Nicotinatmide アデニン酸 (NAD(P)H) + H + 組織サンプルで直接生成酵素の酵素活性の分布をマッピングするためのプロトコルについて述べます。
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この記事について
サマリー
要約
空間と時間における酵素活性のマッピングは、正常組織と病気での細胞行動の分子基盤を理解することにとって重要です。その場で代謝活性アッセイは、組織内の代謝活動の空間分布に関する情報を提供できます。ここで組織サンプルに直接酵素乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルいたします。乳酸脱水素酵素は消費グルコースが好気性または嫌気性解糖系によるエネルギーに変換するかどうかの決定が重要です。液乳酸および NAD は、凍結するティッシュ セクションを提供しています。高乳酸脱水素酵素活性と細胞はニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD) NADH と検出することができるプロトンの減少に基づいて提供される同時変換中、提供乳酸をピルビン酸に変換されます。nitrotetrazolium 青青い沈殿物として可視化した塩。マウス皮膚における乳酸脱水素酵素の活動を監視するための詳しいプロトコルについて述べる。このプロトコルを適用すると、乳酸脱水素酵素活性が皮膚内で静止の毛包幹細胞で高いことがわかった。マウス胚性線維芽細胞より培養胚性幹細胞の高い染色プロトコルを培養マウス胚性幹細胞に適用することを明らかにしました。新鮮単離マウス大動脈の解析では、大動脈に垂直平滑筋細胞における染色を明らかにしました。提供手法を使用して、新鮮なまたは冷凍の組織で陽子を生成する酵素の活性を空間的にマッピングすることができます。
概要
酵素が高または低活性を持つ、組織内の場所を理解する理解の開発および生理学のため不可欠です。謄本又はタンパク質レベルは、酵素活性の代理として使われます。このような研究は有益であることができます中、に、酵素の活動、翻訳後修飾、タンパク質複合体や酵素の細胞内局在性の存在などを決定するための重要なことができる情報は提供しません。酵素活性は直接計測するときにしばしばもはや組織内の高または低の活動と混合物または細胞の空間的分布内で個々 のセルについての情報が含まれて均質化タンパク質溶解液で監視されます。
ここで組織サンプル中の酵素活性の分布をマッピングするための詳しいプロトコルいたします。方法論は、テトラゾリウム塩を凍結するティッシュ1酸化酵素、還元酵素、脱水素酵素の活性のローカライズに使用できることを示す以前の研究に基づいています。これらのメソッドは、テトラゾリウム塩2,3に陽子が転送されるときに水不溶性ホルマザンが形成されます。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、NADPH と、陽子を生成し、テトラゾリウム アクティビティが検出されました。グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、欧州ヒラメ肝4肺5の 2 型肺胞細胞と
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プロトコル
記載されているすべての実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で動物ケア委員会によって承認されました。
1. 冷凍マウス皮膚のスライドを生成します。
- 機関のポリシーに従ってマウスを安楽死させます。
注: 防護服の制度のポリシーに従ってください。動物を含むすべてのプロトコルは、機関動物ケア委員会によって承認される必要があります。 - 動物の毛トリマーとマウスの髪を削除します。
- はさみを使用して皮膚の切開を行います。鉗子を使用すると、マウスから皮膚を持ち上げます。皮膚セクションを切り取るはさみを使用しています。
- 凍結試薬をコンパウンドで、cryomold を埋める (材料の表を参照してください)。
- 皮膚針鼻セクションを使用して塗りつぶされた cryomolds に鉗子を配置します。組織スライスは真皮、皮下・筋 (図 2) に表皮から皮膚の断面図を生成することは、肌を合わせます。
注意: 可能であれば、マウント実験と同じスライド上に切断し、一緒に処理できるので、同じ cryomold で一緒にマウスを制御します。泡を作成しないように注意してください。 - 氷バケットにドライアイスのブロックの平らな面に cryomold を配置し、凍結させます。スキンの向きを観察し続け....
