HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立

サマリー

このプロトコルは、ヒト免疫系および肝細胞の両方を有するヒト化マウスを確立するための信頼性の高い方法を提供する。ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞の脾臓内注射を介して達成される二重再構成免疫不全マウスは、ヒト免疫不全ウイルス-1感染の影響を受けやすく、肝臓損傷を再キャパチレートするHIVに感染した患者

要約

ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)に感染した患者の平均余命が増加しているにもかかわらず、肝疾患は罹患率の一般的な原因として浮上している。HIV-1によって引き起こされる肝免疫病理学は、依然として不明なままである。ヒト肝細胞およびヒト免疫系を有する小さな異種移植片動物モデルは、疾患の病因のヒト生物学を要約することができる。本明細書において、ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)移植を介して二重ヒト化マウスモデルを確立するプロトコルが記載され、HIV感染患者で観察される肝臓免疫病理を研究する。二重再構成を達成するために、男性TK-NOG(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^Tm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic)マウスは、マウストランスジェニック肝細胞を排除するためにガンシクロビル(GCV)用量を経頭食内注射し、非筋筋形成調節のためのトレオスルファンを用いる。ヒト肝細胞(HEP)移植およびヒト免疫系(HIS)の発達を促進する。ヒトアルブミン(ALB)レベルは肝臓移植について評価され、フローサイトメトリーによって検出された血液中のヒト免疫細胞の存在は、ヒト免疫系の確立を確認する。ここで説明するプロトコルを使用して開発されたモデルは、HIV-1感染による肝臓損傷の複数の成分に似ています。その確立は、肝炎ウイルス共感染症の研究と抗ウイルス薬と抗レトロウイルス薬の評価のために不可欠であることが証明される可能性があります。

概要

抗レトロウイルス療法の出現以来、HIV-1単感染に関連する死亡が大幅に減少している。しかし、肝疾患はHIV感染^患者1,2の罹患率の一般的な原因として現れた。HIV-1感染を伴う肝炎ウイルスの共感染はより一般的であり、米国ではHIV感染者の10%~30%を占^{める3、4、5}を占めている。

HIV-1および肝炎ウイルスの宿主特異性は、ヒト特異的感染症を研究したり、HIV-1関連肝病因の複数の側面を調査するために、小動物モデルの有用性を制限する。ヒト細胞および/または組織の生着を可能にする免疫不欠性マウス(ヒト化マウスモデルと呼ばれています)は、前臨床試験6、7、8の許容可能な動物モデルである。2000年代初頭にヒト化マウスが導入されて以来、胆嚢突起ヒト肝毒性、HIV-1およびHIV関連神経認知障害を含むヒト特異的病原体、エプスタインバーウイルス、肝炎、および他の複数の前臨床研究感染症は、これらのマウス6、9、10、11で調査されている。CD34+HSPCおよび/またはヒト肝細胞移植のための複数のマウスモデルは、長い間開発され、B型肝炎ウイルス(HBV)関連肝^疾患12の疾患病因を研究するために時間をかけて改善されてきた、^13歳,14.HSPCおよびヒト肝細胞(HEP)移植のためのいくつかのモデルは、NOG(NOD)として知られている株に基づいている。Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Sug/JicTac)^8,13, NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ)¹⁵、 バルブ/C-ラグ2^-/- γ^{-/- γ -/- (Rag2 tm1.1Flv} Il2rg^{tm1.1Flg tm1.1Flv}/J)^12、および fah^-/- NOD ラグ1^-/--il2rγヌル^マウス16.ただし、各モデルには独自の長所と制限があります。例えば、BALb/C-Rag2^上のHEPおよびヒト幹細胞(HSC)のAFC8二重ヒト化マウスは、免疫細胞およびHSCの正常な生着を可能にするが、抗原特異的なT細胞およびB細胞が存在しないこのモデル¹²での応答 .二重ヒト化マウスの再構成における主な懸念は、最適でない生着、異なる組織をサポートするための適切なモデルの欠如、不一致の状態、免疫拒絶反応、または移植片対宿主病(GVHD)、および技術的な新生児による危険な操作や代謝異常による死亡率の高さなどの困難¹³.

