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方法論記事

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

7.9K 閲覧数

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DOI：

10.3791/58194

⸱

2019年1月7日

 ,  , 
1Cancer Blood Disease Institute, Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

この記事について

サマリー

ここでは、in vitro および in vivo 遺伝子とヒト化マウスモデルを使用して白血病の薬剤標的として C-fos と Dusp1 の遺伝的・化学的検証のためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、遺伝学的検証、および治療開発を対象に適用できます。

要約

慢性骨髄性白血病 (CML) 治療におけるチロシン キナーゼ阻害剤 (こ) のデモンストレーションが癌治療の新しい時代を告げた。ただし、セルの小さい人口に応答しません TKI 治療結果微小残存病変 (MRD);これらの細胞を根絶するためにも、最も強力なず失敗。これらの MRD の細胞は、治療への抵抗を開発するための貯水池として機能します。TKI 治療なん MRD のセルに対して有効であることは知られていません。TKI 治療中に MRD 細胞の生存を支える成長因子シグナリング、関与しているが、機構の理解が欠けています。最近の研究では、昇格した C-fos と Dusp1 式収束結果発癌性成長因子 MRD 細胞内シグナルが TKI 抵抗を仲介することを示した。C-fos と Dusp1 の遺伝的・化学的抑制は、こに絶妙に敏感 CML をレンダリングし、遺伝とヒト化マウスモデルの慢性骨髄性白血病の治療法します。TKI 感受性及び抵抗性細胞から複数のマイクロ アレイを使用してこれらのターゲット遺伝子を同定しました。ここでは、in vitro および in vivo マウスモデルを使用してターゲットの検証のためのメソッドを提供します。これらのメソッドは、遺伝学的検証、および治療開発を対象に簡単に適用できます。

概要

BCR ABL1 融合遺伝子の構成のチロシンキナーゼの活性を引き起こす慢性骨髄性白血病、小分子阻害剤によってキナーゼ活動を対象とする理論的根拠を提供します。この慢性骨髄性白血病患者の治療の成功は、標的療法1,2の概念を革命化しました。その後、いくつかなどの悪性腫瘍、固形腫瘍の精密薬として抗プロテインキナーゼ治療が開発されました。ところ、30 以上のキナーゼ阻害剤は、様々 な悪性腫瘍の治療のため米国状態 FDA によって承認されています。TKI 治療は病気の抑制に非常に効果的ですが、根治的ではありません。その上、癌細胞の小集団が治療中に続く: MRD3,4,5。完全寛解を示したもの患者は最終的に再発でなく継続的に結果を抑圧する MRD が残っています。したがって、MRD 細胞の撲滅は、耐久性や治療の応答を達成するために必要です。慢性骨髄性白血病は、精密医学の概念は、発癌、合理的なターゲット向けの治療、病気の進行と薬剤耐性のメカニズムを定義するための貴重なパラダイムします。しかし、今日でも、がん細胞における TKI が誘導する細胞死のメカニズムは十分に理解されていない、またなぜ MRD 細胞 (白血病幹細胞 [LSCs] で構成) がず4,6に本質的に耐性。変異キナーゼ腫瘍を「癌遺伝子依存性」の現象がこによって目標とされた遺伝子急性阻害が大規模なアポトーシス応答またはセルに静穏化につながる発癌ショックを引き起こす TKI 効果に関与しているにもかかわらず、コンテキスト依存的6,7,8,9。ただし、遺伝子依存性のメカニズムの基盤が欠けています。最近の研究は、成長因子シグナリング遺伝子依存性の放棄し、その結果 TKI 療法10、11,12に対する耐性を付与に関与しています。したがって、遺伝子依存性のメカニズムに洞察力を得るためには、BCR ABL1 中毒と C-fos と Dusp1 がの重要なメディエーターであることを明らかにした (成長因子と成長)、nonaddicted の細胞からの全ゲノム発現プロファイリングを行った癌遺伝子中毒13。C-fos と Dusp1 の遺伝子の欠失は合成 BCR ABL1 表現する致命的な細胞、実験に使ったマウス白血病を開発しなかった。また、小分子阻害剤による C-fos と DUSP1 の阻害は、マウスにおける BCR 誘起 ABL1 CML を硬化させます。結果は、その下位レベルより高いレベルの治療13への抵抗を引き起こす間薬剤感受性を協議する C-fos と Dusp1 の発現が癌細胞でアポトーシスしきい値を定義を示します。

運転がん遺伝子依存性遺伝子を識別するためにいくつかの全ゲノム発現マウスと慢性骨髄性白血病患者由来細胞 (K562) の両方を使用して成長因子といって (イマチニブ) 存在下で実験を行った。CD34 から取得した慢性骨髄性白血病患者のデータ セットと並行してこれらのデータを分析した+造血幹細胞イマチニブ治療前後。この分析は、3 つの遺伝子を明らかにした (転写因子 [C-fos]、二重特定性のホスファターゼ 1 [Dusp1] と RNA 結合タンパク質 [Zfp36])、TKI 耐性細胞における一般的。薬剤耐性のこれらの遺伝子の意義を検証するには、ステップバイ ステップの in vitroとin vivoの解析を行った。これらの遺伝子の表現のレベルは、リアルタイム qPCR (RT qPCR) と薬剤耐性細胞のウェスタンブロッティングによって確認されました。さらに、cDNA 発現と Dusp1、C-fos の shRNA ヘアピンによるノックダウンと Zfp36 高架 C-fos と Dusp1 式が TKI 耐性を授けるに必要かつ充分なことを明らかにしました。したがって、のみ C-fos と Dusp1 マウス モデルを用いた生体内での検証を行った。C-fos と Dusp1 の遺伝学的検証、我々 ROSACreERT 誘導性 C-fosフロリダ州/フロリダマウス (条件付きノックアウト)14を作成し、Dusp1-/- (まっすぐノックアウト)15 ROSACreERT2 Fosフロリダ州/フロリダ州をようにそれらを交差させたDusp1-/-ダブル トランスジェニック マウス。C キット+ - 骨髄由来細胞 (Fos からフロリダ州/フロリダ・ Dusp1-/--、および Fosフロリダ州/フロリダ州Dusp1-/-) でコロニー形成単位 (CFU) 試金およびの in vitro解析あった BCR ABL1 を表現します。vivo白血病開発で単独で、または一緒に C-fos と Dusp1 の要件をテストするための致死的に放射線照射したマウスの骨髄移植によって。同様に、DFC (difluorinated クルクミン)16 C-fos と BCI によって Dusp1 の化学阻害 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17テストされた in vitro および in vivo BCR ABL1-表現、骨を使用して野生型 (WT) マウス骨髄由来の c キット+細胞。白血病幹細胞における C-fos と Dusp1 の要件を確認するには、我々 は、BCR ABL1 は特異的にその幹細胞ドキシサイクリン (テト転写活性化表現するマウスの幹細胞白血病 (SCL) 遺伝子 3' エンハンサーの下で慢性骨髄性白血病モデルマウスを利用しました。規制)18,19。骨髄林-を用いて生体内での移植試験でこれらのマウスから細胞の Sca+c キット+ (LSK)。さらに、我々 phopsho p38 レベルと Dusp1 と C-fos 阻害の薬物ダイナミック バイオ マーカーとして il-6 の発現がそれぞれ開設、生体内で。最後に、人間の関連性、患者由来の CD34 の研究を拡張する+細胞 (マウスから c キット+細胞に相当) が長期的に受ける体外培養開始細胞アッセイ (LTCIC) との生体内でヒト化マウスモデル慢性骨髄性白血病の20,21。免疫不全マウスは CML CD34 陽性細胞、続いて薬物治療と白血病細胞生存率の解析で移植されました。

