シナプス小胞 (SV) 神経シナプスでの細胞間コミュニケーションの中核機構は、サイクリングします。FM 色素取り込みと放出は、定量的 SV 遠藤と分泌の試金の主な手段です。ここでは、我々 は FM1 43ショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ) モデルのシナプスでサイクリングを駆動するためのすべての刺激方法を比較します。
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この記事について
サマリー
要約
FM 染料は、シナプス小胞 (SV) サイクルの研究に使用されます。これらの両親媒性プローブには、親水性の頭部と疎水性尾、水溶性膜脂質二重層を可逆的に出入りする能力を持つことがあります。これらのスチリル色素が比較的非水溶液中で蛍光性が細胞膜の外側のリーフレットに挿入、> 40 X 蛍光の増加します。神経シナプスにおける FM 染料は SV エンドサイトーシス、神経伝達のシナプス前の段階を可視化する強力なツールを提供する、内および SV プール間の人身売買とのリリースの SV エキソサイトーシスの中に内面化します。グルタミン酸作動性シナプスの開発と機能の主な遺伝モデルはショウジョウバエ変異条件の広い範囲で SV のダイナ ミックスを定量化する神経筋接合部 (NMJ) は、FM がイメージングを色素が広く使用されています。NMJ シナプス ターミナルは大きなシナプス ボタン イメージング アプリケーションに最適の美しい配列と、簡単にアクセスできます。ここで、我々 は比較対照ショウジョウバエ活動依存した FM1 43 色素取り込み/リリースを駆動する NMJ を刺激する 3 つの方法: 高 [K+] 神経筋組織を脱分極作用、2) 吸引電極運動神経の 1) お風呂のアプリケーションシナプス前の神経ターミナルと 3 を脱分極刺激) は、チャネルロドプシン亜種脱分極の光刺激、空間の制御のための遺伝子組換え発現を対象しました。これらの各メソッドは、利点と欠点 SV サイクルの遺伝の突然変異の効果に関する研究のショウジョウバエNMJ。これらの長所と短所それぞれの戦略に固有の方法論とともに、刺激アプローチの選択を支援するために説明します。蛍光イメージングに加え FM 染料は超微細構造レベルで SV 循環メカニズムを研究する透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いて可視化する電子密度の高い信号に photoconverted をすることができます。我々 は、共焦点の比較を提供および電子顕微鏡イメージングショウジョウバエNMJ 刺激、支援するためのさまざまな方法から将来の実験的パラダイムの選択。
概要
ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部 (NMJ) グルタミン酸作動性シナプスの美しく特徴モデルは、シナプス形成と遺伝的摂動1の広大なスペクトルを持つ関数の研究に使用されています。モーターニューロン ターミナルは複数の軸索分岐を多く拡大されたシナプス ボタンのそれぞれから成っています。これらの容量の大きい下肢 (最大 5 μ m) を含む制服グルタミン酸作動性シナプス小胞を含む神経伝達機械のすべて (SVs; 〜 40 nm の直径の) ゾル性細胞質の準備で容易に脱着可能なプール2。これらの小胞はシナプス前膜融合サイト アクティブ ・ ゾーン (AZs)、エキソサイトーシスがトランスのグルタミン酸神経伝達物質を仲介でドック-シナプス通信。その後、SVs は繰り返し exo/エンドサイトーシス サイクルのキス-実行のリサイクルやクラスリン依存性エンドサイトーシス (CME) を介して細胞膜から取得されます。ショウジョウバエNMJ は簡単にアクセス可能で、分離して SV サイクル変異体の特性の両方に適しています。前方遺伝スクリーンを使用した新規変異は SV サイクル3の重要な新しい遺伝子の同定につながっています。また、既に知られている遺伝子で始まる逆遺伝学的アプローチは、変異体の表現型4をサイクリ....
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プロトコル
1. 幼虫の接着剤剥離
- 10 部 1 部硬化エラストマー キット (材料表) から剤シリコーン ・ エラストマーをベース シリコーン ・ エラストマーを徹底的に混ぜます。
- (もはやべたべたする) まで数時間 22 x 22 mm ガラス coverslips エラストマーと 75 ° C のホット プレートに治療をコートします。
- 幼虫の解剖のための準備にカスタムメイドのプレキシ ガラス解剖室 (図 1の一番下) に単一のエラストマー コーティング ガラス基盤を配置します。
- 標準的な電極の引き手を使用して目的のテーパーを取得して先端サイズ ホウケイ酸ガラス毛管から接着剤ピペットを準備します。
- 優しくマイクロ ピペット チップ、そしてもう一方の端に、柔軟なプラスチック製のチューブ (1/32"内部の直径、ID 3/32" 外径、OD; 1/32"の壁の 2 フィートを添付材料の表)口 (P2 ピペット チップ) をフィッティングします。
- 幼虫の解剖に備えて接着 (材料表) の体積 (~ 20 μ L) が小さく、小さい容器 (0.6 mL エッペン チューブ キャップ) を入力します。
- (MM) に生理食塩水でチャンバー: 128 NaC....
