超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

動物の異種移植モデルは、新規抗癌治療の前臨床試験のための不可欠なツールです。標準的なマウス異種移植片は、細胞、腫瘍の成長を監視するための効率的かつ簡単にアクセスできるサイトを提供するの脇腹の皮下注入に依存します。皮下のモデルの欠点は、腫瘍固有の生物学的特性は、¹を転移する可能性を制限可能性がありますの欠如です。このような制限は、直交異方性異種移植片に腫瘍細胞が転移の可能性がある²と関連する微小環境を提供するネイティブの組織のサイトでしみ込んでの使用によって克服します。同所性同種異種移植モデル元生物学的機能を維持し、前臨床創薬探索^3,4信頼性の高いモデルを提供します。がん細胞の組織向けの注入のために利用、確立されたセルラインまたは患者の腫瘍から患者由来の細胞です。がん細胞から確立された異種患者派生異種⁵と比較して原発の腫瘍から高の遺伝的分化を表わすかもしれない。これを考えると、患者由来同所性同種異種移植片の確立がん創薬における治療薬をテストするため最寄りの標準となった。

小児がんの芽 (NB)、同所性同種異種移植モデル原発腫瘍生物学を要約し、広がる NB^6、7の典型的なサイトへの転移を開発します。NB は、副腎や傍脊椎交感神経鎖に沿って開発しています。同所性同種移植の最も一般的な方法は、オープン トランス腹部手術を必要とします。このようなメソッドは、退屈な高い動物罹患率、複雑な回復期間です。高分解能超音波は、最近がん研究^8,9のいくつかのマウスモデルの開発中に腫瘍細胞の組織向けに利用されています。テクニックは、信頼性の高い、再現性の高い、効率的、かつ関連する転移性腫瘍異種移植片^10,11の確立のため安全です。

細胞と患者由来腫瘍細胞の超音波ガイド下のターゲット臓器局在と針注入による小児癌異種移植片の確立は示した¹¹です。マウス副腎を対象とした NB の技術が利用されました。ユーイング肉腫 (ES) は主に長い骨の大腿骨と骨盤の骨¹²などでよく見られる、骨のがんであります。症例報告では、主に骨の癌の成長は腎組織で実現可能かどうかを確認するのには同所性同種移植¹³腎サブ被膜場所が選ばれたことが示されています。腎サブ被膜腫瘍細胞の移植は、ES の¹⁴のための自発的な転移を勉強する有望なモデルとして利用されています。

すべての仕事は、米国ミシガン大学制度検討委員会 (ハム 00052430) に従って行われ、使用とケアの動物 (UCUCA) の大学委員会によって承認された手続きに適合しています。ユニットの実験室の動物医学 (ウラム) は、動物の世話を監督しました。

すべての仕事は、ミシガン大学制度検討委員会 (ハム 00052430) からの承認を得て行われ、すべて人間研究倫理委員会規程に準拠しています。ひと細胞は、潜在的汚染物質、従ってすべての特別な注意とあなたの機関で必要とされる適切なバイオ セーフティ プラクティスと見なされます。NSG マウスは、深刻な免疫不全と環境に一般的に見られる細菌によって引き起こされる病気になりやすいです。
常に注入し注射を実行するための材料を準備するとき厳密な無菌技術を使用します。

1. 細胞培養

1. 最小必須培地の確立されたラインの人間 NB セル (SH SY5Y、SK-N-BE2、IMR32) を成長 10% 牛胎児血清、2 mM グルタミン、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンと補われます。1 mM ピルビン酸と 0.075% NaHCO₃でさらに IMR32 細胞を補います。37 ° C、5% CO₂ 70-80% 合流_.ですべてのセルを維持します。
2. 成長 10% 牛胎児血清と 6 mM L グルタミン RPMI 培のヒト ES 細胞株 (TC32、A673、クロロフィル-25 日、A4573)。37 ° c、5% CO₂ 70 〜 80% 合流_.ですべてのセルを維持します。
3. 認証のためのすべての細胞を送信します。
   注: セル認証外の施設で行うと、受信確認を参照してください。