このプロジェクトで異なる前臨床モデルを使用してターゲット識別と遺伝的・化学的ツールを使用して検証のためのメソッドを開発します。これらのメソッドは、他の治療開発のための化学療法の開発のターゲットを検証に正常に適用できます。

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プロトコル

機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) シンシナティ小児病院医療センター (CCHMC) でのガイドラインに従ってすべての動物実験を行った。人体標本 (通常 BM と CML から (p210-BCR-ABL +) 白血病) 治験審査委員会承認プロトコルにより、得られた (制度検討委員会: Federalwide 保証 #00002988 シンシナティ小児病院医療センター)、CCHMC、シンシナティ大学からドナー インフォームド コンセント。

1. リアルタイム qPCR 解析

  1. 3-インターロイキン (IL-3) の源として培養培地を過ごした WEHI FBS と 10% 10% 添加 RPMI BaF3 細胞からの総 RNA を分離します。
  2. 対数段階 (99% 生きている) 治療 (IL 3 とイマチニブ) からだけでなく、未処理のサンプルから細胞を収穫し、3 分間 435 × gで遠心分離機のそれら。健康および細胞の成長段階の遺伝子発現プロファイルが大幅に変更することが重要です。
  3. 総 RNA22を浄化することによって RNA を分離します。総 RNA; を定量化します。その後、DNase 処理23それを対象します。無料の DNA の RNA の同量を変換 (2 μ g) 逆転写酵素24cDNA に。
  4. 遺伝子特定のプライマー (表 1) で qPCRs を実行します。光キャップ、1 x ポリメラーゼを用いた PCR チューブの薄肉ミックス (材料の表を参照)、0.5 μ M の各プライマー、DNA と水 1 μ L、0.2 mL の 20 μ L 反応 Pcr 実施します。次のサイクルでたちの反応を配置: ステップ 1、95 ° C 10 分;ステップ 2、95 ° C、15 s;ステップ 1 分; 60 ° C で 3ステップ 4、40 回手順 2-3 を繰り返します。トリプリケートで全 PCRs を実行し、印刷する前に β-アクチン表現するリアルタイム データを正規化します。

2. 西部にしみが付くこと

注:全細胞抽出物ので説明したように x 換散バッファー 1 の 250 μ L を追加することによって準備されたら13プロテアーゼ抑制剤のカクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテル 2 と補われます。

  1. 収穫 (IL 3 とイマチニブ) を処理し、未処理 BaF3 から 4 ° C で 3 分間 435 × gで遠心分離によって細胞から対数段階 (99% 生きている) で 500 万 BaF3 細胞上下 80 ° C で 5 分培養を続けて、1 x ピペッティングによる換散バッファー (250 μ L) で細胞を溶解させます。ライセート 5 の 5-6 パルスによるすべての DNA を分解する超音波 s 各 4 ° C で冷蔵室で
  2. 1.5 mL チューブに液を転送や不溶性素材を削除する 5 分 16,000 × gで遠心分離機します。抽出物は、使用するまで-80 ° C で保存できます。読み込み前にヒート ブロックで 5 分の 80 ° C の熱のサンプル。10 %sds ページのゲルのゲル ロード ヒントを使用してサンプルの 10 μ L をロードします。
  3. 参照色素がゲルの下端に到達するまでは、150 V でタンパク質を解決します。1 h の 1 アンペアの電気泳動移動によって硝酸セルロースの膜に蛋白質を転送します。転送後、ブロック 1 含有トリス緩衝生理食塩水 + 0.1 %x 膜トゥイーン 20 (TBST) が 1 h の 4 ° C で一晩に縮尺希釈で適切な抗体プローブ 5% 無脂肪牛乳で。
  4. 洗って膜 3 x 5 x tbst 10 分ずつ。その後、1 h 用プローブ、HRP 共役適切な二次抗体と (1:5, 000 希釈) 室温で。TBST の使用量は、コンテナーのサイズに依存します。TBST で膜が完全に水没することを確認します。二次抗体 3 を洗って x tbst 各 5 分。
  5. 化学発光基質試薬を用いたしみを開発します。基板と 2 つのボトルは、使用前に右からバッファーの平等なボリュームをミックスします。基板を 1 mL ピペットで全体の膜をカバーし、1 分間インキュベート膜の上部に追加します。黒子の基板を追加する 1-10 分以内イメージを作成する必要があります。
  6. イメージング システムのプラットフォームに膜を置く鈍い鉗子を使用して、慎重に (材料の表を参照)、液体の多くを回避します。ライブ ビューを選択し、メニューからしみと chemiluminiscence を選択します。手動取得を使用して、異なる時点で複数のエクスポー ジャーを取得します。これらのファイルは、視覚化することができます、イメージング ソフトウェアを使用して量を示されます。