ヒト化マウス^{は17年、18年、19}年のHIV研究に長年使用されてきたが、HIV-1による肝臓損傷を研究するヒト化マウスの使用^は20件に制限されている。我々は以前に、二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立とHIV関連肝^疾患8におけるその応用を報告した。このモデルは、肝臓および免疫細胞の堅牢な生着を示し、HIV感染病因を要約する。この議論は、ヒト肝細胞移植における最も重要なステップを含む詳細なプロトコルを提示する。HEPの移植に成功するために必要なHSPCの説明とTK-NOGマウスにおける機能性免疫系の確立についても説明する。これらのマウスをHIV関連肝免疫病因の研究に用いることは詳細である。肝臓特異的ヘルペス単純ヘルペスウイルス1チミジンキナーゼ(HSV-TK)トランスジーンを担持するTK-NOG雄マウスが用いられる。このトランスジーンを発現するマウス肝細胞は、GCVの非毒性用量への短時間暴露後に容易にアブレートすることができる。移植されたヒト肝細胞は、外因性薬物なしでマウス肝臓内で安定に維持^される21.マウスはまた、^{ヒト細胞8}のマウス骨髄にニッチを作成するために、トレオスルファンの非骨髄切除用量で予め定められている。免疫不全のTK-NOGマウスは、HEPおよび多能性HSPCを神経中注射する。その後、マウスは、血液免疫の入力と血清ヒトアルブミンレベルの測定によって、血液および肝臓の再構成について定期的にモニタリングされる。ヒト免疫細胞とHEPの両方に対して15%以上の再構成に成功したマウスは、HIV-1を食前食内注射する。肝臓に対するHIVの効果は、早ければ4~5週間の感染後に評価することができる。HIV-1が使用されているので、ウイルスを処理し、マウスに注入する際に必要なすべての予防措置を取る必要があります。

プロトコル

このプロトコルは、ネブラスカ大学医療センターの機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

注:動物実験を行う前に、地元のIACUCから承認を得る。

1. 臍帯血の処理とヒトHSPCの分離

1. 層流のキャビネットの無菌条件の下で議定書のすべてのステップを行う。
2. ヘパリン化チューブで採取した臍帯血(CB)を採取し、リン酸緩衝生理食生(PBS)を加えて体積を35mLにする。図1に示すように、リンパ球分離培地(LSM)の上にサンプルを重ね、ブレーキなしで4°Cで35分間400xgの層状CBでLSMを遠心分離します。
   注:インターフェイスで混合を避けるために、慎重かつ穏やかに血液を希釈します。
3. 上部LSMとプラズマ層を慎重に取り外し、転送ピペットを使用して白いバフィーコートインターフェイスを新しいチューブに移します。
4. 冷たいバッファーの30-40 mLでバフィーコートを再中断する(PBS + 0.5% ウシ血清アルブミン [BSA] + 2 mMエチレンディアミンテトラセチン酸[EDTA])。ピペットを使用して、セルサスペンションの20 μLと0.4%トリパンブルーの20 μLと混合物のピペット10 μLをカウントスライドの2つのチャンバーのいずれかの外側の開口部に組み合わせ、細胞をカウントするために自動化されたセルカウンターにスライドを挿入します。
   注:セルを実行可能に保つのに役立つため、すべてのステップで氷冷バッファーを使用します。
5. 4°Cで10分間300xgで細胞を遠心分離し、上清を注意深く吸引する。 次に、300 μLの氷冷バッファーを追加します。
6. ヒトFc受容体遮断試薬の100μLおよびモノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体共役マイクロビーズを最大1x10⁸細胞に添加する(材料表参照)。4°Cで30分間インキュベートし、細胞を洗浄するために10 mLの冷たいバッファーを加え、遠心分離機を300 x gで4°Cで10分間使用します。
   注:1 x 10^{8 個}を超えるセルが存在する場合は、セル番号に従ってスケールアップします。
7. 上清を慎重に取り出し、ペレットを500μLのバッファーで再サスペンドし、磁気分離工程を進め、HSPCを濃縮します。
8. 磁気活性化セル選別場に正の選択LSカラム(材料表を参照)を配置し、3 mLのバッファで通過します。
9. サンプルをヒトCD34+に結合したマイクロビーズをサンプルに取り込み、重力の影響を受けて回収管に流れ込むことができるLSカラムにサンプルをロードします。
10. 緩衝液でカラム3xを洗浄し、CD34の同じコレクションチューブに溶出物を収集^{します -}細胞の一部。
11. 5 mL のバッファーでカラムを急降下させ、CD34⁺セルを新しいコレクションチューブに溶出させます。>90%の純度を達成するために手順を繰り返します。
12. 血球計でトリパン青色染料を使用して、浸透したCD34+細胞を数えます。カウントした後、CD34+細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
13. 凍結培地中に1-200万/mLの濃度で細胞を移植または凍結保存するために注射用のPBSの25 μLでCD34+細胞を再中断する(ロズウェルパーク記念研究所培地[RPMI 1640培地]+50%胎児牛血清(FBS)+10%ジメチルスルホキシド[DMSO])移植のさらなる使用のため。
    注:移植でそれらを使用する前に、常に生存細胞を再計算します。
14. CD34+溶出液の純度を確認するには、懸濁液の50 μLを取り、4°Cで30分間PE結合抗ヒトCD34抗体の10 μLでそれをインキュベートします。抗体インキュベーション後、染色した細胞をPBSで洗浄し、100μLのPBSで再定酸化し、次いで、フローサイトメトリーを行う。フローサイトメーターでゲートを設計するために抗体を持たない細胞の追加チューブを追加します。
15. 取得後、前方散布図(FSC)およびサイドスキャッタ(SSC)プロットの対象領域を選択してデータを分析し、その後、FSC領域およびFSC高さのプロット上の単一セルのゲーティングを行います。PEチャネルおよびSSC領域プロット内の単一細胞上のゲートCD34陽性細胞。