2. 患者由来腫瘍細胞の調製

1. 患者の同意と同意、局所制御と保全組織のストレージ ソリューションで研究所への輸送のため外科的切除を受けた患者から捨てられた人間 NB 腫瘍を収穫します。
   注: すべての患者のサンプルは解除識別、制度検討委員会のガイドラインに従って処理します。
2. 腫瘍腫瘍解離キットを使用してから単一患者由来がん細胞懸濁液 (UMNBL001、UMNBL002) を生成します。腫瘍の約 0.5 g を 5 mL の RPMI バッファー、酵素酵素 R の 100 μ H の 200 μ L と 25 を含む 100 mm 細胞培養皿に転送ひと腫瘍解離キットから酵素 A μ L。
3. 小さな断片 (2-4 mm ずつ) に腫瘍をミンチはさみと組織鉗子を使用しています。2.2 の手順でソリューションと、これらのフラグメントをミックスします。
4. 分解管に腫瘍混合物をピペットし、チューブを閉じます。チューブを反転、組織分解のスリーブの上に取り付けます。プログラム h_tumor_01 で実行します。
5. 断続的な製粉 15 分毎の回転ラックの 1 h の 37 ° C で得られた腫瘍細胞の懸濁液を孵化させなさい。
6. 新しい 50 mL のコニカル チューブに細胞懸濁液を転送し、RPMI の 10 mL を追加します。5 分の 314 x g で細胞懸濁液を遠心します。
7. 上澄みを除去し、RPMI 5 mL にペレットを中断します。40 μ m の細胞ストレーナーをこのソリューションを通過し、新鮮な 50 mL の円錐管に緊張したソリューションを収集します。5 mL の RPMI 培と一度このストレーナーを洗浄し、ペレットを収集するために 5 分の 314 x g で混合物を遠心分離機します。
8. ¹⁵計算盤を用いた細胞密度を測定します。上から、最終濃度が 4 × 10⁵セル/10 μ l RPMI で得られたペレットを中断します。この細胞懸濁液 5 μ L、5 μ L の各注入の細胞液の 10 μ L にマトリゲルを取る。
   注: RPMI 使用量は、細胞密度の測定によって異なります。たとえば、4 x 10 の⁵セルを指定した場合、得られたペレットの測定セル密度 RPMI の 10 μ L のペレットを中断します。

3. ルシフェラーゼは、がん細胞へのタグ付け

1. ウイルス上清 EF1a-Luc2-IRES-mCherry の 5 mL と 5 mL の幹細胞培伝達メディアの 10 mL を作る。1 x polybrene の 7.5 μ L を追加します。
2. ミックス 5 × 10⁶癌細胞情報伝達メディアで 100 mm 超低取り付けプレートのプレート。37 ° C、5% CO₂で一晩インキュベートします。
   注: 低接着プレートを使用すると、セルはプレートに付着しません。
3. 24 h 後ティッシュ文化フードの下のセルを含む 100 mm プレートを持参し、15 mL の円錐管に混合物を転送します。細胞ペレットを取得する 5 分の 314 x g で細胞懸濁液を遠心します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 1 mL で一度細胞ペレットを洗浄し、1% ウシ胎児血清 (FBS) を含む HBSS の 1 mL の細胞ペレットを中断します。
   1. ルシフェラーゼの細胞ソーティング (FACS) による蛍光活性化細胞での GFP 陽性信号に基づいてを並べ替え。プレート 100 mm 培養治療に並べ替えられた細胞料理し、70-80% の合流点、37 ° C、5% CO₂必要になるまでに維持します。
4. ルシフェラーゼ アッセイ キットとルシフェラーゼ信号を確認します。照度計互換性のある 96 の井戸あたりプレート 10 × 10⁴並べ替えセル ウェルし、37 ° C、5% CO₂で一晩細胞を孵化させなさい。24 h 後室温に 96 ウェル プレートを持参し、定常グロ試薬を 1:1 の比率で井戸の培養メディアに追加します。5 分間溶解し、発光分光光度計を読んでセルを許可します。
5. ティッシュ文化フードの下 100 mm ディッシュをもたらします。培養上清中のメディアを破棄します。2 mL の 1x PBS で 1 回洗浄を行う。
6. 0.25% トリプシンの 2 mL を追加し、2 〜 3 分のためのインキュベーターに 100 mm ディッシュを戻ります。2-3 分後に顕微鏡下で細胞を剥がれを確認、トリプシンを非アクティブ化する RPMI 8 mL を加えます。
7. 15 mL コニカル チューブ、ペレットを取得する 5 分の 314 × g で遠心分離細胞懸濁液を収集します。上清を捨てます。1 mL の 1x PBS で細胞ペレットを洗って RPMI 5 mL にペレットを中断¹⁵計算盤を用いたセル密度を決定します。Yhe の残りのペレットを取得する 5 分の 314 x g で細胞液を遠心します。
8. 濃度が 4 × 10⁵セル/10 μ l に RPMI でペレットを中断します。細胞懸濁液 5 μ L、5 μ L の各注入の細胞液の 10 μ L にマトリゲルを取る。

4. 超音波ガイド (NB) 副腎または腎サブ カプセル (ES) 注入

注: 超音波のすべてのプロシージャは、高解像度生体内でイメージ投射システムを使用して実行が。記載されている手順 22 55 MHz の帯域幅 40 MHz の中心周波数は、探触子が使用されます。