3 ノックアウト マウスの発生

  1. Fosフロリダ州/フロリダ州ROSACreERT2c Fosフロリダ州/フロリダマウス13を生成する ROSACreERT2 マウス マウスをクロスします。ダブル ノックアウト (KO) マウスを作成するには、ROSACreERT2c Fosフロリダ州/フロリダ州ROSACreERT2c Fosフロリダ州/フロリダ州Dusp1-/-マウス13を生成する Dusp1-/-マウス マウスを繁殖します。遺伝子型尾クリップでマウスに続いて PCR、以下のとおり。
  2. 遺伝子型判別:
    1. DNA を準備するには、ハサミ尾の小さな部分をクリップし、1.5 mL のチューブに入れてください。温水ハサミ尾を焼灼します。チューブのクリップの末尾に 50 mM NaOH の 200 μ L を追加し、95 ° c 1 時間の熱ブロックで孵化させなさい。
    2. 渦管も、50 の 1 M トリス塩酸 pH 6.8 μ と渦を再び追加することによって、中和します。1 分最大速度で管を遠心します。
    3. 染料、0.5 μ M の各プライマー、DNA と水 1 μ L を含む 1 x Taq ポリメラーゼ マスター ミックスを使用して薄肉 PCR チューブ 0.2 mL で 20 μ L 反応 Pcr を行います。たちにチューブを置き、表 2に示すように、適切なサイクルを実行します。
    4. 2% の agarose のゲル、ゲルのドキュメンテーション システムを使用して、イメージの PCR の製品を実行します。

4. 骨髄から c キット+細胞の分離

  1. 制度のガイドラインに従ってマウスを犠牲に。
    注:ここでは、マウスによると、二酸化炭素 (CO2) にさらされた推奨流量までの死は、呼吸と鼓動の停止によって決定された AVMA、頚部転位が続きます。
  2. マウスから脚の骨を収穫-2 大腿骨、脛骨の 2 つ、2 つの iliacs。骨からのすべての組織を離れてメスで削ってきれいに。氷で冷 1x PBS で脚の骨を置く-15 mL チューブに 5 mL。管の内容を注ぎすり鉢とすりこぎでつぶします。
  3. 10 mL のピペット ピペットを使用して、アタッチと 70 μ m 携帯こし器を通って 50 mL スクリュー キャップ チューブに細胞懸濁液をフィルターします。乳鉢と乳棒冷 1x PBS を収集し、50 mL のチューブに細胞懸濁液を追加することで複数回を洗います。1,200 x gで 5 分、上清を介してガラス ピペットで真空添付削除 4 ° C で骨髄をスピンダウンします。1x PBS ピペットで 5 mL の細胞ペレットを中断します。
  4. ピペット、ゆっくりと室温 (温度は重要な) の 5 mL の上部に中断された骨髄を追加 polysucrose、インターフェイスを邪魔しないように細心の注意を取るします。オフになってブレーキ付け 400 × g 20 分間室温で回転します。
  5. ピペットと曇り総単核細胞 (TMNC) インターフェイスを収集し、新しい 15 mL チューブに入れてください。ボリュームをもたらす最大洗浄の 1x PBS で 10 mL は、カウントの 20 μ L を取って 1,200 x gで 5 分破棄上清の 4 ° C でのスピンし、ステップ 4.6.1 の氷の上にペレットを保存します。
  6. C キット+を行う細胞の分離。
    1. C キット+ビーズ キット プロトコルに従って細胞の分離。10 の7セルに BSA + EDTA 1 × PBS 80 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液、CD117 ビーズ/107総細胞の 20 μ L を追加します。ボルテックスでよく混ぜるし、4 ° C で 10 分間インキュベートボリュームをもたらす 1 × PBS + EDTA + BSA とスピンを追加することによって最大 10 mL 1,200 x gで 5 分 4 ° C で。
    2. 真空を介して上澄みを除去し、BSA + EDTA 1x PBS で 500 μ L/108合計セルの細胞ペレットを中断します。マグネット スタンドを使用して接続、磁気列 1 × PBS + EDTA + BSA の 3 mL を加えるし、15 mL コレクション チューブに重力によって流れることができます。
    3. 最初のバッファーの追加が終了する列を通過、それを介して重力 15 mL コレクションの管に流れることを許可する列に細胞懸濁液を追加します。この吸収は、望ましくないセルの一部です。
    4. 3 回 BSA + EDTA 3 mL の 1x PBS で列をコレクションの管に経由で重力を通過することができますたびに洗ってください。磁石から列を削除し、15 mL のチューブの上に配置します。
    5. 1 × PBS + EDTA + BSA の 5 mL を追加し、カラムを備えたプランジャーですぐにフラッシュします。プランジャーを削除し、追加 5 ml の PBS + EDTA BSA x 1 のフラッシュを繰り返します。標準的な方法を使用して合計ボリュームのセルをカウントします。
    6. スピン ・ ダウン 5 分削除清 4 ° C で 1,200 x gでセルと完全な IMDM でペレットを再懸濁します (IMDM + 10 %fbs + IL 6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] + FLT3 リガンド [20 ng/mL] + IL 3 [10 ng/mL]) のカルチャ。これらの細胞は 37 ° C、5% CO2でインキュベーターでそれらを配置することによってセル IMDM 完全なメディアの 2 × 106セル/1 mL で一晩文化。