2. 移植用ヒト肝細胞の調製

1. 液体窒素から凍結保存された肝細胞を取り出し、すぐに水浴中のバイアルを沈め、約90〜120sのために解凍する。
2. バイアルキャップを取り外し、解凍した肝細胞を温めた解凍媒体の50 mL円錐管に注ぎます。
3. 50 mLチューブを数秒間手で揺らして細胞を吊り下します。
   注:チューブを渦に入れさらわさわ
4. 細胞を室温で8分間100xgでペレットする。 0.1%BSAでPBSでペレット化した細胞を洗浄し、80 μL/マウスの最終体積でPBSの新鮮または解凍されたHSPC(比10:1)でプールします。

3. ヒトHSPCおよび肝細胞移植に対する動物の取り扱い、スクリーニング、ジェノタイピングおよび治療

1. 動物の取り扱い
   1. 重度の免疫不全の結果として、品種、家、および無菌条件下でTK-NOGマウスを処理する。
   2. 常にラボコート、手袋、靴カバー、フェイスマスクを着用して、病原性微生物の感染を防ぎます。
   3. 手術には滅菌手袋と器具を使用し、手術を通して動物を無菌的に処理します。
2. 実験用のTK-NOGマウスの選択
   1. オスの非TK-NOGリッターメートで雌のTK-NOGマウスを繁殖させ、ジェノタイピングによりトランスジェニック子孫を選択することにより、TK-NOG株コロニーを維持する。
      注:ジェノタイピング(ステップ3.3参照)を実行して、離離時の新生児の雄マウスおよび雌マウスにおけるトランスジーンの有無を決定する。
   2. HSV-TKトランスジーン発現肝^細胞21のGCV媒介枯渇に対する高い感受性による移植のための6〜8週齢の男性を選択する。
   3. 同種確認を容易にするために、引き取りや手術時にマウスに耳タグを付けます。動物の体重と健康状態をメモします。
3. 定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いたHSV-TKトランスジーンの存在に対するジェノタイピング
   1. 分別時にジェノタイピングを行う(通常、生後3~4週)。ジェノタイピングの場合は、マウスの耳を層流の生物学的安全キャビネットに切り取り、無菌性を維持し、ゲノムDNA分離キットを使用してゲノムDNAを抽出します。
   2. 20μL反応混合物で耳から抽出したゲノムDNAを20μL反応混合物で増幅し、フォワードプライマー5'-CCATGCACGTGTTTCCTTTTGG-3'、1 μLのリバースプライマー5'-TAGTTGCGCGCGCGCGCCC-3'-0μLを加えることで、ヒトアルブミンプロモーターの制御下でHSV-TKトランスジーンのスクリーニングを行う。FAMプローブ5'-FAM-AATCGCGCCCCGC-MGB-3'、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)器^械22上のマスターミックスの10 μL。
   3. リアルタイム PCR 設定を次のように設定します:30 s (プリリードステージ)、95 °C (ホールドステージ)、15 s の場合は 95 °C、1 分間 60 °C の 40 サイクル (PCR ステージ)、30 s (ポストリードステージ) の 60 °C を設定します。
      注:22未満の閾値(Ct)のサイクルは、HSV-TKトランスジーンに対して陽性と見なされる。
4. ガンシクロビルとトレオスルファンを用いての治療
