多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

サマリー

このプロトコルでは、蛋白質ホモ重合体外に基づく商業光走査顕微鏡を用いた蛍光揺らぎを定量化するための校正無料のアプローチについて説明します。正しい取得の設定と解析方法が表示されます。

要約

数と明るさは、ホモ多量を検出するため校正無料蛍光揺らぎ分光 (FFS) 手法です。デジタル検出器を搭載した従来の共焦点顕微鏡を使用して用いることができます。数と明るさを正確に AP20187 の dimerizing の薬剤の添加の前後に mVenus ラベル FKBP12F36V のオリゴマーの状態を定量化する、見ることができるユースケースによる培養技術の使用のためのプロトコルが表示されます。アクイジション ・ パラメーターは正しい顕微鏡と正しいデータの前処理と分析方法を使用しての重要性を説明します。特に、退色補正の選択の重要性が強調されています。この安価な方法は多くの生物学的文脈でのタンパク質間相互作用の研究に用いることができます。

概要

蛋白質-蛋白質の相互作用は私体外

伝統的に、結晶構造解析と核磁気共鳴実験クライオ電子顕微鏡法 (低) と組み合わせて、分野正確に蛋白質の三次元のアーキテクチャを記述してその機能を推測する技術高分解能構造詳細を吟味します。蛋白質、しかし、静的な構造ではない、時間と空間で様々 な構造変化や振動を受けることができます。これはなぜ構造結晶構造からの情報または低データは他の技術 (例えば、分子動力学シミュレーションと単一分子技術) を補完する必要があります: 蛋白質の機能はその立体構造に関連して変化と相互作用、およびこの情報は静的構造で存在しません。内分子動力学を調査するためにフォースター共鳴エネルギーの移動 (smFRET) 単一の分子に基づく手法が非常に効果的な¹であります。これらのアプローチが複雑なメディアにおける分子の異なる集団を評価することができます。これは非常に重要なは、これらの変更は急速なありのデータ (つまり、 2 番目の範囲にナノ秒) の取得中に発生します。

2 つの主要なアプローチが採用して検出し、これらの変更を定量化する: ソリューションおよび表面固定化タンパク質。リガンドによって誘導される二量体化のプロセス、特に、分子間相互作用の検出のため smFRET は常に最高のツールではありません。確かに、フレット依存 (≈10 nm) の距離だけでなく (ドナーとアクセプター、χ²) の 2 双極子の向きにも、受容体の吸収スペクトル²がおそらくこの最後の条件を持つドナーの発光の重なりが小さい重要な験者できる提供される右のフレットのカップルを選んだ。SmFRET ホモ二量体化をプロービングのための特定の不利な興味の蛋白質のラベルから来る: ヘテロ smFRET 二量体化することができますのみ最大 50% を検出 (すなわち、ヘテロ フレットだけドナー ・ アクセプターを検出できるようになりますとアクセプター ドナー ホモ二量体がないドナー ドナーやアクセプター ・ アクセプター、ダイマーの他の 50% である)。蛍光相関分光法 (FCS) の誘導体 (FCCS、等³) タンパク質拡散定数と結合定数体外を確認するために使用は、別の方法です。これらのアプローチは完全にどちらかホモ二量体化を定量化することができない、拡散粒子の FCS 1 対策濃度と拡散、半径と拡散係数のように、非常に悪い; 分子量に依存分子の重量の 10 倍増加はたとえば、拡散係数⁴で 2.15 倍変更だけ意味になります。2 色 FCS や FCCS の場合、上記と同じ理由では、ホモ二量体の 50% だけが見られます。ホモ二量体化の in vitroとin vivoを検出する最も実用的と定量的な手法、ホモ フレット⁵と番号と明るさ (N & B)⁶です。という事実を考えるヒト フレットが異方性値 (すなわち、光の要素/アナライザー平行および垂直偏波を回復する) の固有のインストルメンテーション回復を必要とする、N & B を提示ここでは有利な方法としてタンパク質ホモ二量体化と集約を検出します。それは、体外と体内の商業設定の両方を採用します。

数と明るさ

N & B は、最近見直し⁷をされています。そのレビューは、生きた細胞技術の応用に焦点を当てた。それは価値がある再現これらの方程式としてここで、数学的な定式化は、データに適用されますが体外を収集しました。最初に、いくつかの用語や数学的な量を定義する必要があります。

• エンティティは、一緒にバインドされている分子のセットです。
• エンティティの明るさε は、それを発する (フレーム) ごとの単位時間当たりのフォトンの数です。
• nは、エンティティの現在の数です。
• イメージ シリーズにわたって、指定されたピクセルの< i >は、その平均の強さと σ²はその強度の差異です。

