P19マウス胚癌細胞株(P19細胞株)は、生体内分析に比べて大幅に簡素化された神経新生の分子機構の研究に広く用いられている。ここでは、P19細胞株におけるレチノイン酸誘発神経新生に関するプロトコルを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
マウス胚由来の奇形癌に由来するP19細胞株は、3つの生殖層に分化する能力を有する。レチノイン酸(RA)の存在下で、懸濁培養P19細胞株はニューロンに分化するように誘導される。この現象は、インビトロで神経新生モデルとして広範囲に研究されている。したがって、P19細胞株は、神経新生に関連する分子および細胞研究に非常に有用である。しかしながら、文献に記載されているP19細胞株の神経分化のためのプロトコルは非常に複雑である。本研究で開発した方法は簡潔で、神経発達異常や神経変性疾患の分子機構解明に一役を果たします。
概要
胚の発達の間に、単一の細胞層は3つの別々の生殖層1、2、3に変換される。生体内で発生する現象の研究可能性を高めるために、便利なモデルとして三次元集合体(胚体)の生成が開発されました。このようにして形成された細胞凝集体は、細胞分化を引き起こす様々な条件にさらされ、胚4、5の発達を反映する。P19マウス胚癌細胞株(P19細胞株)は、ビトロ6、7、8における神経新生研究の細胞モデルとして一般的に使用される。P19細胞株は、典型的な多能性幹細胞の特徴を示し、細胞凝集中のレチノイン酸(RA)の存在下でニューロンに分化し、付着条件下で神経突起の成長を続けることができます。また、未分化P19細胞株は、ジメチルスルホキシド(DMSO)9、10、11、12の影響下で筋肉および心筋細胞
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プロトコル
1. 文化維持
- メンテナンス培地中のP19細胞株を培養する(10%FBS、100単位/mLペニシリンおよび100単位/mLストレプトマイシンを補充した4,500mg/Lのグルコースを含むダルベッコの改変イーグル培地)。37 °C および 5% CO2でインキュベートします。
2. サブ培養細胞
- 細胞が約80%の合流点に達すると、使用した培地を細胞培養フラスコから除去する(表面積25cm2)。
- カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の2mLで細胞を洗浄します。
- 0.25%トリプシン-EDTA(エチレンディアミンテトラセチン酸)の1 mLを細胞単層に加えます。
- フラスコをCO2インキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に2~3分間入します。
- フラスコサーフェスへのセルアタッチメントを評価します。すべてのセルがデタッチされ、培地内に浮動していることを確認します。
- メンテナンス培地の9mLを加えて、トリプシンの酵素活性を止める。
- メンテナンスメディアでセルを再中断します。
- 細胞を15mLチューブに移し、遠心分離機を200xgと室温(RT)で5分間遠心分離機に移しま....
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結果
P19細胞株における神経新生誘導のためのプロトコルの簡略化されたスキームを図1に示す。未分化状態および神経新生中にP19細胞株の特性を定義するために、RT-PCR(逆転転写-ポリメラーゼ連鎖反応)法が用いた。未分化されたP19細胞株は、有機カチオン/カルニチントランスポーター4(Oct4)およびナノホメオボックス(ナノグ)などの多能性遺伝子を発現した。RAの存在下での懸濁培養における細胞凝集によって誘発される神経新生は、Oct4およびNanog発現の急激な減少をもたらした。逆に、ニューロンマーカーの発現:微小管関連タンパク質2(Map2)、NeuN(RNA結合タンパク質とも呼ばれ、キツネ-1ホモログ3(Rbfox3))は、誘発された神経新生後に増加した(図2)6 <.......
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ディスカッション
ここでは、P19細胞株を用いて神経新生に対する簡単なプロトコルについて説明する。この点に関して多くの報告が発表されているが、P19細胞株を用した神経新生誘導の詳細な方法論は不明のままである。また、実験全体で10%FBSの簡易高グルコース(4,500mg/L)DMEM培地を利用しました。これにより、ユーザーフレンドリーな方法で神経原性実験を行い、将来的にこの方法の使用を拡大することができました。
このプロトコル内で最も重要な点は、RA濃度と懸濁培養中の細胞凝集体の生成です。P19細胞株における神経新生の刺激は凝集体の形成なしに行うことができるが、産生される神経細胞の数は細胞培養22において3分の2減少する。Monzoらは、単層15でそれらを培養することによりP19細胞株における神経新生誘導を示している。その方法は懸濁培養プロセスを排除できるため非常に便利ですが、その方法を他のよく記述された方法と比較するには、さらなる研究が必要です。培地中の0.5μMのRA濃度は、RAの1μMと比較してめっ.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
この研究は、ポーランド国立科学センター(助成金なし)によって財政的に支援されました。UMO-2017/25/N/NZ3/01886)とKNOW(リーディング国立研究センター)科学コンソーシアム「健康な動物-安全な食べ物」、科学・高等教育省の決定 05-1/KNOW2/2015
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 6x DNAローディング色素 | EURx | E0260-01 | |
| アガロース | シグマ- アルドリッチ | A9539 | |
| cDNA合成キット | EURx | E0801-02 | |
| DAPI(4′,6-ジアミジン-2&プライム;-フェニルインドール二塩酸塩) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | 使用濃度:1 μg/mL |
| DMEM 高グルコース (4.5 g/L) と L-グルタミン | ロンザ | BE12-604Q | |
| エタノール 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 抗体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | PA517646 | 希釈 1:100 |
| PCR 反応キット | EURx | E0411-03 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン 10K/10K | ロンザ | DE17-602E | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1x Ca2+、Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| レチノイン酸 | Sigma- Aldrich | R2625-50MG& | nbsp;99.8%エタノールに溶解した。-20°で保存します。C 最長 6 か月 |
| 二次抗体 (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | 希釈率 1:500 |
| スキムミルク | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| トリプシン0.25% - HBSS中のEDTA、なし Ca2+、Mg2+,フェノールレッド | セラ | LM-T1720/500 | |
| 細胞培養プラスチック | |||
| 1mL 血清学ピペット | Profilab | 515.01 | |
| 10mL 血清学ピペット | Profilab | 515.10 | |
| 懸濁培養専用皿 | Corning | C351029 | |
| 15 mL遠心分離チューブ | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL 血清ピペット | Profilab | 515.05 | |
| 6 ウェルプレート | Corning | CLS3516 | |
| 細胞培養フラスコ、表面積 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
参考文献
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488(2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapte....
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