慢性的な高眼圧症は、ラットおよびマウス、緑内障と網膜神経節細胞の構造と機能の劣化につながる circumlimbal 縫合を適用することによって誘導されます。
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この記事について
サマリー
要約
Circumlimbal 縫合は、慢性的な眼圧 (IOP) 緑内障のよく知られている危険因子を高めることによって齧歯動物で実験的緑内障を誘発するテクニックです。このプロトコルは、長い期のラットと c57bl/6 マウスにこの手法を順を追って示します。全身麻酔下で「巾着」縫合糸は結膜、赤道周りや目の角膜の後ろ側に適用されます。仲間の目は、未処理のコントロールとして機能します。ラットの 8 週間と 12 週間のマウスの時代、我々 の研究期間にわたって IOP は上昇残った意識動物局所麻酔なしでリバウンド トノメトリで定期的に測定されました。両種で縫合の目は網膜機能の内部優遇の網膜機能不全と一致を示した。光干渉断層計は、網膜神経線維層の選択的な間伐を示した。断面を見つけたラット網膜組織減少神経節細胞層の細胞密度が他の細胞の層に変化はないです。フラット マウント マウス網膜神経節細胞特異的マーカー (RBPMS) と染色性神経節の細胞の損失を確認しました。Circumlimbal 縫合はシンプル、最低限ラットおよびマウスの神経節細胞傷害につながる眼圧を誘導するために侵襲的で費用効果の高い方法です。
概要
動物モデルでは、携帯の実験室調査のための重要なプラットフォーム潜在的な治療上の介在を評価する基になる緑内障の病因、同様の処理を提供します。いくつかの誘導型モデルは、持続的な眼圧 (IOP) 上昇、緑内障の最も重要なリスク因子を生成する開発されています。眼圧を高めるに適用されている方法があります:1レーザー光凝固小柱網2の輪部静脈3、およびように物質の眼注射の静脈の上強膜における高張生理食塩水注入ゴースト赤い血液細胞4、ミクロ粒子のニキビトリートメント5,6と粘弾性エージェント7。それぞれの方法には、利点と限界があります。
外傷、炎症、メディアの混濁など最小限の合併症との病気プロセスを模倣しては、緑内障のための良いモデル。これらの合併症は、眼圧上昇を誘導するための手順と頻繁に関連付けられる、結果の解釈を混同することができます。たとえば、前房穿刺異物が起きない場合でも示されているトラウマと典型的な緑内障性変化8,9の代表ではない炎症を起こす。、炎症を避けることの重要性だけでなく生体内イメージングと疾患の進行をモニターする電気生理学を容易に光学的透明度を維持します。これらの合併症が病気の調査に影響を与えるどの程度まで明確ではありませんがモデルの誘導中に目を貫通しないようにするより良いことがあります。Circumlimbal 縫合アプローチ地球の侵入を回避し、生体内で網膜の構造と機能の縦断的評価が容易になります。もっと重要なは、このモデルは必要に応じて縫合の除去によって眼圧を基準値に戻りますその容量で以前のものとは異なります。IOP 正規化は細胞を調査に役立つかもしれないし、分子相関可逆・不可逆的な神経節の細胞傷害10、11,12,13,14。
モデル誘導する手法について説明します。ラットおよびマウスのこのモデルによる網膜の損傷の評価の場合15,16,17,18,19に詳しく別の場所で見つけることができます。
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プロトコル
すべての実験手順は、オーストラリア国立保健医療研究評議会によって設定の科学的な目的のためケアと動物の使用のためオーストラリアのコード練習で行われました。ハワード Florey 研究所動物倫理委員会から倫理が承認された (承認番号 13 044 UM と 13 068 UM ラットとマウス、それぞれ)。
1. 意識下ラットにおける眼圧測定
- 研究室のリバウンド眼圧計をラットの設定に設定します。動物を落ち着かせる柔らかい布の部分で目がさめているラットを押さえつけます。頭と首を公開します。優しく捜査員の胸に休んで動物の背中を片手で胴を保持します。
注: 局所麻酔は必要ありません。 - IOP プローブの先端が約 2 〜 3 mm から離れておよび垂直角膜頂点にようにラットの目には、近くリバウンド眼圧計を持ってもう一方の手を使用します。右手を使用して動物の右目と左目に左の手で眼圧を測定します。
- 落ち着かせ、測定ボタンを一度押ラットの数秒を待ちます。IOP プローブの先端は優しく角膜頂点を一度ヒットを観察します。一度リバウンド眼圧計のビープ音を聞きます。
注: 単一のビープ音、眼圧計の測定に成功、液晶画面から読むことができますを確認します。ビープ音は、測定エラーを示します。測定誤差はプローブと角膜、眼圧計、または、まぶたや角膜の非中央部に印象的なプローブの向きの過剰な傾きの不適切な作動距離などの要因から生じる。測定誤差に関する詳細については、製造元からリバウンド眼圧計のマニュアルを参照してください。 - 手順 1.3 1-2 秒の間隔で 10 回、これらの測定値からその時点の平均眼圧値を派生させます。5回読んだ後、眼圧計をリセットします。
- シリアル監視の日と21日 IOP サイクル20,による変動を最小限に抑えるための一貫した照明条件下で同時に眼圧を測定します。
2 意識下マウスにおける眼圧測定
