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方法論記事

68Ga 標識アルギニン グリシン アスパラギン酸 (RGD) の準備-血管新生のためのペプチッド

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DOI:

10.3791/58218

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2019年1月7日

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1Division of Applied RI, Korea Institute of Radiological and Medical Sciences

この記事について

サマリー

Αvβ3インテグリンは、高度に血管新生を受けて活性化された血管内皮細胞に発現する接着蛋白質の一種です。したがって、腫瘍に大きな関心はインテグリンの整合性を評価です。68Ga ラベル radiopeptides を準備する方法とその生物学的効果を評価する方法をご紹介します。

要約

Αvβ3インテグリン腫瘍細胞の遊走と血管新生に関与するヘテロ二量体の接着分子であります。インテグリンは、通常低濃度は血管新生腫瘍血管内皮細胞において過剰発現します。Αvβ3のこの特異的発現イメージング薬と抗血管新生の有効なバイオ マーカーになります。機能イメージ投射様相陽電子放出断層レントゲン写真撮影 (ペット) について生化学的・生理学的変化体内、ナノモル スケールでユニークな高感度で提供しています。したがって、radiometal ベース PET 用放射性は、腫瘍の血管新生の非侵襲的な定量化のため大きな注目を集めています。本稿では、血管新生の評価のための新しい radiometal 標識ペプチドを準備する全身プロトコルを提供します。このプロトコルには、放射化学的信頼性、親油性、セル吸収、血清の安定性および薬物動態的特性に関する情報が含まれています。68Ga RGD ペプチドは αvβ3インテグリンに向けて代表 PET リガンドの 1 つであります。68Ga RGD ペプチドおよび生物学的有効性の評価を準備するためのプロトコルを紹介します。

概要

血管新生は、新しい血管の開発によって特徴付けられる生物学的プロセスです。インテグリンは高度に新生腫瘍血管における発現にはないので多くの血管新生に対する抑制要因のうち αvβ3インテグリン侵襲性に関連付けられて通常組織1.

標識の受容体結合ペプチド αvβ3インテグリン受容体に対する親和性が高いは、有望な血管新生イメージング エージェント2,3であるアルギニン グリシン アスパラギン酸 (RGD) ドメインの,4,5,6,7. ペット用に作成されたいくつかの放射性医薬品とその生物学的特性は、様々 な動物モデル8,9,,1011で検証されてきた。放射性核種、に関しては、 68Ga は、他の放射性同位元素の上のいくつかの利点を持っています。まず第一に、それはユーザーに対して高いアクセシビリティを持つし、サイクロトロンが必要ないため経済的に有利であります。第二に、 68Ga に基づく放射性医薬品は単一光子放射断層撮影 (SPECT) より正確な定量化を可能に比べ高い空間分解能を生成します。最後に、 68Ga の 67.71 分の半減期が小さいペプチッドまたは蛋白質の準備のため十分な可能性があります。

68Ga との安定した複合体を生成するには、多くのキレート剤が開発されています。代表的なキレート剤が 1,4,8,11 tetraazacyclotetradecanetetraacetic 酸 (TETA)、1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-四酢酸 (DOTA)、1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-三酢酸 (NOTA)、ジエチレントリアミン酸 (DTPA) と N, N'-di(2-hydroxybenzyl) エチレンジアミン-N, N'-二酢酸 (HBED)。NOTA は、 68Ga (ログ安定度定数 30.98)12,13,14と非常に安定した複合体を形成する報告されています。

本研究の目的は、新しい radiopeptide (図 1) の開発のため簡潔なプロトコルを提供することです。例としては、 68Ga 標識 RGD ペプチドと異種移植モデルにおけるこれらの類縁体の生物学的評価のための現在の方法を準備します。

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プロトコル

すべての動物実験を韓国研究所の放射線医療科学動物研究委員会によって承認されたプロトコルの下でケアと研究の動物の使用のためのガイドラインに準拠して行った。すべての試薬・溶媒が購入し、さらに精製することがなく使用します。文学の方法15NOTA RGD ペプチドを作製しました。

注意: 68Ga は、陽電子とガンマ線の両方を出力します。放射性物質による直接的または間接的な接触を含むすべての実験は、訓練を受け、担当者のみを許可によって行われなければなりません。放射性物質を取り扱い、適切な保護具、シールド、放射線量計バッジとリング、サーベイメータを使用ください。