5. 伝達

  1. レトロ ウイルス プラスミド トランスフェクション
    1. 新鮮な水お風呂の前に午後は 37 ° C に設定 HEK293 細胞を解凍します。3 分削除のため室温で 435 x gで HEK 細胞を含む cryotube を培養上清による真空スピンし、10 %dmem の 1 mL の細胞ペレットを中断 FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン。
    2. セルをカウントし、適切なボリュームを扱われる 10 cm 皿 (4 ~ 106 HEK293T 細胞 x) に追加します。皿に DMEM 10 メディアの 14 の mL を追加し、平等な分配を上下にスライドしてよく混ぜます。37 ° C、5% CO2インキュベーター一晩に皿を置きます。
    3. 次の朝、倒立顕微鏡下で細胞の合流を確認 (50% 以上の作品も)。
    4. 結合 DNA (レトロ ウイルス目的プラスミド)、PclEco (包装プラスミッド)、2 M CaCl2H20 (= 500 μ L) 1.5 mL チューブにマイクロ ピペットを使用して以下の量で: DNA (BCR ABL1 YFP) pCLeco、2 M CaCl2 62 μ L の 7.5 μ g の 7.5 μ g、水を 500 μ L。 追加 500 μ L の別 1.5 mL チューブに 2 x HBS の最終巻。
    5. 混合しながら DNA ミックス 2 x HBS (280 mM の NaCl、100 mM HEPES、1.5 mM の Na2HPO4) 500 μ L を含む 1.5 mL チューブに滴下を追加します。渦を最低速度に設定することによってこれを達成するため、トランスフェクションのミックスを追加しながら定数混合の HBS チューブを保持します。
    6. 室温で 20-30 分間インキュベートするトランスフェクション ミックスができます。、インキュベーション中に HEK 細胞を 25 nM クロロキンを追加し、インキュベーターに配置します。、孵化後滴下 HEK 細胞にトランスフェクション ミックスを追加、、、優しくミックス プレート全体でトランスフェクション ミックス メディアを旋回します。
    7. 37 ° C、5% CO2インキュベーターで 〜 8 h の組み合わせでセルを孵化させなさい。新鮮な DMEM 10 メディアの非常にゆっくりと追加 14 mL によってこれらの細胞上のメディアを変更します。皿の壁にゆっくりとピペッティング、HEK 細胞の剥離を防ぐのに役立ちます。37 ° C、5% CO2インキュベーターで一晩細胞を孵化させなさい。
    8. 10 mL 注射器でウイルス上清を収集、シリンジに上澄みを描画、0.45 μ m のシリンジ フィルターを取り付けます。ウイルス上清を新しいコレクション チューブに突入します。ウイルス上清 ~ 16 h の最初のコレクションは、後を取る。
  2. フィブロネクチン ウイルス濃度と伝達
    1. 1x PBS で未処理の 6 ウェル培養皿に 0.1 mg の組換えの人間フィブロネクチン フラグメント 2 mL を追加します。必要に応じてできるだけ多くのフィブロネクチンを準備、細胞と遺伝子型の数によって異なります。1 つはよく 10 を変換することができます十分百万 c キット+細胞。4 ° C で一晩プレートを孵化させなさい
    2. 次の日は、ピペット、ピペット 2 mL 室温で 30 分間インキュベートして、プレートをブロック 1 × PBS で 2 %bsa を滅菌と井戸から、フィブロネクチンを削除します。真空を介して BSA を削除し、ピペット 2 mL の 1x PBS の徹底的に洗浄、真空を介して削除します。
    3. すぐに追加新たに収集、フィルター (0.45 μ m) で 5 mL までのウイルス上清。32 ° C で 435 x gで遠心分離機の 2 h.、培養上清による真空を削除追加たて収集したウイルス上清でこの手順を繰り返すし、再びスピンします。培養上清による真空を削除し、2 mL の 1x PBS; を追加することによって洗浄その後、経由で真空それを削除します。
    4. C キット+マウス細胞、培養に一晩 (ステップ 4.6.6) ウイルスのコートの井戸によって細胞懸濁液をよく混合され今ウイルス濃縮フィブロネクチン プレートにそれらをピペッティングを追加します。1,200 x g細胞を 37 ° C、5% CO2インキュベーターに入れて 90 分 25 ° c で回転します。
    5. 48 h posttransduction は 4 ° C、5 分で 1,200 × gで遠心分離によって細胞をペレットし、FACS バッファー (1 x PBS + 0.5 %bsa) #1 6 x 106/mL でそれらを再懸濁します。YFP フローサイトメトリーを使用して肯定的な率を測定することによって BCR ABL1 陽性細胞の割合を決定します。
    6. 標準的な手順を持つイベントを取得します。まず、ゲート前方および側面の散布図に基づいて生きているセル。その後、ゲートの否定的な制御 (図 4) によって決定される YFP negativecells を除く YFP 肯定的な生きているセル。

6. コロニー形成 UnitAssays

  1. 1-2 h. 因数 3 ml 針なし 5 mL シリンジを使用して FACS チューブでセルロースの室温でマウスのサイトカインとセルロースを解凍します。セルの並べ替えアイコンで、YFP 陽性細胞を並べ替えます。
  2. セルをスピンダウン、IMDM 完全なメディアでペレットを中断します。めっきして、IMDM 完全なメディアの 100 μ L 5,000 YFP 陽性細胞を取得するそれらを希釈するセルをカウントします。
  3. 5,000 YFP 陽性細胞とセルロース 3 mL に適切な阻害剤を含む細胞懸濁液を 100 μ l 添加 (材料の表を参照してください)。10-30 s のミックスに高渦。
  4. 泡が脱出した空気のほとんどは後、1 つの側面上のメディアを取り出し、ゆっくりと均等に円形の動きでプレートを傾斜によって 3 つの複製 3 cm プレート内のメディアの 1 つの mL をプレートに 1 mL の注射器を使用します。
  5. 使用する阻害剤の最終濃度は、単独または組み合わせで 3 μ M、0.2 μ M で DFC と 0.5 μ M で BCI でイマチニブをします。必要に応じて、めっきセル 4 hydroxytamoxifen (1 μ g/mL)、セルロースに追加 C-fos を削除します。
  6. めっき、真ん中に滅菌水 2 mL を含む 1 つのオープン皿の大きいペトリ皿でプレートを置きます。大型シャーレをカバーし、慎重に 37 ° C、5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。めっきの 1 週間後、顕微鏡下での植民地の合計数をカウントすることによってコロニー数を記録します。
  7. PCR による C-fos 削除の適切なプレートからいくつかの植民地を分析します。P1000 先端でそれらを吸引することによりコロニーを収集します。複数回、PBS で先端を洗浄することにより 500 μ L の 1x PBS で細胞を遊離させます。6,000 × gで 1 分で細胞懸濁液を回転し、ゲノム DNA 分離キットを用いて細胞ペレットから DNA を抽出します。
  8. ゲノム DNA を PCR プライマー mFos フリー走行 3 と mFos 使用のため使用-rp 5、表 2で説明したよう。2% の agarose のゲル、ゲルのドキュメンテーション システムを使用して、イメージの PCR の製品を分析します。
  9. 植民地のグラフィック プレゼンテーションのため Iodonitrotetrazolium 塩化物を使用してコロニーを染色します。Iodonitrotetrazolium 塩化物 1 mg/mL の溶液を得るために水 10 mL で 10 mg を溶解します。フィルターは、0.2 μ m フィルターをティッシュ文化フードの無菌条件下で 10 mL の注射器に接続されている、ルアーロックを使用してソリューションを殺菌します。
  10. ティッシュ文化フードの CFU プレート周り滴下染色液 100 μ L を追加します。スライドまたは植民地を邪魔しないように注意します。37 ° C、5% CO2セル文化インキュベーターで一晩版を孵化させなさい。植民地茶色暗い赤になります。滅菌のティッシュ文化フードの白い背景を使用して、ステンド グラスの CFU プレートの写真を撮る。

