循環のマイクロ Rna は、心血管疾患および急性心筋梗塞のバイオ マーカーとして約束を示しています。本研究ではマイクロ Rna の抽出、逆のトランスクリプションおよび心血管疾患患者の血清中の miRNAs の絶対的な定量化のためデジタル PCR のためのプロトコルについて述べる。
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この記事について
サマリー
要約
循環血中マイクロ Rna (Mirna) は、循環に心血管系の細胞から放出される心血管疾患および急性心筋梗塞 (AMI) のバイオ マーカーとしての約束を示しています。循環の miRNAs は非常に安定した、定量化することができます。特定の miRNAs の定量化は、病理学といくつかの miRNAs ショー高組織および疾患特異性にリンクできます。心血管疾患の新規バイオ マーカーを見つけることは医学研究のための重要です。ごく最近、デジタルのポリメラーゼの連鎖反応 (dPCR) が発明されています。dPCR、加水分解蛍光プローブと組み合わせて特定の直接絶対定量ができます。dPCR は、変動の少ない、高直線性の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) に比べて感度が高いなど、優れた技術的な資質を展示します。したがって、dPCR は、特に大規模な多施設循環器臨床試験で使用するための Mirna を直接定量化のより正確で再現性のある方法です。この文書では血清中絶対コピー数を把握するためにデジタル PCR を効果的に実行する方法をについて説明します。
概要
循環の miRNAs は、疾患、心血管疾患の1を含む数の有望なマーカーとして識別されています。Mirna が小さい、単一座礁させた RNA 分子の非コーディング (約 22 ヌクレオチド長い) が関与している、転写後調節を介してメッセンジャー RNA の翻訳および影響を及ぼす遺伝子表現2の変化され、生理学的および病理学的状態の循環に解放されます。特定の miRNAs の定量的表現は、病理学にリンクすることし、いくつかの miRNAs 示し高組織疾患特異性1。心血管疾患における Mirna PCR 方法論3の助けを借りて定量化する新規バイオ マーカーが血清で非常に安定して、簡単にすることができますので、魅力的な候補となっています。小規模の研究で心筋梗塞のバイオ マーカーとしての miRNAs の潜在的な価値を評価が大規模なコホートで検証、2を欠けています。たとえば、ミール 499 は心筋の筋肉において高い発現があるし、亜美4,5,6で大幅に増加することが示されています。さらに、それを調節するプロ....
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プロトコル
1. 血漿/血清中からマイクロ Rna の抽出
注: Mirna を適切に定量化するために血漿/血清中から正しいマイクロ Rna 分離は重要なステップです。心に留めて、さまざまなプロトコルが存在するために特に重要なことは、サンプルの処理中に同じワークフローに準拠するためです。このプロトコルでは、miRNA が 50 μ L の血清から抽出されます。この制限の正しい抽出プロセスとしてよりも 200 μ L を使用しないでください。
- 血清の準備または凍結試料を凍結解除。
- 250 μ L (5 冊) 商業溶解試薬を 50 μ L の血清に追加します。ボルテックスによって、換散をサポートします。5 分間室温でベンチにライセートとチューブを配置します。
- スパイク スパイクの制御 (1.6 倍 107コピー/μ L) の 3.5 μ L でライセート、ボルテックスでそれらをミックスします。
- 相分離のクロロホルム (すなわち、開始の血清サンプルほど等しい金額) の 50 μ L を追加します。15 s. 場所 2 〜 3 分間室温でベンチにチューブのチューブを積極的に振る。
- 相分離の 4 ° C 15 分で 12,000 × g でチューブを遠心します。
注: サンプルは、RNA、白い中間期およびより低い、ピンクの有機相を含む上部の水相に今区切ら....
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結果
加水分解蛍光プローブと組み合わせてデジタル PCR 直接コピー/μ L に特定の miRNAs の絶対的な量を定量化することも可能。 にします。DPCR のサンプルは約 20,000 の個々 の PCR の反作用でパーティション分割された dPCR は技術不要、10をレプリケートします。DPCR システム (反応と正と負の異なる) 蛍光信号の数学的なポアソン統計分析を利用して10曲線の標準のための必要性なしに絶対的な数量を有効にします。許容滴数、濃度を正しく計算するために必要です (> 15,000)。テンプレート コントロールは、かなり非特異的増幅を除外しないようにするため。分析に含まれるすべてのサンプルは、得られた結果の妥当性を強化するため、同じボリューム、メソッド、および PCR のプロトコルを使用して処理されます。DPCR で得られた濃度がスパイクの合成と分析したすべてのサンプルの間で中央値の正規化の手順を使用して、正規化線虫ミール 39
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ディスカッション
デジタル PCR は比較的新規エンドポイントにより、核酸サンプル内の直接の絶対定量 PCR 法であります。メソッドでは、減少の変動、高められた日常の再現性、優れた感度11,12など、特定の利点を所有しています。さらに、サンプルは約 20,000 の単一反応やエンドポイント分析に分配による dPCR は堅牢に定量的 RT-PCR 法16と比較して PCR の妨害物質。DPCR これらの資質は、定量化のための診断ツールとして定量的 RT-PCR 法に魅力的な代替手段です。Mirna を循環として多い低血清濃度で存在、これまで科学者たちが挑戦されている PCR9Mirna を適切に定量化します。その一方で、dPCR は適切に低カウント miRNA 定量化17点の問題を軽減する血清中式でも低の miRNA を定量化できます。DPCR の能力を非常に低い miRNA 式でも数/μ L を直.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者の謝辞があります。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasyセラム/プラズマキット (50) | Qiagen-Sample &Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | マイクロRNA抽出用キット.キットには商用バッファRWT(原稿ではナンバーワンと呼ばれています)が含まれています およびRPE(原稿では2番目と呼ばれています)。 |
| miRNeasyセラム/プラズマスパイクインコントロール;Syn-cel-miR-39 miRNA;10pmol | キアゲン-サンプル&Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | microRNA 逆転写キット |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, セグメント化、セミスカート | サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ | AB0900 | 96 逆転写用 |
| プレート マイクロシール 'B’シールシール | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | 適切な保管を確保するためのホイル |
| C1000 タッチサーマルサイクラー | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | 逆転写に使用されるサイクラー |
| <ストロング>ドロップレットデジタルPCR | |||
| 100 nmole RNAオリゴ has-miR-499-5p | 統合DNAテクノロジー | カスタム | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR |
| Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes to 8 samples for droplet generation |
| DG8 カートリッジホルダー | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | 液滴生成液 |
| 生成用カートリッジを保持 プローブ用液滴生成オイル | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | 液滴生成用オイル |
| ddPCR 96ウェルプレート | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | ddPCR PCR用96ウェルプレート |
| ヒートシール、ホイル、ピアス可能 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Droplet |
| Generator QX100 または QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generatorは、サンプル/オイルエマルジョン |
| PX1 PCRから液滴を生成します。プレートシーラー | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | PCR 前にプレートをシール |
| C1000 タッチサーマルサイクラー | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | ddPCR |
| QX100またはQX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | 光学検出器 |
| でPCR陽性およびPCR陰性の液滴を読み取りますプローブ用ddPCRバッファー制御 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | ブランク制御 8ウェルカセットの残りのウェルを埋める |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | 液滴読み取りプログラム |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | 統計解析プログラム |
参考文献
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al.
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