ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

炎症は、多くの病理学の条件、心血管系を含むと神経変性疾患、敗血症、薬物有害反応 (副作用) の極めて重要な役割を果たしています。内皮細胞 (Ec) E セレクチン、細胞間接着分子-1 (ICAM-1) など血管細胞接着分子-1 (VCAM 1) の表面に、プロ接着受容体の誘導を介して炎症反応の調節に重要な役割を果たす^1,2。 炎症反応^3,4で多様性を示すさまざまな組織に微小血管の ECs が知られています。さらに、遺伝的背景や特定の遺伝の条件可能性があります炎症性応答における個体の差発生したがって、異なる個体から Ec へアクセスする重要です。さらに最近、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs)⁵、あらゆる個人から得られる、ECs^6,7,8,の信頼性の高い、再生可能なソースとして機能する示されていた⁹しますしたがって、炎症反応や白血球による ECs で採用の評価はある特定の遺伝的疾患のモデリング用だけでなく、貴重なも個体間変動の兆候を提供するとのためのツールとして使用するには。個別化医療の将来。

流れの試金は、内皮細胞白血球の相互作用を研究するための便利なツールを提供します。マイクロ流体デバイスの進歩により、血管ベッド固有せん断応力レベルの正確な制御と生理流体条件の再現です。ライブ イメージングは、白血球のキャプチャ、圧延、クロール、接着と輪廻のイベントの連鎖を監視できます。しかし、彼らはすべてプライマリ ECs^{10、11,12,13}を利用、内皮細胞白血球の相互作用を研究するいくつかの流れの試金が開発されています。ここでは、我々 は詳細に生理の流下による ECs にひと白血球接着の評価のための試金を説明します。この手順では腫瘍壊死因子アルファ (tnf α)、解離などのプロ炎症性刺激による EC 刺激の最適化条件を記述する、8 並列チャンネルを備えたマイクロ流体チップに播種します。による ECs のマイクロ流体チップに蛍光に分類された白血球の懸濁液による血液灌流のステップバイ ステップのプロトコルを記述する、シス、付着性白血球のカウントを自動化します。

このプロトコルは、パーソナライズされた再生医療、疾患モデル作製の薬剤のスクリーニングによる ECs で炎症反応の評価に役立ちます。

1. ソリューションおよび試薬の調製

1. 血小板貧しい血漿由来血清 (1%)、塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF、20 ng/mL) と血管内皮増殖因子 (VEGF、50 ng/mL) にひと内皮-SFM (のテーブルを参照を追加することによって完全な人間内皮 SFM メディア (EC SFM フル) の準備します。材料)。0.22 μ m 孔フィルターを通してメディアをフィルター、最大 2 週間までの 4 ° C で保存できます。
2. ウシ胎児血清 (10%) を追加することによって完全 RPMI 培地を準備 2-メルカプトエタノール (0.05 nM)、L-グルタミン (1%)、ペニシリン ・ ストレプトマイシン (25 U/mL) RPMI 培地に (材料の表を参照してください)。3 週間 4 ° C で保存します。

2. マイクロ流体のコーティング チップします。

1. 10 cm の滅菌シャーレに滅菌バイオチップを配置します。
2. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca^{2 +}/Mg^{2 +} 50 μ G/ml の最終的な集中なしで原液を再構成によってフィブロネクチン作業ソリューションを準備します。バイオチップあたり作業ソリューションの 80 μ L を推定します。
3. バイオの各チャンネルにフィブロネクチン使用液の 10 μ L を注入します。10 μ L の小さなヒントは、ピペットを使用し、チャネルの入口とピペット チップ (図 1、左) 間のタイトな接触を形成することを確認します。
4. バイオを含むシャーレのふたを閉じ、加湿チャンバー (図 2 b) に配置。一晩で 4 ° C 室を格納します。部屋を加湿するには、加湿チャンバーの底にきれいなティッシュ ペーパーを置き、滅菌 H₂o. の 5 mL を追加
5. アッセイする前に、次の日は、インキュベーターで 37 ° C でバイオチップを事前暖かい。

3. による ECs の準備

注:ここで説明したプロトコルでによる ECs 区別、精製、凍結保存され前述⁸として解凍。

1. 雪解けとプレートによる-ECs で完全な EC SFM における 1 0.1% ゼラチン コート T75 フラスコ、3 〜 4 日前に試金。
2. アッセイの前に夜は EC SFM 完全補完 10 ng/ml の tnf α を追加して tnf α とによる ECs を刺激し、インキュベート前述⁷として、37 ° C で一晩 (〜 12 h)。