1. 68GaCl3 radiolabeling RGD ペプチド

注: 68Ga (t1/2 = 68 分、β+ = 89% と EC = 11%) 68Ga から得られた/68Ge 発電機。

  1. 68GaCl3 4 mL でジェネレーターから 0.05 M 塩酸を溶出します。
  2. 5 mL の反応瓶で68GaCl3 333 kBq (1 mL) を乾燥する 30 分の 80 ° C で窒素ガスでパージします。
  3. RGD ペプチドのソリューションを追加 (100 μ g) 1 M 酢酸ナトリウム (100 μ L、pH 5 〜 6) 68GaCl3ステップ 1.2 からバイアル反応するで。
  4. 5 分で 80 ° C で反応混合物を加熱します。その後、室温まで冷却します。
  5. 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で粗製品を浄化します。次のシステムを使用して: C-18 列、0.5 mL/min の流量、1.17%/min (5%-40 %30 分で)、および溶出コンポーネントのアセトニ トリルの勾配斜面: A = B アセトニ トリル中で 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) = 0.1% 水で TFA。
    注: フォト ダイオード アレイ検出器、放射能検知器 HPLC が備わります。68Ga RGD ペプチド 12.5 分 (図 2) の保存時に収集されました。
  6. 結果68固相抽出装置を用いた Ga RGD ペプチドを浄化します。
    1. C18 逆相カートリッジを使用してソリューションを通過し、2 mL の生理食塩水で洗います。
    2. 95% のエタノールの 0.7 ml 68Ga RGD ペプチドを溶出します。20 分間窒素ガス下 80 ° C で溶媒を除去し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 使用する前に、再構成します。
    3. 0.22 μ m の滅菌フィルターを通して radiolabeled 製品をフィルタ リングし、滅菌生理食塩水の溶液の 1 mL に策定します。
  7. ラジオ薄層クロマトグラフィー (TLC) によって放射の収量を確認してください。
    1. インスタントの薄層クロマトグラフィー プレート (ITLC、長さ 10 cm) に 1 μ L をスポットします。スポットから 9 cm まで溶離液 (0.1 M クエン酸酸水溶液、pH 5.0) を含む商工会議所でプレートを開発します。
      注: 68Ga RGD ペプチドの保持係数が 0、未反応68Ga3 +の保持係数は 1 です。
  8. MBq/nmol として放射能に対応する放射能の比から最終的な特定の活動を計算します。
    注: 定式化の68Ga RGD ペプチド高速液体クロマトグラフィーに 100 μ L 注入後非放射性成分の量は非放射性 Ga RGD ペプチドを使用して標準校正曲線から計算しました。

2体外細胞内取り込み。

注: ウプサラ 87 悪性神経膠腫 (U87MG) ひと膠芽腫細胞はダルベッコ変法イーグル培 (DMEM) 10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンの地で栽培されました。セルは、加湿雰囲気 5% CO2の 37 ° C で 150 mm 料理で育った。セル収穫されたり、trypsinization によって分割: 0.25% (w/v) トリプシンと 3-5 分の 37 ° C で PBS で 0.02% (w/v) エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)。

  1. 密度 1 × 106 6 ウェル プレートに種子 U87MG 細胞細胞/ウェル。
  2. 68Ga RGD ペプチドと細胞を孵化させなさい (111 kBq) 30、60、90、120 分 3 通準備サンプル 37 ° C で。
  3. 2 セルの洗浄 2 ml の PBS と trypsinization による収穫の x。3-5 分の PBS で 37 ° C で (w/v) の 0.25% トリプシンと 0.02% (w/v) エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を使用します。
  4. 細胞懸濁液 (500 μ L) と γ カウンターの測定を収集します。
  5. % (セル/合計数のカウント) セルによって化合物のパーセント摂取量を計算します。

3 血清生体外での安定性。

  1. 作りたてのマウス血清 500 μ L、500 μ L の血清、および 500 μ L の PBS を追加します。2 h の 37 ° C で混合物を孵化させなさい。
  2. 指定した時間間隔で ITLC によって評価 (30、60、90、120 分)。ITLC プレートに混合物の 1-2 μ 因数を見つける (移動相: 0.1 M クエン酸)。ステップ 1.7 のようにプレートを開発します。
    注: 標識化合物は、原点にとどまるに対し、 68Ga3 +が溶媒前線に移動する予定です。

4. 脂溶性の定量

  1. オクタノール PBS システムに68Ga RGD ペプチド (3.7 MBq、3.7 μ L) を追加 (1:1、 v/v、1 mL の合計)。
  2. 室温で 5 分間、10,000 × gで遠心する部屋の温度で 5 分間は積極的にバイアルをミックスします。
  3. 各レイヤーから 100 μ L のサンプルを取るし、γ カウンターで放射能を測定します。報告されたログ P 値は、3 つのサンプルの平均値に基づいています。

5. 腫瘍モデル

注: balb/c ヌードマウス (6-8 週古い、女性、 n = 23) この研究に使われました。マウスをペット研究使用された後 (n = 3) 体内 (n = 20) 腫瘍体積が 200 〜 300 ミリメートル3 (移植後 1-2 週間) に達したとき。

  1. 28 G、1/2 インチ インスリン注射器に腫瘍細胞をロードします。
  2. 左の腕地域に 100 μ L の PBS の U87MG セル (5 x 106) を挿入します。
  3. 細胞の注入中に酸素ガス 2% イソフルランとマウスを麻酔します。
    1. ペダル撤退反射次摘心鉗子右後脚の足の指の間での損失によってマウスを麻酔されていることを確認します。放置しないでください動物までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。