1. すべての注入手順 6-8 週齢免疫欠損 NSG マウスを活用します。
2. マトリゲルやハミルトンの 27 G 針 (1.25") を搭載するオートクレーブ注射器を冷やすし、22 G カテーテル (外径 0.9 mm、長さ 25 mm) 4 ° C で一晩
3. 氷の上 3 の手順で準備携帯ソリューションを配置します。
4. O₂ 2l/分で配信で 2% イソフルランを用いた誘導室でマウスを麻酔します。
   注: 適切な麻酔、活発な動きの欠如と自発呼吸のメンテナンスで決まります。
5. 麻酔、一度戻るとローション (ナイル) などと髭剃りを使用して動物の側面を depilate します。
6. 動物の鼻は、ノーズに置かれ、イソフルランを吸入しながら保護、動物を腹部側とイメージングのプラットフォームに転送します。
7. 乾燥を防ぐために動物の目の光の軟膏を配置します。テープの任意の不用意な動きを防止するためのマウス。
8. マウスの肝臓、上大静脈、脾臓、左腎臓、および超音波可視化を使用して隣接した左副腎を識別します。
9. 個人用保護具や滅菌条件のメンテナンスのため、滅菌手袋、マスク、キャップを使用します。超音波指導の下で慎重に皮膚を通して 22 G カテーテルを挿入、細胞注入のためのチャネルを提供する左副腎に直接筋肉をバックアップします。針を外し、カテーテルを場所に残します。
10. 負荷チルド ハミルトン注射器細胞液の 10 μ L で小口径の針が装備し、副腎のセンターに配置されているカテーテルを定位注射器をご案内します。
11. 対象となる副腎組織にセルを挿入します。マトリゲルを設定するを許可するように 1-2 分の場所に針を残します。ゆっくりと、カテーテル抜去後、針を抜きます。
12. 自分のケージに戻ってマウスを置き、マウスが胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻すことを確認します。
    注: この手法の低侵襲性質のため投稿手続き痛みは最小限ですが、まだマウスの健康チェックを日常的に監視されている」文に従う必要があります:「苦痛や予想外の印が識別される場合、コース中に実験の鎮痛やその他の医療に関する情報をあなたの施設の獣医支援ユニットにご相談ください。
    

記載されている手順を使用して、超音波ガイド下副腎への NB 細胞の注入は温水手術テーブルを装備した専用の処置室で行われました。腕と足のパッドは、マウス中心の活動 (図 1 a) を監視するために置かれました。動物に残ったイソフルラン吸入ノーズコーンを使用して下で麻酔をかけられました。高分解能超音波プローブを使用して、左の腎臓は腎臓 (図 1 b) にちょうど頭蓋の副腎で識別されます。針が直接可視化 (図 1) の下で副腎に進められたし。この手法の初期利用中メチレン ブルー染料、マトリゲルの混合物は、副腎の正しい局在を確認する使用されました。動物は生贄にされ、プロシージャの成功副腎カプセル (図 1) の下にメチレン ブルー色素の可視化による剖検で確認されました。

毎週の超音波と生物発光イメージング腫瘍生着と成長率を監視する使用されるモダリティであった。関心領域の生物発光イメージングは、10 の最小数を持つ光子/s/cm2/steridian (p/s/cm2/sr) として測定した6 108示す臨床実験9 (の十分な腫瘍サイズの図 2)。T -テスト発光の統計的に有意な増加を示したを使用して分析は 8 週間の期間で認められた(* p< 0.05; * *p< 0.001; * * *p< 0.0001)。超音波検査は、腫瘍面積および体積の非侵襲計測を許可しました。この発光測定と一緒に監視腫瘍生着と進行 (図 3)。同じようなプロシージャ腎サブ カプセル (図 4) に注入された ES 細胞に活かされています。

原発性腫瘍と転移は剖検時に得られた腫瘍の肉眼及び組織分析が特徴。組織サンプルは形態セル パターンの検討され、腫瘍特異蛋白質のマーカー (図 5図 6) のステンド グラスします。0-100 で見られる転移 62 100% ∼ NB 細胞株 (IMR32、SH SY 5Y、SK N BE2、UMNBL001、UMNBL002) の第一次腫瘍生着注入されたマウスの %。最も堅牢な転移が見られた SK-N-BE2 (33%) と UMNBL002 (100%)。NB の転移巣は、リンパ節、肝臓、肺、皮質骨だった。ES 細胞株 (A4573、A673、クロロフィル-25、TC 32) を 0-40 で見られる転移 60-100% からであったため生着を被膜腎サブ注入されたマウスの %。ES について転移のサイトには、リンパ節、皮質骨と肺が含まれています。最も堅牢な生着 (100%) と転移 (40%) は、TC 32 異種移植マウスで見られました。