7. 移植と死亡率試験

  1. 致死的マウスを 4.75 Gy 続いて 7.0 Gy の用量で 137 Cs ベースの γ-線を使用して分割放射線照射 (0.5 Gy/分)、移植の前に離れて 3 h。
  2. 4 x 10 を移植4並べ替えずに YFP 正 (YFP の割合に基づいて計算) 尾を通して、それぞれのマウスにキャリアとして 3 × 105正常骨髄細胞と細胞は静脈注射。
  3. 移植の 1 週間後に、FACS を用いた末梢血から YFP 陽性細胞を分析することにより、生着を決定します。
  4. 尾静脈出血と FACS 解析を実行します。
    1. 過熱したり、やけどしないように注意し、熱ランプの下でマウスのケージを暖めます。
    2. マウス落でマウスを抑制し、滅菌ブレードで尾静脈をニックします。そっとミルクを蓄積する血の滴を許可する後部の前方から尾。それが塗りつぶされるまでヘパリン毛細管血を収集 (収集の周り 75-100 μ L)。EDTA を含む血のコレクションの管に充填キャピラリー チューブから血を突入し、よく混ぜます。
    3. 3 mL の 1 x RBC 換散バッファー (150 mM 塩化アンモニウム、炭酸水素カリウム 10 mM、0.13 mM EDTA) に血の 30-40 μ L を追加することにより、赤血球を溶解させます。ミックスも、複数回チューブを反転します。5 分、上清経由で真空を削除し、2 mL 洗浄の 1x PBS でペレットを中断で 10-15 分間スピン 1,200 x g 4 ° C で、室温で孵化させなさい。
    4. 1,200 x gで 5 分削除上清の 4 ° C で回転し、FACS バッファー #1 にそれを中断します。上記のステップ 5.2.5–5.2.66 の FACS 解析を実行します。短期ストア 4 ° C で様々 な目的に使用できるコレクションの管で血の残り
  5. 10-40% 示した末梢血 YFP 陽性細胞移植マウスは実験のために使用されました。YFP 陽性細胞の 2% 未満だったマウスの研究から除外されました。
  6. タモキシフェン 20 mg/ml で完全に溶解するまで断続的なボルテックスで 60 ° C でコーン油を準備し、治療期間の暗闇の中で 4 ° C で保存します。移植 1 週間後タモキシフェン (コーン油 100 mg/kg) を腹腔内に注入することにより C-fosフロリダ州/フロリダ対立遺伝子を削除 (i. p.) マウスに 3 日間連続の毎日。注入する量のタモキシフェンを決定するマウスの重量を量ったことが重要です。タモキシフェン治療後 (必要に応じて)、薬物治療のためマウスのグループ (n = 5/グループ)。
  7. 白血病の進行と生存のためのマウスを監視し、白血病負担 (FACS による YFP 陽性細胞) の毎週存続マウスに 8 週間までを決定します。
  8. セクション 6 で上記のよう必要に応じて、C-fos 削除のために血液を分析します。毎日存続マウスの数を記録し、グラフ作成ソフトウェアを使用して実験の終わりに生存曲線をプロットします。