   1. 27G針を使用して、TK-NOGマウスに対して、手術前の生理食べ物の100μLで1日2xの食前GCV注射(6mg/kg)を1日2倍注射し、マウスのトランスジェニック・マレンキマル細胞を枯渇させる(図2の実験戦略に示^{すように)23}.
   2. 手術前の3日目、2日目、および1日目に、27G針を用いて100μLの生理食食のトレオスルファン(1.5g/kg/日)の非骨髄切除性食後用量を有するマウスを予言した。
   3. 手術の1日前に、5mmランセットで刺すことによって下顎静脈から血液の2〜3滴(〜100μL)を引き出し、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のアサイザーについて遠心分離(1,500 x g、4°Cで10分間)で血清を分離し、デグラーを評価する肝臓の損傷のee。
5. 手術の準備
   1. 切開部位(腹膜壁の左側)を取り囲むマウスの毛皮を手術前に剃るためにバリカンを使用してください。
   2. 酸素の流れを1 L/min に調整し、マウス麻酔機を使用して誘導室でイソファランの流れを3%~5%に調整します。麻酔用の誘導室にマウスを1匹ずつ置きます。
   3. 滅菌延長管の一方の端(サスペンションの保持容量550 μL、仕様については材料表を参照)を30G針に取り付け、もう一方の端を1mLシリンジに取り付けます。
   4. スポイリングスをプールされたHEPとHSPC(セクション2参照)の懸濁液(80 μL/マウス)で充填し、繰り返し分配ピペットのノッチにシリンジをフィットさせ、ディスペンサーを調整して各プレスで10μLを分配します。
   5. マウスが麻酔を受けたら(通常3~4分後)、イソファランの流れをノーズコーンに切り替え、イソファランの流量を2%~3%に減らす。
6. マウスにおけるヒトHSPCおよび肝細胞の脾臓移植
   1. 無菌条件下で層流キャビネット内のすべての手術ステップを実行します。
   2. 作業面の上にきれいな無菌ドレープを置き、切開を行う前に、10%のポビドンヨウ素に続いて70%のイソプロピルアルコールで各マウスの体の左側をスクラブします。
   3. 胸壁の左側の皮膚、筋肉、胸膜に小さな切開(長さ~1.5cm、深さ5mm)を、バンナ型はさみで、肋骨ケージの下端から約5mm下の胸膜腔に入る。
   4. 脾臓を見つけ、操作領域に鉗子でわずかに引っ張り、30Gの針を脾臓の下の極に挿入します。
   5. 分配ピペットのプランジャーのロックを解除し、脾臓あたり60-80 μLの制限で、一度に10 μLの体積を分配します。針をゆっくりと引き込み、ライゲーション・プリジャーを使用して、ライゲーション・プリジャーを使用して、ライゲーション・クリップで脾臓をクリップします。
   6. 脾臓を体腔に押し戻し、無菌のPBSで濡らした綿の先端のアプリケーターを使用します。
   7. 吸収性縫合中断縫合パターン(連続ではない)を使用して腹壁の筋肉層を閉じる。非吸収性縫合糸を使用して中断された縫合パターンで皮膚閉鎖を達成する。
   8. 手術後の低体温からマウスを保護するために、温水循環パッドを使用してください。
   9. 手術後10~14日後に非吸収性縫合糸を取り除く。
7. 術後ケア
   1. 移植された動物が目覚めるとき、鎮痛薬ブプレノルフィン(0.1mg/kg)を食後3日間連続して1日2倍に注入する。
   2. 彼らは正常な物理的な状態に戻るまで、少なくとも1日1回動物を観察してください。
      注:一部のマウスは体重の後部手術を失う可能性があるため、各動物の体重を確認してください。マウスは通常、1~2週間で元の体重を取り戻す。