4. による ECs 解離とマイクロ流体チップにシード

1. アッセイの日、インキュベーターからによる ECs のフラスコを取るし、顕微鏡下で細胞を検査します。による ECs の 80-100% 合流と典型的な EC のような形態であることを確認します。
2. 細胞文化フードにフラスコを転送します。
3. による ECs のフラスコから培地を吸引します。
4. 簡単に 10 mL の PBS せず Ca^{2 +}/Mg^{2 +}を追加することで細胞培養を洗います。PBS を吸い出しなさい。
5. 1 x 解離酵素のフラスコあたり 4 mL を追加します。室温 (RT) (図 1 b) で 5 分間インキュベートします。
6. 8 mL のフラスコあたりひと内皮 SFM 媒体を追加することにより解離反応を停止します。そっと外し、5 mL のピペットを使用して 15 mL の円錐管に ECs によるサスペンションを収集します。
7. 懸濁液内のセルの合計数をカウントします。
8. 300 x g室温 3 分で細胞を遠心分離します。
9. 上清を吸引し、EC SFM フルで 1.5 倍の 10⁷セル/mL の最終濃度に細胞ペレットを再懸濁します。
10. インキュベーターからバイオチップをシャーレを取り出し、セル文化フードにそれを転送します。
11. マイクロ流体チップのすべてのチャネルからフィブロネクチン ソリューションを吸い出しなさい。
12. 10 μ L の小さなヒント (図 1中間) のピペットを使用して各チャネルに細胞懸濁液の 6 μ L を注入します。セルの析出を避けるし、細胞懸濁液が注入前によく混合されていることを確認します。
13. 顕微鏡下でバイオチップを調べるし、細胞が一様に分布し、細胞密度が高いことを確認 (図 2)。
14. 37 ° C で 15 分間バイオチップを孵化させなさい
15. 各チャネルの両側から中の貯水池に EC SFM の 40 μ L を追加します。
16. 37 ° c (図 1右) 1 h のバイオチップを孵化させなさい。
17. 各チャネルの両側から貯水池に EC SFM の別の 50 μ L を追加します。

5. 人間の白血球の準備

注:ここで説明したプロトコル、市販の単球細胞系 (THP 1) が使用されていた。また、末梢血リンパ球や好中球を使用できます。末梢血単球および好中球の隔離は、標準的な手順¹¹を使用して実行できます。細胞文化のフードは、本項に記載されているすべての手順を実行します。

1. 50 mL の円錐管に白血球を収集します。
2. Ca^{2 +}/Mg^{2 +}なし 10 mL の PBS と白血球を洗います。RT (図 1) で 3 分間 300 x gで細胞を遠心します。
3. 上清を吸引し、1 mL の PBS DiOC6 色素で細胞ペレットを再懸濁します (_ex λ = 485 nm、λ_em = 501 nm) (1:5, 000)。室温 10 分間暗闇の中で細胞をインキュベートします。
4. Ca^{2 +}/Mg^{2 +}なし 10 mL の PBS と白血球を洗います。もう一度 RT。 繰り返し洗浄工程で 3 分間 300 x gで細胞を遠心分離機します。
5. 懸濁液内のセルの合計数をカウントします。
6. 上清を吸引し、2.5 10⁶セル/mL の x の最終濃度に完全 RPMI 培地で細胞ペレットを再懸濁します。