8. BCR ABL1 白血病のトランスジェニック マウス モデル

  1. LSK の分離
    1. BCR ABL1 発現を防ぐためにドキシサイクリン チョウの Scl tTA トランスジェニック マウスを維持します。移植前に 4 週間取るオフ ドキシサイクリン投与マウス BCR ABL1 式の食事。
    2. セクション 4 で上記のように、Scl tTA トランスジェニック マウスから TMNCs を分離します。(1 x PBS + 0.5 %bsa + 2 ミリメートルの EDTA) 106セル/mL を取得するバッファー FACS #2 に TMNCs を中断します。
    3. 系列細胞検出カクテル ビオチンの 10 μ L を追加することでリネージュ陽性細胞の TMNCs を使い果たす (CD5 モノクローナル抗体、ビオチン化 [ラット IgG2a]、CD11b [ラット IgG2a]、CD45R [B220] [ラット IgG2a]、反-7-4 [ラット IgG2a]、反-グラム-1 [Ly 6 G/° C、ラットIgg2a 産] と反-テル-119 [ラット IgG2b]) 1 x 10 の6セルあたり。暗闇の中 10 分 FACS バッファー #2 の 5 mL で洗浄後 1,200 x gで 5 分吸引清 4 ° C で完全にスピンし、FACS バッファー #2 の 400 μ L のセルの中断は、4 ° C でセルを孵化させなさい。
    4. 反ビオチン抗体 FITC 共役の 5 μ L、Ly-6 a/E (Sca1) PECy7 の 1.2 μ L と 2.4 μ L まで 108 , 000 セル CD117 (C-kit) APC 抗体の追加します。ボリュームを持って来ることによって室温で 10 分間の洗浄で暗闇の中でインキュベート FACS バッファー #2; 5 mL まで1,200 x gで 5 分削除上清の 4 ° C で遠心し、細胞ペレットを FACS バッファー #2 の 500 μ L で中断します。
    5. ブルー フィルター キャップ FACS チューブに細胞懸濁液をフィルタ リングします。
    6. ゲート前方および側面の散布図を使用してセル ライブ。、MFI を示した林-セルを選択 (10 未満の蛍光強度を意味2) LSK を取得するセル c キット+と Sca1+ 、biexponential の-林親から印刷、並べ替える (図 7 C)。
    7. 並べ替えられた細胞を収集し、4 ° C、5 分で 1,200 × gで遠心分離機のそれら。
  2. 移植
    1. BoyJ マウス移植の前に、3 時間後の 4.75 Gy 7.0 gy 分割線量を照射致死。
    2. 放射線照射した BoyJ マウスに 5 × 10 106ヘルパー骨髄細胞 x 0.33 BCR ABL1 LSK セルに WT BoyJ マウス尾静脈 (静脈) から 3 × 103を挿入します。
    3. 4 週間 posttransplantation CD45.1 および CD45.2 マウス受信者を分析します。尾静脈出血 7.4 の手順で説明したように、末梢血から、TMNC を取得します。FACS バッファーの 100 μ L に細胞を再懸濁します。1 μ L で各 1 時間室温で CD45.1 FITC と PE CD45.2 抗体の細胞を孵化させなさい。
    4. FACS バッファーと 3 mL にボリュームをもたらすことでセルを洗って 5 分上澄みを除去し、1 x PBS の 200 μ L でそれを再懸濁します 1,200 x gで 4 ° C でスピンします。
    5. 最初ゲート前方および側面の散布図、無染色のサンプルに基づいて FITC と PE 陽性細胞のゲーティングに続いてに基づいて生きているセル CD45.1 および CD45.2 の割合を分析します。
    6. マウスを 4 つのグループにグループ化 (n = グループあたりの 6)。イマチニブ治療を開始 (75 mg/kg 2 毎日 x) 単独でおよび DFC + BCI との併用 (2 の 10 の mg/kg の用量で両方の薬を与えられた毎日 x)。
    7. 同様に、3ヶ月間、1 日 × 2 でイマチニブ (75 mg/kg) + クルクミン (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) とイマチニブ (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) BCI (10 mg/kg) の組み合わせで他のグループを扱う注入i. p.
    8. CD45.2 の割合を決定することによって白血病細胞のキメリズムの 6 ヶ月の x マウス 1 を分析の尾によって末梢血細胞は静脈出血前述の肯定的なステップ 7.4。

9. in Vivo 評価 BCI と DFC 活動

  1. リン酸化 p38 解析
    1. セクション 7 で説明した BCR ABL1 表現 c キット+の細胞、移植された 3 つの白血病マウス (8-12 週齢) を取る。I. p. の 4 週間 posttransplant を注入することにより BCI (10 mg/kg) とマウスを注入します。
    2. リン酸化 p38 末梢血供給業者の指示に従ってリン酸化フロー フローサイトメトリー キットを使用して TMNC のレベルを測定します。血薬投与後前に、と 6 h に、各マウスから収集します。赤血球の減少によって、TMNCs を分離し、それらを次のように修正します。
    3. 末梢血の 100 μ L あたり赤血球溶解溶液 4 mL を追加します。ミックスし、赤血球。 スピン 4 ° C で 5 分間 1,200 x gで細胞を溶解し、上清を除去する 5 分間氷の上を孵化させなさい。倍以上の換散 1 を繰り返します。
    4. 2 番目の溶解手順後 PBS で 2 %bsa の 1 mL の細胞ペレットを洗浄します。固定・透過ソリューションの 100 μ L を追加することでセルを修正し、暗闇の中で 4 ° C で 20 分間インキュベートします。4 ° C で 5 分間 1,200 × gで遠心分離によって細胞をペレットします。
    5. 透過洗浄 x 1 の 1 mL にペレットを洗浄します。20 分各 100 μ L の等しい 3 つの因数にセルを分割するため室温で透過洗浄バッファーで 2 %bsa の 300 μ L を追加することによって、細胞をブロック (~ 1 x106)。
    6. 固定セルの各因数、それぞれ合計 p-38 抗体、リン酸化 p38 抗体の 1 μ L またはコントロール IgG アイソタイプの 1 μ L の 1 μ L を追加し、4 ° C で一晩インキュベート
    7. 洗浄セル 1 5 ml の PBS で 2 %bsa の x、二次抗体 (Alexa Fluor 488 共役の 1 μ L) を室温で 1 時間インキュベートします。再び x 1 細胞を洗浄し、200 μ L の 1x PBS でそれらを中断します。
    8. FACS によるデータ集録、流動フローサイトメトリー解析ソフトで分析できます。
    9. 実験サンプルの MFI から IgG コントロールの MFI を差し引きます。BCI 注入後リン酸化 p38 レベルを決定する総 p-38 のリン酸化 p38 の MFI の値に正規化されます。
  2. C-fos 遺伝子の定量的遺伝子発現解析
    1. BCR ABL1 発現 c キット+細胞 7 で説明したように移植した 3 つの白血病マウス (8-12 週齢) を取る。それぞれのマウスから末梢血を収集し、10 mg/kg を各 DFC + BCI のマウスを注入します。
    2. 薬物投与後、末梢血 6 h を収集します。前述のように赤血球減少によって TMNCs を分離します。ペレット、TMNCs とフェノール系の換散バッファーにそれらを中断 (材料の表を参照してください)。
    3. Bcl2l11、Lif、IL-6 遺伝子特定のプライマー (表 1に示されている) を使用して、(前述のセクション 1 で) RT qPCR 分析を実施します。