フォトンカウンティング検出器と移動体と背景なしと仮定すると、その後、

NはBの明白な数と明白な明るさです。これは、結果、

Dalal さんら⁸アナログ機器で 1 つは 3 つの補正項を必要とした: S ファクター背景のオフセット、および読み出しノイズσ₀²。その後、再び移動体と仮定してください。

与える

上記の式が異なることに注意してください dalal さんらで与えられています。⁸その後レビュー。⁷は、タイプミスなど dalal さんでら S分母が省略され、このエラーがレビューで再現しました。上の方程式はしいものです。指示 dalal さんらによって与えられるオフセットと σ₀² - その意味 - の説明と共にSの測定、⁸

明るさ ε は拡散のエンティティのオリゴマーの状態に比例している: ε スチレンダイマーなどなどはモノマー、hexamers の倍の大きをモノマー、スチレンダイマーの 3 倍の大きさだと二量体の大きさ 2 倍になります。これで、明るさ ε を測定 1 つは多量体形成の任意の型を定量化できます。

現在、数オリゴマー状態の混合物があり、明るさは現在個々 のオリゴマーの状態を回復することができるではないです。これ技術の制限です。

Detrend アルゴリズムと nandb ソフトウェア

退色がされている補正の重要性は以前⁹を強調しました。退色が必然的にタイムラプス モードで光学顕微鏡の実験中に発生します。生きた細胞と体外の両方。多くのアプローチは、⁷を漂白を補正するため文献に記載されています。トレンド除去パラメーター Tの自動選択と指数のフィルタ リング技術は、現在最高です。それは、フリーでオープン ソース ソフトウェア nandb⁹に統合されます。確かに、彼らの detrending のパラメーターを手動で選択するユーザーを必要とするソフトウェアは、このパラメーターの選択に恣意的で不適切ななる可能性が高いため誤った結果を可能性があります。自動のアルゴリズムは、データを検査し、⁹ユーザーの介入を必要とせずに、適切なパラメーターを指定します。平滑化パラメーターの最良の選択でもトレンド除去はその制限があり退色率 25% 未満でのみうまく動作するシミュレーション⁹で示すように。興味深いことに、自動の detrending ルーチンを使用して、その精度はその 1 つは低輝度の値を扱うことができます (さらにB < 1.01)、それゆえ低強度、およびまだホモ二量体化を定量化する十分に正確であります。

退色はまた別の問題を引き起こす: 複雑な多量体で photobleached fluorophores の存在。これは例えば、三量体は、三量体の 3 つのユニットの 1 つが非蛍光性二量体のような表示になります。ミューラー¹⁰これを修正する方法を示し、この補正もその後レビュー⁷で強調されました。Nandb ソフトウェアには、この補正⁹が含まれています。

FKBP12F36Vシステム

FKBP12F36V 自然 oligomerize はないが、AP20187 (配位子を二量化する BB として通俗の言葉で知られている) 薬^11,12の添加によって dimerize に知られている蛋白質であります。これにより、数と明るさのための理想的なテスト _ ケース: ラベル付き FKBP12F36V とオリゴマーの状態の倍増を守らなければなりません BB の追加。

プロトコル

1. FKBP12 F36V - mVenus 浄化

1. Monomerized 人間 FKBP12F36V¹²と N 末端 His6 と mVenus タグ (ベクトル要リクエスト) を含む pET22b ベクトルと (DE3) pLysS セルを変換します。50 μ G/ml アンピシリンと 34 μ G/ml クロラムフェニ コール添加 LB 寒天培にプレート細胞。
2. 100 mL LB スターター文化に変換されたコロニーを転送し、揺れで 37 ° C で 16-20 時間の成長します。
3. 密なスターターを希釈 (OD600 > 1) 1: 100 LB 培地 (2 x 500 mL バッチ) の OD600 に 2-3 時間の成長 = 0.6 - 0.8 (37 ° C、200 rpm)。
4. 氷の上のクールな文化。250 μ m IPTG 誘導および 21 ° C、200 rpm で 16-20 時間の成長します。
5. 2,000 x g で 20 分間遠心分離によって細胞を収穫します。
6. IMAC バッファーと EDTA 無料プロテアーゼ阻害薬 (細胞ペレットあたり 1 錠) 補われる (20 mM リン酸ナトリウム pH 7.5、500 mM の NaCl、3 mM のイミダゾール、1 mM β-メルカプトエタノール) 40 mL にペレットを再懸濁します。
7. 細胞を超音波 (20 kHz、500 ワット 40% 振幅、9 s、11 15 分間オフ s) 20,000 × g で遠心分離によって溶ける材料を氷と収穫に。
8. 転送可溶性三角フラスコにライセート、レジン 2 mL を追加 (材料の表を参照してください)。105 rpm 回転で 1 時間インキュベートします。
   メモ: この手順で IMAC ニッケル セファローズを使っても可能性があります。
9. 樹脂を収穫し、IMAC のバッファー (20 mM リン酸ナトリウム pH 7.5、500 mM の NaCl、7 mM のイミダゾール、1 mM β-メルカプトエタノール) IMAC バッファー B の 500 の mL に続いて A の 250 mL で洗います。
   メモ: ニッケル セファローズ樹脂を使用した 50 mM のイミダゾールに増加します。
10. IMAC バッファー C (20 mM リン酸ナトリウム pH 7.5, 500 mM, 300 mM のイミダゾール、塩化ナトリウム 1 mM β-メルカプトエタノール) を使用して His6 タグ付きタンパク質を溶出します。
11. サイズ排除に挿入列が 10 mM HEPES pH 7.5、150 mM の NaCl、1 mM DTT の平衡 (材料の表を参照してください)。FKBP12F36V は、我々 が使用される列の 87.71 mL でそのピークの溶出を持っています。
12. SDS ページとプール経由で純度を評価し、必要に応じて集中します。