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結果
図 1は、活動依存した FM 染料のプロトコルをイメージングのための作業フローを示します。実験は、その後使用される刺激方法に関係なく、同じ幼虫接着剤郭常に始まります。図 1 aは、神経と繰り返し hemisegmental 筋パターンを放射腹側神経索 (VNC) を示す切り裂かれた幼虫の模式図です。VNC は削除され準備を浴びて FM1 43 (図 1 b、ピンク) の 4 μ M ソリューション。準備は、活動依存した SV エンドサイトーシス (図 1cI-III) を介して色素をロードする 3 つのオプションのいずれかを使用して FM 色素の存在下で刺激されます。次に、FM 色素サイクリングには Ca2 +を使用して、逮捕されて-無料生理食塩水と FM 色素ロードされている特定.......
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ディスカッション
高 [K+] 生理食塩水脱分極刺激は、サイクリング、活動依存した FM 色素が可能性が高い少なくとも生理的29の 3 つのオプション、はるかに簡単です。この簡単な方法は、全体の動物のすべてのアクセス可能なセルを脱分極し、監督の研究を許可しませんので。ローカル高 [K+] 生食、マイクロ ピペットに適用することがありますが、これはまだ前/後シナプス細胞とシナプス関連グリアの可能性が高い1を脱分極します。別の主要な関心事は、その高 [K+] 脱分極ドライブの急速な形成物質研究で稀だけ見られている一括エンドソームです。ただし、一括エンドソームの形成は、突然変異によって29、本当の生理過程を示すブロック アクティブなメカニズムです。したがって、FM1 43 高 [K+] 偏光イメージングは、選択的にシナプスに一括エンドサイトーシスを研究に使用できます。吸引電極運動神経の電気刺激より制御された方法です。単一軸索のバンド.......
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開示事項
著者は競争の興味を宣言しません。
謝辞
この記事への貢献のための Broadie の研究室のメンバーに感謝いたします。この作品は NIH の R01s MH096832 と MH084989 へ有限会社ケイビー、によって支持されたと D.L.K. に NIH を経て交わり F31 MH111144
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| シルガード184シリコーンエラストマーキット | フィッシャーサイエンティフィック | NC9644388 | 解剖用のカバーガラスに置くには |
| 顕微鏡カバーガラス 22x22-1 | フィッシャーブランド | 12-542-B | 解剖のためにシルガードを置くには |
| アルミトップホットプレートタイプ2200 | サーモリン | HPA2235M | を硬化させるには |
| N/A | N/A | 手作り | |
| ホウケイ酸ガラス毛細血管 | WPI | 1B100F-4 | 吸引と接着マイクロピペットを作るには |
| レーザーベースのマイクロピペットプーラー | サッター機器 | P-2000 | 吸引と接着マイクロピペットを作るには |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | 口と吸引のピペット用 |
| P2 ピペットチップ | USA Scientific | 1111-3700 | 口のピペット |
| 用 0.6-mL エッペンドルフ チューブキャップ | フィッシャーサイエンティフィック | 05-408-120 | 解剖用の接着剤を入れるために使用 |
| Vetbond 3M | WPI | ベトボンド | 解剖に使用する接着剤 |
| 塩化カリウム | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| 塩化ナトリウム | ミリポアシグマ | S5886 | 食塩水 |
| 用塩化マグネシウム | ッシャーサイエンティフィック | M35-500 | 食塩水 |
| カルシウム二水和物 | ミリポアシグマ | C7902 | 生理食塩水 |
| スクロー | ッシャーサイエンティフィック | S5-3 | 食塩水 |
| HEPES | ミリポアシグマ | H3375 | 生理食塩水 |
| HRP用:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | 神経膜の標識には |
| Paintbrush | Winsor &ニュートン | 94376864793 | 幼虫を操作するには |
| デュモン・デュモスター・ピンセット #5 | WPI | 500233 | 解剖時に使用 |
| 7 cm マクファーソン・バンナス マイクロハサミ (ブレード 3 mm) | WPI | 14177 | 解剖時に使用 |
| FM1-43 | フィッシャーサイエンティフィ | T35356 | 蛍光スチリル染料 |
| デジタル | タイマーVWR62344-641FM | 染料のロード/アンロードのタイミング用 | |
| LSM 510 META レーザー走査型共焦点顕微鏡 | ツァイス | 蛍光マーカーのイメージング用 | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | ||
| HeNe 633nmレーザー | Lasos | イメージング中にHRP:647を励起する | |
| Argon 488nmレーザー | Lasos | イメージング中にFM色素を励起する | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | ファイヤーポリッシュガラスマイクロピペット |
| 20mL シリンジスリップチップ | BD | 301625 | 軸索を吸い上げて電気刺激を行います。 |
| マイクロマニピュレーター(磁気ベース) | 成茂 | MMN-9 | 電気刺激用吸引電極の制御用 |
| スティミュレーター | グラス | S48 | LEDと電気刺激の制御用 |
| ツァイス アクシオスコップ顕微鏡 | ツァイ | 電気刺激時に使用します。 | |
| 40X Achroplan 水浸対物レンズ | Zeiss | 電気刺激および共焦点イメージング中の使用 | |
| オールトランス レチナール | ミリポア Σ | R2500 | ChR2 |
| Zeiss Stemi 顕微鏡 カメラポート付き | Zeiss | 2000-C | チャネルロドプシン刺激中に使用 |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | ChR活性化に使用 |
| T-Cube LEDドライバ | ThorLabs | LEDD1B | LED |
| LED電源 | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | LED |
| に電力を供給するには 光パワーおよびエネルギーメーター | ThorLabs | PM100D | LEDの強度を測定するには |
参考文献
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
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再版と許可