10. 長期培養開始セルの試金

注:LTCIC 試金は25を前述のように行った。

  1. T175 組織培養のフラスコの中の confluency に MEMα でのマウスの線維芽細胞細胞株 MS 5 を成長します。上記 HEK293T 細胞を trypsinize します。2 x 106セル/mL で MEMα で細胞を中断します。50 mL の円錐管に 10 x 10 の6セルを取り出して 80 Gy で照射します。0.5 × 106セル/mL MEMα 10 %fbs (M10) メディアを補完する細胞を希釈します。12 ウェル プレートのウェルあたり 2 mL をプレートし、37 ° c、5% CO2インキュベーター一晩インキュベートします。
  2. 次の日には、MEMα (1 M 溶液) 5 mL で 2.5 mg を溶解することによりヒドロコルチゾン ナトリウム hemisuccinate を準備します。バイオ セーフティ フードで 0.2 μ m シリンジ フィルターを使用して、ヒドロコルチゾン ソリューションをフィルター滅菌します。100 μ M のソリューションを取得するメモリのシリアル希釈、ヒドロコルチゾンを希釈します。これの 250 μ L を加える人間の長期培養培地 (HLTM) の 25 mL 1 μ M の最終的な集中を達成するために、使用する直前の (材料の表を参照)。
  3. CML CD34+ 、UCP3 TMNCs スピンダウンし簡単なボルテックスによって、HLTM でそれらを中断し、検定によってカウントを決定します。
  4. 間質細胞を播種 12 ウェル プレートから M10 メディアを掃除し、患者細胞の 1 mL に置き換えます (CML CD34+ [10,000]、UCP3 TMNCs [1 x 106]) HLTM の懸濁液。セル タイプごとの薬の組み合わせあたり 3 つの井戸を使用します。
  5. HLTM に必要な濃度の 2 倍薬株式を希釈します。1 x 薬物濃度を取得する上記の細胞に薬剤とメディアの 1 つの mL を追加します。5 週間、毎週新鮮な HLTM でメディアの半分を置き換えます。
  6. 6 週間の LTC IC 分析期間の終わりに、文化からの管に非粘着性細胞を収集します。付着性のセルを trypsinize し、対応する非粘着性細胞とそれらを組み合わせます。
  7. セルロース中含む 30% ウシ胎仔血清エリスロポエチン (3 単位/mL)、SF でセルと CFUs のアッセイを洗う (50 ng/mL) と IL-3(20 ng/mL)、IL-6 (20 ng/mL)、G-CSF (20 ng/mL) と顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) (20 ng/mL). 診断によって、数を確認します。
  8. 3 つのレプリケートのプレート 5 × 104セルします。20 %fbs と 10 %dmso の残りのセルをフリーズします。途中で水を含んでいる 1 つの開いている皿で大きいペトリ皿でプレートを配置できます。慎重に大きいペトリ皿をカバーし、37 ° C で 2 週間 5% CO2インキュベーターで孵化します。
  9. 2 週間後に植民地を獲得します。いくつかのケースでのみ収穫の一部は試金される CFUs の)。セル収穫の一部から得られる CFUs に基づいて LTCIC を外挿して初期細胞懸濁液に存在の合計数を計算します。LTC IC あたり平均 CFU 出力は 8 です。
    注:たとえば、最初 1 × 106セルは 5 週間後, 中でも、メッキされた場合 0.5 × 10 の6セルが収穫された、CFU の 5 x 10 の4セルがメッキし、50 CFUs が得られました。これは 500 CFUs/1 百万めっきされたセルに相当します。この数値を 62.5 である、LTCIC を取得する 8 で除算します。

11. ヒト化マウスを用いた CML cd34 陽性細胞の+

  1. 人間 IL3 を表現する「8 週齢うなずく scid ガンマ マウスを照射に対する GM-CSF と SCF の (の NSGS)、50 ラド/min と 7.0 Gy (700 ラド) の単回投与で。
  2. 3 × 106 CD34 を注入+選択したセル BCR ABL1 陽性慢性骨髄性白血病慢性期患者から放射線照射したマウスに静脈注射によって。
  3. 移植の 2 週間後、CD45 に対するマウスおよびひと特異抗体を用いて FACS による骨髄で白血病細胞の生着を確認します。
  4. FACS 解析を実行します。
    1. 移植マウスの大腿骨から骨髄液を取る。RBC の換散バッファーを使用して前述の赤血球を溶解し、遠心分離によって、TMNCs を収集します。ペレット 1 冷 1x PBS で x。
    2. 人間の FcR ブロックとマウス FcR ブロック CD45 FITC と 4 ° C で一晩抗マウス CD45 APCCy7抗ひととの汚損によって続いて細胞をブロックします。LSRII に FACS 解析を行い、フロー フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを分析します。
  5. マウスに 4 つの異なるコホート グループ化 (n = 6/グループ) 車両、イマチニブ (75 mg/kg)、DFC + BCI (両方 10 mg/kg)、またはイマチニブ (75 mg/kg) + DFC + BCI (10 mg/kg の両方) の治療のため。1 × PBS (車) で在庫の薬を希釈し、i. p. 2 を注入する管理 × 毎日。
  6. 6 週間のマウスを治療し、11.4 前述移植後 8 週まで 2 週毎白血病の負担を決定します。

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結果

癌遺伝子の中毒は、この治療効果に関与しています。ただし、遺伝子依存性の駆動メカニズムは理解されていません。中毒の調整に関与する遺伝的要素を識別するために複数の公平な遺伝子発現解析を行った。これらの分析には、3 つの遺伝子、C-fos、Dusp1 と Zfp36、がん細胞、がん化シグナルの生存のために依存しない、したがって、TKI 治療に敏感ではないでのアップレギュレーションが明らかにしました。ShRNA を介したノックダウンによる C-fos と Dusp1 のダウンレギュレーションがそうでなければ TKI 耐性の薬剤感受性を復元するための十分なセル。

白血病の治療上のターゲットとしての C-fos と Dusp1 の役割を検証するのには、BCR ABL1 遺伝子を発現する BaF3 細胞を使用しての過剰発現が初めて確認されて。成長因子 BA BaF3 細胞内シグナル等遺伝子依存性;結果として、彼らは TKI 治療に応答しません。Rt-qpcr と西部...