4. ELISAによるヒト肝臓の移植検証とフローサイトメトリーによるヒト免疫系

注:ヒト肝臓と免疫系の再構成を毎月評価し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)とフローサイトメトリーによる移植後1ヶ月をそれぞれ開始する。

1. EDTAチューブのランセットを用いて下顎静脈から血液サンプルを採取し、4°Cで10分間1,500xgの遠心分離機を採取する。ヒトアルブミンレベルをチェックする血清を分離し、ヒト肝細胞移植に対するマウス肝臓の生着効率を評価し、ヒトアルブミンELISA定量セット(材料の表を参照)を用いて、製造業者の従い方を行う。指示。
   注:ペレットを捨てて、フローサイトメトリー分析のためにペレット化された細胞を使用して、ヒト免疫系の再構成を評価しないでください。
2. FACSバッファーの35 μL(PBS + 2%FBS)で血清を含まない細胞ペレットを再定重し、マウス特異的CD45(濃度0.5mg/mL)、ヒト特異的抗体CD45(0.1mg/mL)、CD3(0.2mg/mL)、CD8(0.1mg/mL)、CD8(0.1mg/mL)、5μLのマウス特異的CD45(濃度0.5mg/mL)で染色と、CD4(0.25mg/mL)及びCD14(0.25mg/mL)の20μLを4°Cで30分間それぞれ、CD34+HSPCからの機能性免疫系の発達を確認した。
   注:染色されていない細胞のチューブを1つ追加して、染色された細胞のゲーティングを決定することを検討してください。
3. インキュベーション後、染色された懸濁液(~100μL)をポリスチレン丸底流れサイトメトリーチューブに移し、蒸留水の9部で10x分解バッファーの1部を希釈し、10をインキュベートして2mLの1x分解バッファーを使用する(材料の表を参照)。赤血球をリゼする15分
   注:赤血球リシスを評価するために濁りを観察します。サンプルが明確になると、リシスが完了します。
4. リシス後、チューブ内のFACSバッファーの3 mLを追加し、ペレットを得るために5分間4°Cで300 x gで遠心分離機を追加します。ペレットと遠心分離機に3mLのFACSバッファーを3mL加えて4°Cで5分間洗浄を繰り返します。
5. 作りたての1%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定し、フローサイトメーター上の染色細胞を取得し、フローソフトウェアで分析します。
6. 分析のために、FSC/SSCプロット上のゲーティングを選択し、続いてFSC領域/FSC高さに単細胞ゲーティングを行います。
7. また、単細胞集団上のヒト特異的CD45(hCD45)に対するゲートは、マウス由来の細胞を排除するためのマウス特異的CD45(mCD45)を含む。染色されていない細胞のゲーティングに基づいて染色された集団のゲーティングを戦略化する。
8. ゲートhCD45+細胞は、CD3+T細胞およびCD19+B細胞の周波数を決定する。ゲート T セルを使用して、CD4 および CD8 サブセットを決定します。単球を評価するには、hCD45上のゲートでCD14+単球を決定する。

5. TK-NOGマウスのHIV感染とヒト肝臓および免疫系への影響

1. HIV-1ウイルスおよびすべての感染マウスを指定されたバイオセーフティレベル2施設で処理します。
   注意:オートクレーブと二重バイオハザードバッグにすべてのHIV感染廃棄物を廃棄します。安全上の理由から、HIV感染マウスを手渡す間、切り傷に強い手袋を着用してください。
2. 使い捨てカバーオールガウン、靴カバー、フェイスマスク、ダブルグローブを含むパーソナルプロテクション機器(PPE)を常に着用してください。
3. ヒトCD45+細胞の15%以上(ステップ4.7で試験)とHIV-1感染のための血清中にヒトアルブミンの存在を有するマウスを選択する(ステップ4.1でテスト)。
4. マウスに1 x 10³ x 1 x 10^4組織培養感染用量50(TCID_50)HIV-1ADAをマウス当たり100~200μLの体積で注射する。
5. イソファラン(イソファラン蒸気濃度>5%)を用いて感染後5週間をHIV感染マウスに安楽死させる。
6. マウスを安楽死させた後、血清の単離のための心臓穿刺によってEDTAチューブに血液を採取し、ELISA(ステップ4.1参照)と血液細胞によるヒト特異的アルブミンレベルを評価して肝臓に対するHIV-1の効果を確認し、ヒト免疫の変化をチェックする。フローサイトメトリーを使用する細胞(手順4.2~4.8を参照)。
   注:バイオアナリサータで感染後5週間の末梢ウイルス負荷を評価し、マウスが感染しているかどうかを確認する。
7. 血液を採取した後、安楽死マウスから肝臓を取り除く。
8. 肝臓切除の場合は、キシフォイドから皮膚、筋肉、腹膜に長さ1.5~2cm、深さ0.5cmの切開を行い、腹腔を露出させる。肝臓と横隔膜の間の脊椎に垂直なカットを行います。肝臓を持ち上げ、胃や腸に付着する膜を切断します。
9. 肝臓を一晩4%パラホルムアルデヒドで回収して固定し、標準的な免疫組織化学プロトコルに従って、ヒト特異的CK18^抗体8を用いてCK18+肝細胞に対するHIVの効果を評価する。

