドルの長さの 1 つの半分として計算されます。画像 J ツール バーの線アイコンをクリックして画像 J で [線] ツールを使用して、主軸 midzone は、1 つのスピンドル極から線を引きます。長さは、イメージ J ツール バーに表示されます。
  15. ライン計測ツールを使用スピンドル midzone から染色体の距離を評価することによって染色体位置揃えの状態を決定します。画像 J ツール ・ バーの線アイコンをクリックして利用できる [線] ツールを使用して、染色体にスピンドル midzone から線を引きます。長さは、イメージ J ツール バーに表示されます。スピンドル midzone から 4 μ m より大きい染色体は、不整列18と見なされます。

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結果

培養後、A260/A280 率 (1.8 2.2) と分光光度計を使用して測定したとき A260/A230 比 ≥1.7 高品質 RNA があります。図1 図の試験管内での移行-変化の agarose のゲルの電気泳動後 RNA を生産します。パターンやサイズの複数のバンドを持つサンプルで塗られるバンドが汚染またはサンプルの劣化のことを示します。また、複数のバンドは、mRNA を完全に変性していないか、開始のプラスミッドは完全に線形補間されるのではないを示す可能性があります。MRNA は、mRNA体外の安定した表現を可能にする pIVT に組み込まれているポリ adenylated テールのため予想より大きな実行されます。マイクロインジェクションの後は、均一な注入量と蛍光発現レベルを確保することをお勧めします。図 2の写真は、前期Gfpを均一に注入した私逮捕卵母細胞を示しています。一...

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ディスカッション

病気に関連付けられている人間の遺伝的変異の迅速かつ増加の識別のための生物学的意義を評価するシステムが確立されているが不可欠です。人間の卵子は貴重なまれな、人間の精子で遺伝子操作を受けやすいので人間減数分裂ポーズ特定課題におけるタンパク質の機能を理解します。マウス卵母細胞は減数分裂遺伝子機能10,23を評価する貴重な哺乳類モデル システムです。このモデルは、女性に影響を与える可能性がありますどのように遺伝的変異を理解するために有用である一方、減数分裂ひと生殖細胞に類似したを受ける低コストで操作可能の卵子の容易に利用可能なソースを提供しながら人間の卵を使用しての impracticalities をバイパスします。不妊です。