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結果
我々 は以前マウス皮膚20の活性測定法の場での結果を報告しました。図 3のように、上記の手順で説明したときの毛包の基部に毛包幹細胞の乳酸脱水素酵素活性の高いレベルが続いていたを見ました。これらの調査結果は、毛包幹細胞を皮膚の並べ替えと並べ替えられた細胞の活性測定法と幹細胞コンパートメント高乳酸脱水素酵素活性を確認する蛍光性によって作動セルによって確証されました。
毛包幹細胞が高乳酸脱水素酵素活性を持つという我々 の調査結果に基づいて、我々 は培養胚性幹細胞の研究を拡張しました。マウス萌芽期の繊維芽細胞はフィーダー層としては、単独で、または胚性幹細胞の存在下で解析しました。媒体の吸気、培養細胞を分析して細胞が簡単に固定し乳酸脱水素酵素染色液を上記のように培養します。胚性線維芽細胞 (図 4.......
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ディスカッション
ここで説明する方法は、乳酸脱水素酵素や他の代謝酵素生成 NADH または NADPH 依存性の異なる種類の細胞、組織内または時間の経過とともに組織のさまざまな部分の活動を監視する使用できます。乳酸脱水素酵素は幹細胞と腫瘍の生物学を理解するための重要な酵素を個々 の細胞における乳酸脱水素酵素の活動を監視する機能はこの酵素の機能に重要な洞察を提供する可能性が高い。
他の方法論と比較してこのプロトコルの重要な利点の 1 つはタンパク質豊富なだけではなく、モニター酵素活性能力はより決定的なについてだけではなく、乳酸脱水素酵素の酵素が結果することができます。現在、実際には機能しているが。ここで説明している方法は、選択した蛋白質、例えば、細胞の系統マーカーのレベルは、乳酸脱水素酵素活性として同じ組織サンプルで決定されますので、免疫組織化学と結合できます。乳酸脱水素酵素の活動を監視するため、MRI を用いたアプローチと比較して提供されるプロトコルがそれがより高い空間解像度を提供し、高い酵素活性を持つ、組織内の特定のセルを決定するのに役立つことができます利点.蛍光基板に基づくマッピング代謝へのアプ.......
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開示事項
著者は開示する競合する興味を持ってないです。
謝辞
HAC リタ アレン財団 (http://www.ritaallenfoundation.org) のミルトン E. カッセル学者でもあった。この作業によって賄われていた補助金拍する国立研究所の一般的な医療科学 R01 GM081686、R01 AR070245、国立の研究所一般医療科学 R01 GM0866465、イーライ ・ エディス広い再生医療センター ・幹細胞研究 (からローズの丘と Hal Gaba 賞)、WEL および HAC にジョンソン総合がんセンターからアイリス カントール女性の健康センター/カリフォルニア大学ロサンゼルス校 CTSI NIH グラント UL1TR000124、白血病リンパ腫協会の影響賞を受賞します。この出版物で報告された研究は、賞を受賞番号 P50CA092131 の下で健康の国民の協会の国立癌研究所によって支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。HAC は、Eli およびエディス広い再生医療センター ・幹細胞研究、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の分子生物学研究所と UCLA バイオインフォマティクス部門間プログラムのメンバーです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 手術器具 | 安楽死させたマウスから皮膚を採取するための | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | フィッシャーサイエンティフィック | NC9511236 | マウスの皮膚を凍結するため |
| Tissue-Tek O.C.T.コンパウンド | フィッシャーサイエンティフィ | NC9638938 | クライオモールドの取り付け用 |
| アイスバケツ | フィッシャーサイエンティフィック | 07-210-106 | |
| ドライアイス | |||
| ポリジン接着スライド | フィッシャーサイエンティフィック | 12-545-78 | |
| 4% ホルマリン | フィッシャーサイエンティフィック | 23-245-684 | 水で希釈 |
| リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4 | |||
| ボルテックス | |||
| トリスベース | フィッシャーサイエンティフィック | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| フェナジンメトスルフェート | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| ニトロテトラゾリウム 青色塩化 | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| L-乳酸リチウム | Sigma-Aldrich | L2250 | 基板 |
| 37°C;Cインキュベーター(または組織培養インキュベーター) | |||
| ブラジル人!カウンターステイン | アナテック | 861 | カウンターステイン |
| 取付 メディウム | ベクターラボラトリーズ | H-5000 | |
| スライド用カバースリップ | Fisher Scientific | 12-544D | |
| 光学顕微鏡 |
参考文献
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan syste....
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再版と許可