6. マイクロ ポンプの作製

1. 8 ch マニホールドとマイクロ ポンプを組み立てます。
2. ポンプとオペレーティング ソフトウェアをインストールされている PC に接続します。
3. マイクロ ソフトウェアを起動してオープン プロトコルをクリックしてプロトコルをロード、マイクロ流体プロトコルを選択するために PC に移動します。
4. セットアップフォルダーを選択してアッセイ ステップの実行] をクリックして、ソフトウェアとポンプを接続します。
5. 正しい流量制御のためのチャネルのジオメトリを定義:ジオメトリの設定フォルダーに更新のジオメトリを選択し、アッセイ ステップの実行] をクリックします。
   注:注射器や使用されるチャネルのジオメトリの詳細と一致するかどうかを確認 (ジオメトリ ID = 1、チャンネル数 8、チャネル幅を = = 800.0 μ m、チャネル深さ 120.0 μ m、注射器のボリュームを = = 250 μ L) とサンプルの粘性 (液体粘度 = 1.0)。
6. 80% エタノールを含む 50 mL の円錐管にインレット ケーブル (オレンジ) を配置することによってポンプを洗います。50 mL の円錐空管 (廃棄物コンテナー) にコンセント ケーブル (緑) を配置します。
7. ウォッシュ アウト/ポンプ [ウォッシュ アウト]フォルダーを選択し、分析手順の実行をクリックします (ボリュームを洗う 2000年 μ L、ボリュームの洗浄ステップを = = 250 μ L、ウォッシュ アウト方向出力を =)。洗浄工程をもう一度繰り返します。
8. 細胞培養グレード水と人間内皮 SFM 培の手順 (手順 6.6-6.7) を洗浄ポンプを繰り返します。
9. マニホールドの洗濯手順に進みます。
10. 手動で正しい位置 (左にオフになって表示器) に 3 way アダプターを配置することによって、注射器とマニホールドの間の弁を開きます。
11. ウォッシュ アウト/マニホールド洗浄フォルダーにセット電流チャネル/オープンステップを選択し、分析手順の実行、マニホールドのすべてのバルブを開くをクリックします。
12. 細胞培養グレード水 5 mL に続いて、注射器から 80% エタノール 5 mL を押すことにより手動でマニホールドを洗います。
13. 注射器から人間内皮 SFM 培養液 5 mL を押すことにより、マニホールドを洗ってください。
14. マニホールドで閉じ込められているすべての大規模な空気の泡を削除します。これを行うには、8 もピン アダプター 10 cm シャーレの培地に置き、すべての大きい空気泡がなくなるまで注射器で押し引きを実行 (小さな泡は問題ではありません)。
15. ウォッシュ アウト/マニホールド洗浄フォルダーにセット電流チャネル/閉じる手順を選択し、マニホールド バルブを閉じますの試金のステップの実行をクリックします。
16. マニホールドのアダプターには、ポンプから緑コンセント ケーブルを接続します。
17. 注射器を閉じるにOFFの位置に三方弁を切り替えます。
18. ウォッシュ アウト/ケーブル [ウォッシュ アウト]フォルダーを選択し、各ケーブルからすべてのバブルを削除することを確認 RPMI 培地で各ポートを個別に洗浄する試金のステップの実行をクリックして (ディスペンス ボリューム = 100 μ L)。
    注:マニホールドの各バルブは開かれた 1 つずつ、閉じて他のチャンネルを維持しながら、個々 のチャンネルを通して媒体の 8、および 100 μ L に 1 が分配されます。各ピンから液体が実行されることを確認します。出てくる液体が存在しない場合、空気の泡や詰まりの指標です。

7. 準備のマイクロ流体チップのライブ イメージング

1. マイクロ流路のセットアップの準備が整ったとライブ イメージング商工会議所は 37 ° c 前平衡 CO₂のレベル (図 3 a, B) 5% に達したことを確認します。
2. インキュベーターからバイオを取り出して顕微鏡チップ ホルダーの位置します。ステージ (図 3) をイメージング顕微鏡のチップ ホルダーをマウントします。
3. バイオをマニホールドを介してポンプに接続するためには、チップのアウトレット貯水池近くに 8 ピン アダプターを配置し媒体のすべてのピンを深める (しかし、完全に接続しないでください)。
4. ウォッシュ アウトを選択 |チップに接続してフォルダーとクリックしてチップを接続する前に RPMI 培地を分注する試金のステップの実行(ディスペンス ボリューム = 30 mL)。培地を分配すると、一度、バイオチップのコンセントに 8 ピン アダプターを挿入します。
   注:この手順では、すべてのチャンネルが設定上(開く) 媒体の 30 μ L が各チャネルを通じて分配され、このチャネルがオフ(閉じた状態) に設定されます。これにより、空気の泡は、マイクロ流体チップのチャンネルに導入されません。
5. 手動でピペットとバイオチップのすべての入口の貯水池から培地を吸引します。
6. ウォッシュ アウトを選択 |ウォッシュ アウトをチップフォルダーとクリックしてチャネルから死んだ細胞やごみを取り除くために 1 つのチャネルのそれぞれによる EC SFM におけるメディアの 40 mL を灌流してアッセイ ステップの実行(ウォッシュ アウト ボリューム = 40 μ L、最大ウォッシュ アウトせん = 40 ダイン/cm²)。