6 αvβ3インテグリンを使用してペットの体内の定量化。

  1. 酸素の 2% イソフルランとマウスを麻酔します。
    1. ペダル撤退反射次摘心鉗子右後脚の足の指の間での損失によってマウスを麻酔されていることを確認します。放置しないでください動物までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。
  2. ペット ガントリーの中心に頭を置き。
  3. 静脈内、異種移植マウス モデルを介して1 分の尾静脈に68Ga RGD ペプチド ソリューション (7.4 MBq、200 μ L) を管理します。
  4. 同時に 150 分のリスト モード (ダイナミック スキャン) で PET スキャンを実行します。
    注: ペットの生データは、ユーザー定義時間枠 (つまり、30 分毎) が再建されました。マイクロ コンピューター断層撮影 (CT) スキャン、PET スキャン後 (0.16 x 線 50 kVp mA) 減衰補正を行いました。

7.体外体内

  1. 68Ga RGD ペプチド (0.37 MBq、200 μ L) をノックアウト マウスの尾静脈に注入します。酸素ガス 2% イソフルランとマウスを麻酔注射時に。
    注: balb/c ヌードマウス、5 章で説明するよう 4 つのグループに分けされ、異なる時点で犠牲に (n = グループあたり 5)。
  2. マウス68Ga RGD ペプチドの投与後すぐに目を覚ます、30、60、90、120 分二酸化炭素安楽死とこれらで犠牲にそれら。
    注: 興味の組織を抽出しました。選択したターゲットには、血液、筋肉、心臓、肺、肝臓、脾臓、胃、腸、腎臓、骨と腫瘍があった。
  3. 組織の重量を量るし、γ カウンターで放射能を測定します。
    注: 結果が筋肉 (%id/g) 1 g 当たり注入量を百分率で表されます。

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結果

68GaCl3 NOTA RGD ペプチドのキレートは簡単と radiolabeling の収率は 99%。図 2に示すように、反応の不純物が削除されました。68Ga RGD ペプチドの放射化学的純度が 99% 以上と合成の端の特定のアクティビティは 90-130 MBq/nmol (図 3)。

30、1.49%、0.85%、0.36% 0.39% であった68Ga RGD ペプチドの細胞吸収値 60、90、120 分、それぞれ。血清の安定性を示したその68Ga RGD ペプチドを PBS (2 h で安定性 > 92%) と同様、人間またはマウス血清インキュベーションの 2 時間後ほぼそのまま残った。分配係数 (log...

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ディスカッション

本研究では、αvβ3インテグリンとその生物学的評価をターゲット radiopeptide を準備するためのプロトコルを導入しました。伝統的な薬の開発には、複雑な手順が含まれます。大量の参考資料と評価の比較的長い時間を必要があります。提案された方法論は、繊細な評価プロセスを置き換えることはできません、ただし、このシステムはスクリーニング目的のため使用できます。これは、提案のシステムはかなり時間とコストを削減します。

過去 10 年間多く radiolabeled RGD ペプチドはイメージング腫瘍16のラジオト レーサーとして広く研究されています。臨床試験の有望な放射性医薬品を得るためには、医薬品開発のための体系だったアプローチを提供べきであります。放射の可能性、ターゲット、代謝安定性および適切な薬物動態を高選択性親和性は、4 つの主要な関心事です。ルーチン ペット研究合理的な放射の収量は、放射性医薬品の信頼性を確認します。高親和性の問題 (> nM) と選択性 (> 100 x) 蛋白質ター...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、原子力の研究と国立研究財団の韓国 (NRF) 交付金 (号 2017M2A2A6A02019904) の韓国の政府によって資金を供給の開発プログラムによって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
68Ga/68Ge発電機ITGCompany-10mCi 
塩化水素溶液Sigma-aldrich84429
酢酸ナトリウムSigma-aldrichS2889
C18 逆相カートリッジWatersWAT020515
0.22-μm 滅菌フィルターミリポアSLGV033RS
ラジオ-TLC スキャナーBioscanAR2000
ITLC 論文AgilentSGI001
クエン酸Sigma-aldrich251275
HPLCWaters-Waters1525 システム、バイナリポンプ、フォトダイオードアレイ (Waters 2998)、放射能検出器 (Raytest, Gabi)
アセトニトリルJ.T. Baker14-650-359
トリフルオロ酢酸Sigma-aldrich302031
ダルベッコの変性イーグル培地 サーモフィッシャー科学11965092
ウシ胎児血清サーモフィッシャー科学16000044
T175フラスコ コーニングCLS431080
トリプシン-EDTA(0.25%)サーモフィッシャー科学25200072
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャー科学15240112
&γ;カウンターパーキンエルマー-1480ウィザード3
スリンシリンジベクトンディキンソン326105
シンリンジポンプハーバード装置70-4500
マイクロPET / CTシーメンスインヴェオン-
イン

参考文献

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