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ディスカッション

癌細胞の一括、TKI 治療に対しては腫瘍がはまっているチロシン キナーゼ腫瘍信号の封鎖によって媒介されます。しかし、比較的少しは MRD に貢献する癌細胞の少数が遺伝子依存性と治療4をエスケープする方法について知られています。最近の研究では、ことは白血病や固形臓器腫瘍の薬剤耐性を仲介する成長因子シグナリングを明らかにしました。様々 な分子メカニズムがあります固有抵抗10、11,12の根底にあることが示唆されました。メカニズムを理解し、遺伝子治療開発対象を識別する、包括的な全ゲノム発現マウス (BaF3) と人間 (K562) 細胞を使用して行った。プライマリ骨髄サンプルが大幅に異機種混在、彼らは関連した遺伝子/ターゲットの身元をマスク、疑い、マウスの白血病や慢性骨髄性白血病患者から一次サンプルは使用されませんでした。細胞 (幹細胞) を並べ替えて抗体精製は、重要な多様性を示します。したがって、浄化された細...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は BaF3 WEHI 細胞を提供するため g. q. デイリーに感謝して、MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP の t. Reya を構築します。著者は、CML 爆発危機から患者のサンプルを提供するため m. キャロルに感謝しています。本研究は、NCI (1RO1CA155091)、白血病研究財団と V 財団、NHLBI (R21HL114074-01) から修士に補助金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Biological Materials
RPMICellgro (corning)15-040-CV
DMEMCellgro (corning)15-013-CV
IMDMCellgro (corning)15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin FragmentTakaraT100B
MethoCultGF M3434 (マウスCFU用メチルセルロース)幹細胞3434
MethoCult H4434 Classic (ヒト CFU 用メチルセルロース)幹細胞4434
4-ヒドロキシタモキシフェンSigmaH6278
組換えマウス SCFProspecCYT-275
組換えマウス FLT3-リガンドProspecCYT-340
組換えマウス IL-6ProspecCYT-350
組換えマウス IL-7Peprotech217-17
DFCLKT Laboratories Inc.D3420
BCIChemzon ScientificNZ-06-195
イマチニブLC ラボラトリーI-5508
クルクミンΣ458-37-7
NDGAΣ500-38-9
Penn/StrepCellgro (corning)30-002-CI
FBSAtlanta biologicalS11150
トリプシン EDTA 1xCellgro (コーニング)25-052-CI
1x PBSCellgro (コーニング)21-040-CV
L-グルタミンセルグロ (コーニング)25-005-CL5 mg/mL 水溶液
プロマイシンギブコ (ライフテクノロジーズ)A11138-03
HEPESSigmaH7006
Na2HPO4.7H2OSigmaS9390
硫酸プロタミンΣ P3369mg/mL 水溶液
トリパンブルー溶液 (0.4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (corning)25-950-CQC
WST-1Roche11644807001
0.45μマクロディスクフィルターPALL2016-10
70 μm ナイロン細胞 starinerBecton Dickinson352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)Simga1083
PBSCorning21040CV
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Protease Inhibitor CocktailRocheCO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2SigmaP5762
Nitrocullulose MembraneBio-Rad1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)Thermo Scientific34075
CD5eBioscience13-0051-82
CD11beBioscience13-0112-75
CD45R (B220)BD biosciences553092
CD45.1-FITCeBioscience11-0453-85
CD45.2-PEeBioscience12-0454-83
hCD45-FITCBD Biosciences555482
Anti-Biotin-FITCMiltenyi130-090-857 
Anti-7-4eBioscienceMA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)eBioscience13-5931-82
Anti-Ter-119eBioscience13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7BD 
558612 CD117 APC BD 
BD Pharm LyseBD 
BD Cytofix/Cytoperm(固定・透過化液)BD 
BDパーマ/ウォッシュ (リン酸化流の透過化および洗浄液)BD 
リン酸化p38細胞シグナル伝達技術4511S
合計p38細胞シグナル伝達技術9212
マウスIgG制御BD 
Alexa Flour 488 コンジュゲート InvitrogenA-11034
塩化カルシウムK278001
2x HBSInvitrogenK278002
EDTAAmbionAM9261
BSASigmaA7906
毛細血管Fisher22-260-950
採血管Giene Bio-One450480
新生子牛血清アトランタ 生物学的S11295
エリスロポエインアムジェン5513-267-10
ヒト SCFプロスペックCYT-255
ヒト IL-3プロスペックCYT-210
G-SCFプロスペックCYT-220
GM-CSFプロスペックCYT-221
MyeloCult (LTCICアッセイ用培地)幹細胞技術5100
ヒドロコルチゾン 半琥和酸ナトリウム幹細胞技術7904
MEM αGibco12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 インスリン注射器 28 G1/2ベクトン ディキンソン329461
モルトール クア テック 60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)Butler Schien29405
SOCNew England BiolabsB90920s
AmpicillinSigmaA0166100 mg/mL 水ストック
バクト寒天(寒天)Difco214050
Terrific brothBecton Dickinson243820
AgaroseGenemateE-3119-500
ドキシサイクリン チャウTestDiet.com52662変性RMH1500、オートクレーブ可能 5LK8  0.0625% ドキシサイクリン 
タモキシフェンシグマT5648
ヨードニトロテトラゾリウムクロリド SigmaI10406
Kits
Dneasy 血液&組織キットQiagen69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)PromegaM1722
miRNeasy Mini Kit (RNA単離キット)Qiagen217084
DNA Free Dnase Kit (RT PCR の DNAse 治療)Ambion, Life TechnologiesAM1906
Superscript III First Strand Synthesis (cDNA 合成の逆転写酵素)Invitrogen18080051
SYBR Green (qPCR 用の緑色のインターキャレーティング色素と taq ポリメラーゼミックス)Bio-Rad1725270
CD117 MicroBead KitMiltenyi130-091-224
ヒト長期培養開始細胞アッセイStemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO シリーズ 8000 WJ CO2 インキュベーターThermo scientific
スイングバケットローター セトリフュージ 5810REppendorf
TC-10自動セルカウンターBio-RAD
C-1000 サーマルサイクラーBio-RAD
Mastercycler Real Plex 2Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (ゲルおよびウェスタンブロット用イメージングシステム)Bio-RAD17001401
Hemavet (boold counter)Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)BD 
フォルテッサI(FACSSアナライザー)BD 
FACSAriaII(FACSソーター)BD 
マグネットスタンドミルテニー
照射器 J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CAMark I Model 68Asource Cs 137
Mice
ROSACreERT2Jackson Laboratory
Scl-tTA クラウディア・ヒュットナー博士
BoyJ CCHMC
C57Bl/6のマウスコア施設 CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- 自社
ROSACreERT2/c-Fosfl/FL自社製
Cells
BaF3ギフト George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHIGift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cellsシンシナティ
5 553356555899554714554723554121研究室製大学医学部附属病院

参考文献

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