8. 流れ接着アッセイおよび画像取得

1. 手動でピペットと利子のチャネルの入口の貯水池から培地を吸引します。
2. 対象チャネルの入口の貯水池へステップ 5.6 から白血球の 100 μ L を追加します。
   注:単一細胞懸濁液に細胞を優しく混ぜます。
3. 細胞アッセイで |ステップの説明フォルダー、セット電流チャネル/ステップの説明を選択し、チャンネルのリストで関心の現在のチャネルのみを選択し (オープン)に設定し、オフ(閉じた状態) に他のすべての 7 つのチャンネルを設定します。
4. セルの試金を選択 |ステップの説明フォルダーとクリックして分析の手順を実行します。
   注:可変流量率調剤5 分のチャネルを介して口貯水池から白血球サスペンションをプルする一定の負圧を適用されることを確認してください (セットをせん断定数、せん断応力を = =-0.50 ダイン/cm²期間 = 00時 05分: 00スキャンの遅延 = 00時 00分: 00)。せん断応力の負の値は、フローの正しい方向を保証します。
5. インレット タンクから残りの白血球を吸い出しなさい。
6. インレット タンクに完全 RPMI 培地の 100 μ L を追加します。細胞アッセイ/ステップ説明フォルダーを選択し、すべての非付着性白血球を洗い流すために RPMI 培地で 5 分のためのチャネルを灌流して試金のステップの実行をクリックして (セットをせん断定数、せん断応力を =-0.50 ダイン/cm²期間を = =00: 05:00、スキャン遅延 = 00時 00分: 00)。
7. (代表的なエリアがキャプチャされることを確認) に付着の白血球をイメージするチャネルの少なくとも 3 〜 4 別の位置からの画像を取得します。
8. チャネルのすべての残りの部分の機能評価の手順 8.1-8.7 を繰り返します。
   注: 複数のチャネルを一度に実行することが可能です。この操作を行うには、手順 8.3 中関心のすべてのチャンネルを開いてください。興味の複数のチャネルのすべての前述の手順 8.4 –8.7 を実行します。

9. アッセイを完了し、クリーニング流体ポンプ

1. 実験を完了すると、エクスポートし、RAW 形式ですべての画像を保存します。
2. 結果の保存中、マイクロ ポンプとプロトコルを洗浄マニホールドを実行します。
3. マイクロ ポンプ用細胞培養グレード水 4 mL を灌によって最初ウォッシュ アウト/ポンプ ウォッシュ アウトフォルダーに実行、80 %4 mL に続いてエタノール 6.6-6.7 の手順で説明するよう数分間空気を実行することによってポンプを乾燥します。
4. マニホールドをクリーンアップするために注射器をウォッシュ アウト/マニホールド洗浄ステップを実行します。細胞培養グレード水で注射器と手順 6.10-6.11 洗浄 80% エタノールで最初に記載されている、次の吸気バルブを開くための手順に従います。注射器で空気を押すことによって、マニホールドを乾燥します。手順 6.10 と 6.15 に記載したシリンジ ・ バルブとマニホールドのバルブを閉じます。

10. 付着性白血球のカウント

1. ダウンロードして画像処理ソフトウェア¹⁴ http://cellprofiler.org からをインストールします。
   注:本研究における画像処理はソフトウェア バージョン 2.1.1 を使用して行った。新しいバージョンを使用している場合、パイプラインはマイナーな適応を必要があります。
2. パイプラインCount_leukocytes.cpipe.をダウンロードします。ファイルをクリックして |インポート |パイプラインファイルから、 Count_leukocytes.cpipeのパイプラインを選択する PC に移動します。
3. 入力モジュールでファイル一覧ウィンドウに付着性の白血球の取得した RAW 画像のフォルダーをドラッグ アンド ドロップ |画像分析のためのセクション。
4. 解析モジュールを介して白血球の典型的なサイズを指定する |IdentifyPrimaryObjects。付着性白血球の最小と最大直径をピクセル単位で指定します。
5. 解析モジュール経由でフィルター条件を選択 |FilterObjects。オブジェクトの最小受け入れ領域をピクセル単位で指定します。
6. 分析イメージボタンを押して、分析を開始します。
   注:すべての RAW 画像が処理され、結果は既定の出力フォルダーに保存されます。Image.txt出力ファイルには、各処理後の画像 (各番号は 1 つのイメージ、すなわち、各取得の視野に相当) の付着性の白血球の数が含まれています。