結果

ヒト肝臓および免疫細胞を用いた二重ヒト化マウスモデルの確立は、それぞれ非常に簡単なELISAおよびフローサイトメトリーで各ステップで容易に監視することができる。フローサイトメトリーは、機能性免疫系の発達を評価し、免疫細胞に対するHIV感染の影響を確認するために定期的に行われる。二重ヒト化マウスでは、機能性免疫細胞の発達は、リンパ球門の15%から90%の範囲である。免疫細胞の代表的なサブセットをドットプロットに示す(図3)。ヒト肝細胞の生着の評価のために、ヒト特異的アルブミンレベルに対するELISAはマウス血清上で毎月行われる。HSPCとHEPの両方で移植されたマウスは、1ヶ月で〜7 μg/mLから377 μg/mLまでのヒト固有のアルブミンレベルを示し、観察の時間(6ヶ月)にわたって成長し続ける(図4)。二重ヒト化マウスの血液中のヒト免疫細胞に対するHIV感染の影響は、ヒト特異的アルブミンELISAによって肝臓のフローサイトメトリーおよびHEPによってモ...

ディスカッション

肝臓は、HIV感染^患者24で侵害され、損傷を受けている。HIV-1の存在下でヒト肝疾患を研究するための実験的な小動物モデルは、CD34 +HSPCおよび^肝細胞7、12を有するいくつかの共移植動物モデルの利用可能性^{にもかかわらず、}極めて限られている。 ²⁵.インビトロ実験では、肝細胞は低レベルのHIV-1^感染26を有することが示されている。両方のタイプのヒト細胞を運ぶヒト化マウスは、望ましいモデルである。ヒト免疫系のみで再構成されたマウスの肝臓は、ヒト調節T^細胞20,27の実験的枯渇下下でHIV感染の影響を受けることが示されている。しかし、マウスとヒト肝細胞の免疫および機能特性の違いは、HIV-1および免疫細胞に対する応答...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
27 G1/2 "針	BDバイオサイエンス	305109
30 G1/2 "針	バイオサイエンス305106
5 mLポリスチレン 丸底チューブ12 mm x 75 mmスタイル	コーニング	352054
BD 1 mLツベルクリンシリンジ針なし	BDバイオサイエンス	309659
BD FACSアレイバイオアナライザー	BD Biosciences		溶出したCD34+細胞の純度チェック
BD FACSアレイソフトウェア	BD Biosciences		ソフトウェア FACSアレイ上のCD34+細胞を分析するためのソフトウェア
BD FACS溶解液	BD Biosciences	349202	赤血球を溶解するために
BD LSR II	BD Biosciences		フローサイトメトリーサンプルの取得のための機器
BD Vacutainerプラスチック採血チューブ	BDバイオサイエンス	BD 367874	臍帯血
ウシ血清アルブミンを採取する	Sigma-aldrich	A9576
ブプレノルフィン			規制物質および鎮痛剤
CD14-PE	BD バイオサイエンス 555398		ヒト
CD19-BV605	BD バイオサイエンス	562653	ヒト
CD34 MicroBead Kit, ヒト	Miltenyi Biotec	130-046-702	アイソレーション用   CD34+ HSPC
CD34-PE, human	Miltenyi Biotec	130-081-002	溶出CD34+細胞の純度チェックに使用した抗体
CD3-AF700	BDバイオサイエンス	557943	ヒトに特異的
CD45-PerCPCy5.5	BDバイオサイエンス	564105	ヒト
CD4-APC	BDバイオサイエンス	555349	ヒトに特異的
CD8-BV421	BDバイオサイエンス	562428ヒト	特異的
細胞計数スライド	バイオ・ラッド	1450015
ChargeSwitch gDNAミニティッシュキット	イヤーピースからゲノムDNAを抽出するための	サーモフィッシャー科学	CS11204
Cobas Amplicor system v1.5	ウイルス量を測定する	ためのロシュ分子診断
コットンチップアプリケーター	McKesson	24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18)	DAKO	M7010	ヒト