2. 汚損プレート アレイの作製

1. 精製 FKBP12F36V を解凍 (または興味の蛋白質をラベル)-80 ° C から
2. 100 のソリューションを準備 nM 精製 FKBP12F36V (培地、10 mM HEPES の pH 7.5、150 mM の NaCl、1 mM DTT)。超音波照射し、集合体の形成を防ぐために遠心分離機の (13,000 rpm のクイック スピン)。
3. ガラス底の 8 よく観察室に 100-200 μ L をピペットします。
4. 10、20、40、80、100、150、300、500 nM^12,13の最終濃度に BB dimerizer を追加します。
5. 参考のため、100 のソリューションの準備だけで凝集の潜在的な影響を評価し、同じ取得設定でモノマーの明るさ値を回復する mVenus の nM。

3. 校正無料共焦点取得

1. 共焦点システム (図 1) を開始します。顕微鏡・共焦点システムのスキャンの任意の光デジタル探知機よ特徴付けられたアナログ検出器⁸、装備し、維持することができる取得のすべてのピクセルの定数ドウェル時間が働くでしょう。
2. 励起光パスを設定します。
   1. 514 nm レーザとセット (FKBP12F36V-mVenus) のための目的の出口 20 100 nW で電源を入れます。
   2. 63X1.4NA 目的または FCS 用に設計された首輪補正水浸対物レンズを選択します。
   3. 1 つの HyD、APD または校正 PMT 検出器を入れます。検出器のことができる光子計数が望ましい、この場合、 Sの計算のようにオフセットと σ₀²は必要ありません。
   4. 520 560 nm から排出ウィンドウを選択します。
   5. 対応する放出 〜 545 nm の 1 風通しの良いユニットでピンホールを設定します。
   6. 16 x 16 ピクセルで、アクイジション ・ モードを設定します。
   7. T_フレームを満たすように_住む「ピクセル滞留時間tを設定 >> T_D >> tに_{住む D}は拡散のタンパク質とt の滞留時間_フレームはフレーム レート。これは、滞留時間を 〜 13 μ s に設定に対応しました。
      注: いくつかの商業製造業者はあったないピクセルあたりのドウェル時間を一定に保っていたスキャナーです。この恒常性は、メソッドが動作するために重要です。
   8. 〜 120 でのピクセル サイズ設定 nm。
   9. Xytアクイジション ・ モードを選択し、買収とも (たとえば 5,000) あたり取得するフレームの数を選択します。
   10. システムには、高スループット モードが装備されている場合は、プロセスを自動化する各ウェルのウェルあたりの買収の数座標をご紹介します。
       注: は、液浸対物レンズを使用している場合の水ディスペンサーのプレゼンスを確保するように注意します。
   11. システムが装備されている場合灌流システム BB ソリューションを読み込むし、プログラムの右後を開始する灌流 5000^thフレーム 10,000 画像などを取得しながら二量体化の動態を評価します。
3. 油浸対物レンズに油の滴を追加/水の FCS 用に設計された首輪補正水浸対物レンズを利用した場合。
4. 8 よく観察室を舞台にマウントします。
5. まあ、正しいを選択し、ソリューションに焦点を当てます。
   注: 重要な: 下ガラス反射、散乱を避けるために近くに焦点を避けるため。ソリューションに深く焦点を当て、自動フォーカス オプションが切断されます。
6. 集録を開始し、TIFF 形式で画像の結果として得られるスタックを保存します。