まず、こと ECs の tnf α を検討すべき、プロ炎症剤の刺激への応答は、7を前述しました。12 h の tnf α の治療は、治療開始後 6 時間でピークを持つ E-セレクチンの発現をトリガーします。また、ICAM 1 は誘導 6-12 h 治療後です。VCAM 1 の期待のアップレギュレーションは観測されなかったが通常プライマリひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) で観察します。白血球接着の試金のための最も便利に一晩 (12 h) tnf α 治療を発見しました。

最適なこと ECs 解離は、単一細胞懸濁液細胞塊の無料になります。図 2は、注入直後後最適による EC 密度を示しています。通常、注射後 15 分による ECs はチャネルの下部に接続し、(図 2 D) で広がり始めます。1 h 注入後、による ECs チャネルに沿って十分に普及化単分子膜を形成し、流れの試金 (図 2 e) を開始する準備ができています。

蛍光トレーサーによる白血球のラベリングは、有益なフェーズ コントラスト画像の自動イメージ定量化やすく細胞の識別手順、白血球が ECs の単分子膜に付着し、にくい頻繁ために特に異なる種類の細胞を区別するソフトウェア。

無料のオープン ソースの画像処理ソフトウェアは、付着性白血球の自動定量化のため便利です。ここのプロトコルで説明したパイプラインは、プライマリ オブジェクト同定 (図 4 a) 白血球の蛍光画像の適応的しきい値に基づいています。さらに最小領域に基づくオブジェクトを特定のフィルタ リングその他非特異蛍光の信号 (図 4 C、 D) や蛍光細胞の残骸など、誤って識別されたオブジェクトがフィルター処理します。

8 並列チャンネルを備えた 1 つのマイクロ流体チップにより、2 つの独立したグループの比較、例えば、ECs は健常者や遺伝的疾患を持つ患者などの独立した hiPSCs から区別されます。未処理の ECs、や ICAM 1 遮断抗体の前処理などの他のコントロールは、よく10,11として指定できます。2 ~ 3 マイクロ流体チップは、一度に処理できます。結論の堅牢性、独立した日に実行される 3 つの独立した生物学的実験の最小値をお勧めします。

図 1: による ECs と白血球の流れの試金のための準備。(A) 炎症性刺激 (tnf α) とによる ECs の前処理。(B) による ECs 酵素解離、遠心分離、再懸濁の模式図。チャンネル (C、左)、コーティングによる EC 懸濁液 (C、中間) の注入の模式図 (C) と細胞のマイクロ チップによる ECs 取付後培地添加。蛍光色素 DiOC6 と巻き上がり標識白血球の洗浄のステップの模式図 (D)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: マイクロ チップによる ECs 。(A) マイクロ チップ 10 cm シャーレ。(B) 加湿チャンバーは、培養に使用されます。(C、D、E)マイクロ流体による ECs の代表的なイメージは、投与後 0 分 (C)、(D)、15 分 1 h (E) をチャネルします。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 生細胞イメージングと白血球灌流測定の実験のセットアップ。(A, B)(B) 生細胞イメージングとフロー分析の実験のセットアップの写真 (A) と回路図の表現: (1) マウントされたライブ イメージング商工会議所 (5% CO2、37 ° C、湿度)、(2) と倒立蛍光顕微鏡マイクロ ポンプ、(3) - 8 チャネルマニホールド、マイクロ ポンプ制御用 (4) - 顕微鏡制御と画像取得、(5) の PC - PC。(C) マイクロ流体チップ プレート ホルダーの固定および顕微鏡のモーターを備えられた段階でマウントされている 8 チャネル多様体の挿入されたチューブ。流れの試金の主な手順の模式図 (D)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 画像解析と付着性白血球の自動検出します。(A) 白血球の id に対して指定された設定とソフトウェアの処理画像のダイアログ ウィンドウ。最小限に基づいて識別されたオブジェクトの指定されたフィルターと画像処理ソフトのダイアログ ウィンドウ (B) 基準受け入れ表面積 (SA分= 70 px)。(C) 白血球の正しい識別と小さな面積 (SA) の非固有のオブジェクトのフィルタ リングの例 (ピクセル (最小/最大) の典型的な直径 = (9, 15);フィルタ リング条件 SA分= 70 px)。承認済みオブジェクトが緑色で描かれているし、破棄されたオブジェクトが紫で描かれています。典型的な直径の不適切な範囲によって白血球の誤った同定の (D) の例 (ピクセル (最小/最大) の典型的な直径 = (3, 15);フィルタ リング条件 SA分= 70 px)。承認済みオブジェクトが緑色で描かれているし、破棄されたオブジェクトが紫で描かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

著者が明らかに何もありません。