DMSO (ジメチルスルホキシド)	Sigma-aldrich	D2650-5X5ML
エクステンションセット マイクロボアスライドクランプ 固定オス ルアーロック。L:60 in L:152 cm PV:0.55 mL Fluid Path Sterile	BD biosciences	30914	分注ピペットに取り付けられ、HSPCおよびHEPサスペジョン
FACS Divaバージョン6	BD Biosciences		フローサイトメーターソフトウェアが必要  サンプル牛
胎児血清(FBS)	Gibco	10438026
FLOWJO分析ソフトウェア v10.2	FLOWJO、		フローサイトメトリー解析ソフト
Ganciclovir	APP Pharmaceuticals, Inc.	315110	Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA Tubes	Greiner bio-one	450475
Hepatocytes thawing medium	トライアングル・リサーチ・ラボ	MCHT50
Horizon オープン ライゲーション クリップ アプライヤー	テレフレックス	537061	ライゲーション クリップを保持するため
Hospira Sterile Water for Injection ACE	Surgical Supply co., Inc.	001-1187	ブプレノルフィン(鎮痛剤)の希釈用ヒト
アルブミンELISA定量セット	Bethyl laboratories	E80-129	マウス血清中のヒトアルブミンレベルを評価するため
ヒト肝細胞	トライアングル研究所	ハップ1	凍結保存されたヒト肝細胞、誘導適格
アイリスハサミ、ストレート	テッドペラ株式会社	13295
ランセット	メディポイント	ゴールデンロッド 5 mm
LS カラム	Miltenyi Biotec	130-042-401	CD34+マイクロビーズ(ポジティブセレクション)を捕捉するために使用されますリンパ
球分離培地(LSM)	MP Biomedicals	50494	アイソレーション用  末梢血MACS
マルチスタンド	Miltenyi Biotec	130-042-303	からリンパ球は、Qudro MACSセパレータとLS列を保持し
マクファーソン·ヴァンナスマイクロ解剖スプリングはさみ	ロボズ外科用器具株式会社	RS-5605	脾臓を露出させるために皮膚を切開するために使用される
マイクロ解剖鉗子	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5157	腹腔から脾臓を保持して引き出す
マウス CD45-FITC	BD Biosciences	553080	マウス特異的
PBS (リン酸緩衝生理食塩水)	Hyclone	SH30256.02
Qudro MACS セパレーター	Miltenyi Biotec	130-090-976	は、4つのLSカラムRPMI
1640中	Gibco	11875093
StepOne PlusリアルタイムPCR	Applied Biosystems		使用機器  to  遺伝子型
ステッパーシリーズ 反復分注ピペット 1ml	DYMAX CORP	T15469	使用   分注 HSPCとHEPの制御された方法で
supension Suturevet PGA合成吸収縫合	Henry Schein Animal Health	41178	皮膚と腹膜の縫合
TaqMan 遺伝子発現マスターミックス	サーモフィッシャー 科学	4369016
TC20 自動セルカウンター	Bio-rad	1450102
TK-NOGマウス			提供:一般社団法人 実験動物中央研究所(CIEA、伊藤守博士、末水 博博士)
Treosulfan	Medac GmbH		提供: ヨアヒム・バウムガルト博士(medac GmbH)
トリパンブルー	バイオ・ラッド	1450022
バンナス型マイクロハサミ ストレート 80mm L	テッド・ペラ社	1346	脾臓を露出させるために皮膚を切開するために使用
ウェック ヘモクリップ 伝統的なチタン結紮クリップ	縫合	523700	注射後の脾臓を結紮するために