- リバウンド眼圧計を製造元の指示に従ってマウスの設定に設定します。
- 手でマウスを牽制するには、グリルのケージの上にマウスを置くし、優しく後方、しっぽを引っ張る。
注意: これはその体を伸ばす少し前脚自体を楽しみ、プルしようと金属のグリルの上にグリップする動物を求められます。- 耳の後ろにすぐにたるんだ皮膚を把握するのに他の手を使用します。薬指と中指の間 (または小指と手のひらの間) の尾を保持することによって動物の下半身を固定します。
注: 試みきつすぎる、窒息、目の圧力を避けるために皮膚を把握していません。
- 耳の後ろにすぐにたるんだ皮膚を把握するのに他の手を使用します。薬指と中指の間 (または小指と手のひらの間) の尾を保持することによって動物の下半身を固定します。
- (当初は持ち株尾) 今のところ無料の手で、IOP のプローブの先端が約 2 〜 3 mm と垂直から角膜頂点にマウスの目に近いリバウンド眼圧計をもたらします。もう片方の目を測定するには、もう片方の目が、眼圧計の前に配置されるようにマウスを回転させます。
- 落ち着かせ、一度測定ボタンを押してマウスを待ちます。IOP プローブの先端は優しく角膜頂点; をヒットを観察します。成功の測定を確認する単一のビープ音。
注: ビープ音は、測定エラーを示します。最初の実験は、測定しながら 2 番目の実験者の読み取りとドキュメント眼圧測定値があることがあります。 - 2.4、IOP を派生させる 10 の成功した読み取りを取得する手順を繰り返します。5回読んだ後、眼圧計をリセットします。測定値間 1 〜 2 秒の間隔を許可します。
- ラットのシリアル測定に従って日のおよび一貫した照明条件下で同時にマウス眼圧を測定します。
3. 麻酔下ラット ・ マウスでの眼圧上昇の誘導
- 70% エタノールで 0.5% クロルヘキシジンと手術のベンチをクリーンアップします。滅菌ドレープとベンチをカバーします。オートクレーブあらかじめすべての手術用機器。すべて実験者着用適切な個人用保護具 (マスク、ガウンと滅菌手袋) を確認します。
- 全身麻酔を誘導するには、誘導室に動物を配置します。3 L/分の流量で O2 3 3.5% イソフルランを提供します。
- 2 L/分配信を介して手術中齧歯動物マスクで 1.5% イソフルレンで麻酔を維持します。足ピンチ反射の不在によって麻酔の十分な深さを確保します。
- 約 60 呼吸/分で呼吸を維持するために必要があるときの流量を調整することによって呼吸抑制を避けてください。
- 未処理のコントロールとして機能する反対側の眼の眼圧を誘導するために 1 つの目をランダムに選択します。局所麻酔のため 0.5 %proxymetacaine 点眼液の一滴を植え付けます。眼の表面をきれいにするには、通常生理食塩水 3 mL で目を洗います。
- 縫合するのに目を公開、滅菌穴あき外科ドレープの動物をカバーします。
- 世界中の眼球結膜に巾着縫合を実行します。ラットでは、織りの 7/0 の並列ナイロン縫合糸と 2 mm 後方に角膜 (図 1)。マウスで、角膜の後方 1 mm で 10/0 ナイロン縫合糸を配置しています。
- 強膜に浸透しないように注意してください。手術中に突然瞳孔の拡張では、強膜に侵入された可能性が高いことを示します。
- ラットでは, 5-6 アンカー ポイントとマウスの 4-5 アンカー ポイントを使用して結膜の縫合のアンカー。
- これらの静脈の交差点で結膜の下に縫合をスレッドによって主要な上強膜静脈に直接圧縮を避けます。
注: ラットにおける主要な上強膜静脈の圧縮を避けることをお勧めします、間ない日常的にこれはマウス マウスの目でこれらの静脈の低可視性のために。主要な静脈は直接圧縮されていない、にもかかわらずそれは小型船の上強膜静脈叢で、持続的な眼圧上昇する要因となる可能性があります圧力下でする可能性があります (眼圧上昇のメカニズムの議論を参照してください)。
- 後 2 番目の簡単なノット (図 1) に、スリップ ノットを結ぶことによって巾着縫合を締めます。過度に高いの手術後 IOP スパイクを避けるためには、すぐに 2 番目の結び目を固定する前に IOP を測定助手を持っています。
- IOP は高すぎることが判明、部分的に縫合 (図 1の矢印) の一方の端に緊張を解放によってスリップ ノットを調整します。
- 目的の IOP が達成された後 (ラットまたはマウスで 30-40 mmHg で理想的には 30 〜 60 mmHg) 縫合 (図 1の矢印) の最後に連続的な牽引力を維持しながら 2 つ目の結び目をネクタイ。
- 結び目が厳しく 2 番目の後、任意の異物感を最小限に抑えるため縫合糸の両端をトリミングします。全身麻酔からの回復の間に動物を監視します。
注: 目に十分な内方圧縮を確認するときに最初の結び目を結ぶスリップ ノットを使用することが重要です。数週間後に通常、両端になる結膜に埋め込まれている注意します。
4. 監視 IOP
- イソフルラン麻酔下で手術後 2 分で最初の眼圧測定を取る。齧歯類は前述の手順 1 および 2 に従って意識を取り戻したとき、その後、IOP を監視します。
注: は、最初の 1 週間で毎日、週に一度か二度あたり (2 分と 1 時間)、最初の日の間に二度 IOP を監視します。
5. 網膜の構造と機能の試金
- ケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与を用いた全身麻酔下での (この場合は 8 週間ラットとマウスの 12 週間後) の目的実験終了点で説明されているようにバクテリオロドプシンの網膜電図 (ERG) と網膜の機能を測定します。他の場所でより詳細に15、16,17。
注: 我々 は堅牢な発見した神経節細胞の機能不全、網膜神経繊維層を薄く、神経節細胞の損失は 8-12 週の間の期間のため。他の人は正常に眼圧上昇14,15の長い期間を採用しています。 - ERG 測定後すぐに網膜神経線維層 (視神経) の厚さおよびスペクトル領域光コヒーレンス断層撮影 (SD 10 月) 16,18を使用して網膜の全体の厚さを測定します。
- 縦断的研究の終わりに、深い麻酔下の動物を安楽死します。
- 組織学は18、たとえば免疫 RNA 結合タンパク質など網膜神経節細胞 (RGC) の特異抗体を用いたスプライシング抗体 (RBPMS) 複数の脳固有ホメオ ボックス/POU ドメイン全体マウント網膜の網膜を解剖します。3 a タンパク質 (Brn3a)16,19,22。
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結果
ラット18とマウス16次の結果以前に報告されている、ここでまとめます。Circumlimbal 縫合は、ラットおよびマウス (図 2) の眼圧上昇の同様のパターンを作り出した。簡単な IOP スパイク、ラットまで 58.1 ± 2.7 mmHg とマウスで 38.7 ± 2.2 mmHg は縫合処理の直後に発見されました。ラットでは、IOP の大きさは 44 ± 6 mmHg と 32 ± 2 mm Hg にそれぞれ153 24 時間に時間の経過と共に徐々 に減少。この初期の IOP スパイク後 IOP は数週間のため比較的安定している残った。実験期間中、眼高血圧 (エイチ) 目 IOP 残ったによる上昇 〜 によってラットでは, 8 週間の 9 mmHg 〜 12 週目に 5 mmHg。
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ディスカッション
Circumlimbal 縫合は、慢性的な高眼圧症の新しいモデルです。元代表の結果が供給された16,18の研究に加えて、最近研究15,23,24,25 の数のこの動物モデルを利用されています。 ,26。これらの以前のレポート間で比較メソッドがモデルの誘導中に眼圧上昇だけでなく、簡単な IOP スパイクの大きさをなど、再現性のある結果を生成することを示しています (後述を参照)。堅牢な RGC 変化を誘発するために必要な眼圧上昇の期間は 8 〜 12 週間の間は、モデルを維持できの長く、研究は眼圧上昇14,
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この作品は国立保健医療研究評議会オーストラリアのプロジェクト助成金 (1046203)、オーストラリアの研究評議会未来フェローシップ (FT130100338) によって資金を供給します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 正常な生理食塩水 | Baxter International Inc | AHB1323 | 手術中に角膜の水分補給を維持する |
| クロルヘキサジン 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | 手術器具の消毒 |
| イソフルラン 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | 専有名:イソフロ(TM)吸入麻酔薬。縫合処置用酸素ガスを混合した医薬品グレードの吸入麻酔薬 |
| 用潤滑剤 | Alcon Laboratories | 1618611 | 独自の名前: Genteal、他の目を湿らせておくための眼の潤滑剤 |
| ニードルホルダー(マイクロサージェリー) | World Precision Instruments | 555419NT | 眼の手術中に針を保持するために |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | 局所眼鎮痛 |
| ハサミ(マイクロサージェリー) | ワールド精密機器 | 501232 | 結紮中に過剰な縫合糸の切り株をカットするために |
| 外科用ドレープ | バイタルメディカルサプライズ | GM29-612EE | 手術中の無菌環境を確保 |
| ラット用縫合針(マイクロサージェリー) | ニンボ医療用ニードル | 151109 | 8-0丸針で取り付けるナイロン縫合糸、刃先3/8、デュアルニードル、縫合長さ30cm |
| マウス用縫合針(マイクロサージェリー) | んぼ医療用針 | 160905 | 10-0ナイロン縫合糸、丸針で取り付ける、刃先3/8、デュアルニードル、縫合長さ30cm |
| ピンセット(マイクロサージェリー) | ワールドプレシジョンインスツル | 500342 | 眼科手術中に組織を操作する |
| リバウンド眼圧計 | TONOLAB、iCare、ヘルシンキ、フィンランド | TV02 | 眼圧モニタリング用 |
参考文献
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