4. detrend と R パッケージ nandb を用いた明るさ解析

1. 前処理の品質チェックとして図 2に示すように、画像を見て強度プロファイルをリカバリし ImageJ¹⁴を使用します。これはあまりにも多くの退色が発生したかどうかを調べるために役立ちます。あまり漂白する場合データがさらに分析に適していません。
   注: ImageJ は、商業の形式から画像を TIFF に変換する便利なことができます。下記載されている nandb ソフトウェアは、TIFF ファイルでのみ操作できます。
2. ダウンロードして R と RStudio^15,16をインストールします。ダウンロードして R をインストールすることをお勧めします最初に、それから RStudio。
   注: 以下は nandb R パッケージを使用する方法の説明です。R 言語の知識は、しかし、それは、人生をより簡単にするが、nandb を使用する必要はありません。
3. Nandb パッケージをインストールします。
   1. RStudio を開くと、コンソールで install.packages("nandb") を入力し、インストールを待ちます。
4. Nandb を知る
   1. マニュアル¹⁷を確認します。
   2. 様々 な機能の組み込み RStudio ヘルプを確認してください。使用される可能性が最も高い関数になりますを使用して brightness() になります。この関数のヘルプ ファイルを表示するには、入力するか。コンソールで brightness()。
5. 明るさを計算します。
   1. Img001.tif ('nandb' は、TIFF ファイルでのみ動作することに注意してください) と呼ばれるデスクトップ上の画像ファイルがあることを言います。1 つは、そのイメージの明るさを計算できます。
      b <-明るさ ("~/Desktop/img001.tif"、タウ ="auto")
      1. これは R に変数 b に画像の明るさを割り当てられますタウ ="auto"により、イメージは明るさの計算の前に前正しくこと。最も一般的なものは、ここからは、イメージの明るさの中央値または平均を計算します。1 つは mean(b) または median(b) を入力してこれを行うことができます。1 つはデスクトップの使用に明るさ画像を書き込むことも
         ijtiff::write_tif (b,"~/Desktop/whatever_img_name")
   2. デスクトップ上の画像 images_folder の完全なフォルダーがあるし、1 つはこれらの画像のグレーレベルを計算して TIFF ファイルとして明るさ画像を書き込む必要があると言います。その後、参照してくださいですか? brightness_folder()。この関数は、フォルダー全体を一度に処理します。
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder"、タウ ="auto")
      これは特に良い彼らは R を好むソフトウェアを持っている人のため、1 つのコマンドで処理されるすべてのファイルと、1 つことができます働き続け、選択したソフトウェアの出力輝度の TIFF 画像をのでそれ ImageJ¹⁴になります。、Python とか。

結果

トレンド除去および単量体の明るさ

データが取得されると、ソリューション内の興味の蛋白質のオリゴマーの状態を判断する明るさの計算を開始します。場合でも、ソリューションの漂白の効果は、抜本的なできない場合がありますそれとして生体内ですることができます、強度トレースがおそらくない、蛍光体、¹⁸がこれの後ろの理由に関連した光効果のための静止した平均完全に理解されていません。の明るさを計算するとき、これは影響を与えるモノマー ・ ダイマー転移を判断するとき、この点は重要です。自動を適用することでアルゴリズムに図 2に示すようにデータを detrend、強度トレースは正しく修正ソリューションで FKBP12F36V mVenus の明るさのより正確な値を提供します。トレンド...

ディスカッション

N & B は、商業の光走査共焦点顕微鏡デジタル探知機装備を使用して多量体形成を検出する手法です。このアプローチは、FCS、FCCS、および smFRET 校正無料と明るさ計算だが簡単な単一ポイントと濃度独立⁶に比べて非常に魅力的です。それは明るさの計算⁹; を実行する前に漂白と長期強度の変動を補正するためしかし、主要な重要性の漂白のための明るさとその他のアーティファクトのわずかな増加と誤解されるかもしれないオリゴマーの状態の変化 (図 2で見られる)、無視がトレンド除去または適切に行われない場合。自動の使用 detrend アルゴリズム正確な輝度の計算ができます。

重要画像を取得するいくつかのルールに従うことです。まず、分子の共焦点のボリュームとそのための拡散定数の滞留時間は共焦点システムの適切なパラメーターを設定するために知って必要があります。ピクセルの間に存在するラベルの付いた分子ニーズの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RosettaTM (DE3) pLysS cells	Novagen	70956-3
Ampicillin	Sigma Aldrich	PubChem 物質 ID 329824407
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	PubChem 物質 ID: 24892250
LB スターター培養	QIAGEN
LB 中	QIAGEN
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem 物質 ID 329815691
IMAC バッファー	メディカゴ	09-1010-10
EDTA-free プロテアーゼ阻害剤	シグマ アルドリッチ	11873580001
タロン樹脂	クローンテック
ニッケルセファロース	GEヘルスケア
S200 16/60カラム	GEヘルスケア
ガラス底 8ウェル 観察皿	同上	80827