これらのメソッドは、マイクロインジェクションを介してマウス卵母細胞の人間蛋白質の異所性発現を採用して、ので、最初コントロール、成熟は変わりません野生型 RNA 濃度を確立する重要です。成熟速度があることをお勧めしますがベースライン パラメーター、お...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、アメリカ生殖医学会およびチャールズとラトガーズ大学でヨハンナ ブッシュ記念基金研究助成金によって支えられた、k. s. A.L.N. に NJ の州立大学は、N.I.H. (F31 HD0989597) からの助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 mL Seal-Rite PCR tubeUSA Scientific1602-4300
1 kb DNA LadderThermo ScientificSM0313
100 bp DNA LadderThermo ScientificSM0243
6X DNA loading DyeThermo ScientificR0611
9-well glass spot plateThomas Scientific7812G17
Agaroseシグマ アルドリッチA9539
ウシ血清由来アルブミン シグマ・アルドリッチA3294 
Alexa-fluor-568 抱合型抗マウスIgGThermo ScientificA210501:200 希釈
Alexa-fluor-633 抱合型抗ヒトIgGThermo ScientificA210911:200 希釈
アンピシリンVWRAA0356
防振テーブルTechnical Manufacturing Corp任意の標準モデル
抗アセチル化チューブリン抗体Sigma AldrichT74511:100 diution
抗セントロメア(CREST)抗体抗体 Incorportated15-2341:30 希釈 
バリア(フィルター)ピペットチップThermo ScientificのAM12635お使いのピペッターのブランドと互換性があることを確認してください。これらはEppendorfブランドのピペッターと互換性があります。
BD Difco 脱水培養液: LB 寒天、Miller (Luria Bertani)Fisher ScientificDF0445-07-6
BD Difco 脱水培養液: LB Broth, Miller (Luria Bertani)Fisher ScientificDF0446-07-5
毛細管チューブ SutterB100-75-10
Center Well 臓器培養皿VWR25381-141
CO2 タンクインキュベーター
用 共焦点顕微鏡ツァイス任意の標準モデル
遠心分離機 (冷却能力付き)トーマス・サイエンティフィック任意の標準モデル 
カバーガラス 11 x 22 mmトーマス・サイエンティフィック6663F10
カバースリップトーマス・サイエンティフィック6663-F10厚さは特定の顕微鏡によって異なります
DAPIシグマ アルドリッチD9542
DEPC H20ライフテクノロジーズ AM9922
デジタルドライバスサーモサイエンティフィック888700001
イージー A ハイフィデリティクローニング酵素Agilent600400DNAクローニング用 
pIVTを直鎖化するための酵素New England BiolabsNdeIまたはKasIを使用できます
臭化エチジウムThermo Scientific155585011
蛍光顕微鏡 任意の蛍光顕微鏡を使用することができます
ホルムアルデヒド (37%)サーモフィッシャーサイエンティフ9311
ムアルデヒドRNAローディング色素アンビオン8552
つや消し顕微鏡スライド(未充電) 25X75 mmフィッシャーサイエンティフィック12-544-3
全長cDNAクローンオープンリーディングを提供する任意のベンダーから入手できますフレームクローン
ゲル電気泳動装置バイオ・ラッド任意の標準モデル
ガラス パスツール ピペットフィッシャーサイエンティフィック13-678-200
pIVTコンストラクト5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. カスタムオリゴヌセロチドを生成する任意の会社から購入することができます
pIVTコンストラクト5 '-ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3 'は、カスタムオリゴヌセロチドを生成する任意の会社から購入することができます
ピペットを保持しているエッペンドルフ930001015Vacutip
加湿チャンバータッパーウェアは、
Illustra Ready-To-Goを使用することができますRT-PCRビーズGEライフサイエンス27925901
インキュベーターCO2およびウォータージャケット技術を搭載した任意の標準モデル
倒立顕微鏡ニコン製機器任意の標準モデル
画像J(NIH) ソフトウェアNIH画像解析ソフトウェア
96ウェルプレートの蓋Nalgene Nunc International263339
低接着性0.5mL微量遠心チューブScientific1405-2600
MacVector MacVectorシーケンス解析ソフトウェア
MG132SelleckchemS2619
顕微鏡スライドFisher Scientific12-544-3 
ミレニアムRNAマーカー-ホルムアルデヒド アンビオンAM7151
ミルリノンシグマ-アルドリッチM4659DMSO at 2.5mM
鉱物油Sigma-AldrichM5310使用済み 胚試験済み、滅菌ろ過済み
MonastrolSigma-AldrichM8515DMSO at 100 mM
マウスピースBiodisenoMP-001-Y
N2 タンク防振テーブル
用マニキュア;クリア任意のクリアマニキュアを使用することができます
ナノドロップ マイクロボリューム UV-Vis分光光度計サーモサイエンティフィック任意の標準モデル
NorthernMax 10X 変性ゲルバッファーライフテクノロジーAM8676
NorthernMax 10X ランニングバッファーライフテクノロジーAM8671
NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファーサーモ ScnentificNP0001
オルガン培養皿 60x15mmライフテクノロジー08-772-12
パラホルムアルデヒドポリサイエンシズ 
PCR サーマルサイクラーサーモフィッシャーサイエンティフィック4484075
ペトリディッシュ 139 mmサーモフィッシャー サイエンティフ501V
ペトリディッシュ 35 mmサーモフィッシャー サイエンティフ121V
ペトリディッシュ 60 mmファルコン BD351007
ピコインジェクターXenoWorks デジタルマイクロインジェクター任意の標準モデル
ピペットプーラーFlaming-Brown マイクロピペットプーラーモデルP-1000
pIVTプラスミドAddGene32374卵子の発現に適した空のベクターです。
妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピンLee BioSolutions493-10
QIAprep スピン Miniprep キットQiagen27104最大20 uLのプラスミドDNAの精製
QIAquick PCR精製キットQiagen28104
Quikchange II部位指向突然変異誘発キットAgilent 挿入および欠失のための200523突然変異導入キット
Quikchange lightning マルチサイト指向性突然変異導入キットAgilent 単一サイト変更のための210512突然変異導入キット
さみ(ファインポイント)ファインサイエンスツール14393
はさみ(ミディアムポイント)ファインサイエンスツールWP114225
シールライト 1.5 mL マイクロ遠心チューブUSA Scientific1615-5500
スライドウォーマー任意の標準モデル
分光光度計 (ナノドロップ)サーモフィッシャーサイエンティフィックND-ONE-W
実体顕微鏡任意の標準モデル
サブクローニング 効率 DH5a コンピテントセル サーモフィッシャーサイエンティフ18265017
シリンジBD バイオサイエンス3096231 ml, 27G(1/2)
T4 DNA リガーゼニューイングランド バイオラボM0202L
T7 mMessage マシン 高収率キャップ付きRNA転写キットLife TechnologiesAM1340
TritonX-100Sigma-Aldrichx-100
Tween-20Sigma-Aldrich274348
Tweezer (細点-サイズ5)ファインサイエンスツールSN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientifc10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mLThermo Fisher Scientifc15585011
UVP UV/White Lite トランスイルミネーターFisher ScientificUV95041501
Vectashield Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
ホル用グロビンフォワードプライマー USA ズ 577773 は

参考文献

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