図 1.マウス副腎のローカリゼーションおよび超音波ガイド下の NB の細胞移植します。(A) 高分解能超音波イメージング マウスの腹部臓器の副腎腫瘍細胞移植を許可しました。(B) 左の腎臓が確認されました。(C) 左副腎は周構造 (暗い) エコーとして左の腎臓に隣接します。針は、細胞の注入に続いて副腎に進められました。(D) マトリゲルとメチレン ブルー色素の混合物は、注入法の精度を評価するために使用されました。左の腎臓と副腎副腎カプセルとペリ副腎空間でマトリゲルとメチレン ブルー色素の代表的な前のヴィヴォイメージ。・ ファン ・ ノールトの許可を得てこの図が変更された R.A.ら。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2.生体内で腫瘍生着と成長率の生物発光イメージングします。(A) 人間の NB 副腎異種移植片生着と腫瘍成長のため 8 週間以上を監視しました。(B) 最大発光信号は、関心領域の内で決定しました。NB 細胞 (SH SY5Y、東北 32、SK N BE2) と患者由来細胞 (UMNBL001、UMNBL002) は、時間の経過と共に輝きと成長パターンを増加していた。8 週間の期間にわたって生物発光の増加は有意 (*p< 0.05; * *p< 0.001; * * *p< 0.0001)。・ ファン ・ ノールトの許可を得てこの図が変更された R.A.ら。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3.生体内で腫瘍生着と成長の超音波断層像です。超音波は生体内で腫瘍の進行を監視しました。超音波画像と 1 つ、2 つ、8 週間で対応する発光画像が表示されます。1 週間で生着は両方のイメージ投射様相で可視化しました。腫瘍領域とボリュームを超音波を使用して求めた。3 D 超音波画像は、調査の完了時に摘出した腫瘍をミラー化します。・ ファン ・ ノールトの許可を得てこの図が変更された R.A.ら。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4.マウス腎局在と ES 細胞の超音波ガイド下注入。(A) 発光は、腫瘍の輝きと成長を監視する使用されました。(B ・ C)動物は、局所浸潤腫瘍周辺腹部の構造を歪め、筋肉などの局所構造に侵入を開発しました。・ ファン ・ ノールトの許可を得てこの図が変更された R.A.ら。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5.NB と ES の異種移植腫瘍の腫瘍病理。(A) NB 異種移植マウスは、腹部臓器を歪んでいる副腎とペリ副腎腺のサイトでローカルで浸潤癌を持っていた。(B) 顕微鏡的 (20 X、バー = 50 μ m)、異種移植副腎腫瘍は人間 NB と一貫性のある形態的特徴を示した (クラスターの分化細胞を丸める角度)、時折擬似ロゼット形成 (矢印) を含みます。(C) 腫瘍組織は強いチロシン水酸化酵素 (NB 腫瘍マーカー) 陽性を示した (40 X、バー = 40 μ m の左側のパネルに示す染色陽性対照; 1: 100)。(D) ES 異種移植腫瘍浸潤の ES に一致する組織学的特徴を持っていた (40 X、バー = 40 μ m)、類上皮細胞を丸める角度のクラスターは、微細線維血管浸潤、卑下と隣接する腎を圧縮で区切られた (矢印圧縮;腎臓実質の残り)。(E) ES 腫瘍 ES 腫瘍マーカー CD99 強い膜免疫陽性反応を示した (40 X、バー = 40 μ m の左側のパネルに示す染色陽性対照; 1: 100)。・ ファン ・ ノールトの許可を得てこの図が変更された R.A.ら。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6.超音波ガイド下注入技術によって確立された異種移植片に開発された遠隔転移。(A) 発光イメージング副腎領域で検出された皮質骨転移腫瘍の NB を示します。(B) 顕微解析を示した転移性腫瘍 (矢印) 大腿骨近位部の皮質骨と骨髄腔を卑下 (4 X、バー = 400 μ m)。(C) チロシン水酸化酵素細胞質陽性転移巣を皮質骨 NB の (40 X、バー = 40 μ m)。(D) 患者由来同所性同種異種移植 (UMNBL002) 肝静脈内肝転移 (矢印) の顕微鏡観察 (矢印は内皮細胞を示します)、隣接する肝臓 (L) 柔組織を浸潤と (20 X、バー = 50 μ m)。(E) 神経芽細胞腫肺実質内の微小転移 (矢印) (40 X、バー = 40 μ m)。・ ファン ・ ノールトの許可を得てこの図が変更された R.A.ら。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

著者の開示があります。