方法論記事

マウスと次世代シーケンサーによるひと抗体のレパートリーの同定

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DOI：

10.3791/58804

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2019年3月15日

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1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research, National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology, National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases, Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE, Hokkaido University, 9Department of Immunology, National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

この記事について

サマリー

ここでは、分析と構造の可視化と全体抗体レパートリーの憲法のためのプロトコルについて述べる。次世代シーケンシングによる抗体 RNA の広大な配列の取得が含まれます。

要約

抗体による抗原認識の広大な適応性獲得免疫系の基礎であります。獲得免疫システムによって抗体の膨大なレパートリーの生産の基礎となる分子メカニズムの理解、にもかかわらずそれまだされていない完全な抗体レパートリーのグローバル ビューに到着することが可能。特に、B 細胞レパートリーは、抗体クローンの天文学的な数のためのブラック ボックスとみなされています。ただし、次世代シーケンシング技術は B 細胞レパートリーの私達の理解を高めるためのブレークスルーを有効にします。本報告では、視覚化および分析全体個々 のマウスとひと抗体のレパートリーにシンプルかつ効率的な方法をについて説明します。免疫器官から代表してマウスの脾臓ヒトでは、末梢血単核細胞から総 RNA され準備、逆転写、5'-レース メソッドを使用して増幅されます。抗体のクラスに固有の一定のドメインのユニバーサルの前方プライマーおよび antisense プライマーを使用して、抗体の Mrna が均一に抗体集団における頻度を反映した割合で増幅されます。次世代シーケンス (NGS)、免疫学的サンプルごとの以上 10 の5抗体配列の降伏によって、amplicons クローニングされました。V (D) J 遺伝子セグメントの注釈、抗体のレパートリーと私たちの計算手法の鳥瞰的なビューを含む抗体シーケンス解析のためのプロトコルについて述べる。

概要

抗体システムは、獲得免疫系の基礎の一つです。その広大な多様性、罰金抗原認識特異性と抗原特異的 B 細胞のクローン性増殖が原因病原体の侵入に対して非常に強力なです。B 細胞の抗体産生のレパートリーは 10 以上と推定される単一の個々1で15 。この巨大な多様性は、免疫グロブリン遺伝子座2における VDJ 遺伝子組換えの助けを借りて、生成されます。全体の B 細胞レパートリーと抗原を免疫応答の動的変化の説明したがって、挑戦的な侵入の病原体に対する抗体の応答の完全な理解のため必須。

彼らの天文学的な多様性のため B 細胞レパートリーと見なされているブラック ボックス;ただし、NGS の技術の出現は、その複雑さ3,4の拡張を理解するブレークスルーになりました。全体抗体レパートリーが解析に成功して、まずゼブラフィッシュ5、それからマウス6と人間6,7。NGS 適応免疫応答における強力なツールとなっている今が共通点と違い個々 の動物の間で抗体のレパートリーでの基本的な分析を欠いています。

マウス IgG1 と IgG2c のもの、個人8間が大きく異なるに対し、IgM レパートリーが、個人間ほぼ同一であることが報告されました。V 遺伝子利用状況プロファイルに加えてナイーブ末梢 B 細胞に VDJ プロファイルの観測頻度は個人8間類似性の高い。VDJ 領域のアミノ酸配列の解析も示した接合部と同じシーケンスの発生の別のマウスの思想8以前より頻繁。これらの結果を示す抗体レパートリー形成のメカニズムが確率的ではなく決定的な5,8,9をすることができます。マウスにおける抗体のレパートリーの開発のプロセスも分析されている正常に NGS を使用した NGS の詳細10抗体免疫システムを明らかにする潜在性をさらに強調表示します。

本報告では、可視化、グローバル レベルでの抗体レパートリーを分析してシンプルかつ効率的な方法をについて説明します。

プロトコル

制度のガイドラインによると、国立研究所の感染疾患動物ケアおよび使用委員会の承認を得て、すべての動物実験が行われました。本報告では、代表的な結果はの国立感染症研究所、東京、日本、倫理委員会の承認を得て実行し、インフォームド コンセントを書かれてとして使用、健康な成人のボランティアから PBMCs のサンプリングが得られました。各参加者から倫理委員会承認フォームを使用します。

1. プライマー デザイン

  1. 免疫グロブリンを増幅する cDNA に普遍的な前方のプライマーを設計 mRNA の 5'-レース11,12とスマート PCR13技術において、PCR のプライマーからバイアスなし。
  2. 免疫グロブリン VH 遺伝子増幅用逆プライマー8,14 (図 1 a) として一定の領域に免疫グロブリンのクラス固有のシーケンスを設計します。
    注: 多重タグ シーケンスは、異なるサンプル ソースからライブラリの分子をラベルにこれらのプライマーのいずれかに追加できます。使用キット15のマニュアルに従って、nested pcr 法のシーケンスも追加できます。
普遍的な前方プライマー5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
逆にマウス免疫グロブリン (Ref.8) のためのプライマー
IgM_CH1:5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3'
IgG1_CH1:5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3'
IgG2c_CH1:5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3'
IgG3_CH1:5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3'
IgA_CH1:5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3'
Igκ_CH1:5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3'
Igλ_CH1:5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3'
逆にひと免疫グロブリン (Ref.14) のためのプライマー
IgM_CH1:5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3'
IgG_CH1:5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3'
IgD_CH1:5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3'
IgA_CH1:5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3'
IgE1_CH1:5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3'
IgE2_CH1:5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3'
Igκ_CH1:5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3'
Igλ_CH1:5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3'

免疫グロブリンの pcr のためのプライマー シーケンスの表 1:

2 免疫細胞や組織からの核酸分離

注: 以下の手順は、マウス脾臓から核酸を抽出するためです。ただし、他の免疫細胞やリンパ節などの人間の細胞や末梢血単核球 (PBMCs) (図 1 b) に適用されます。

  1. 組織、例えば、8 週齢の c57bl/6 マウスから脾臓の解剖し、分散した細胞を得るため PBS バッファーの 2 ml ステンレス製メッシュ (200 に 400 μ m) を通過します。2.0 mL 容マイクロ チューブ 600 × g 4 ° C で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。上清を捨てます。
  2. ペレットに ACK 溶解バッファー (150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3ナ2EDTA、pH 7.2 0.1 mM) の 800 μ L を追加し、組織で赤血球を溶解する 2 分間氷の上をインキュベートします。
  3. 2 ml の PBS 3 の組織細胞を洗う x、600 × g 4 ° C で 5 分間遠心分離によって続いた。
  4. ペレットにフェノール/グアニジン イソチオ シアン酸試薬の 800 μ L を追加渦徹底的にしで約 25 ° C で 5 分間加温します。
  5. クロロホルム (200 μ L) を追加、手動で 15 の振る s、約 25 ° C で 2 分間インキュベートしと。
  6. 段階を区切って 12,000 × g 25 ° C で 15 分間遠心分離し、上層の水相を新鮮なチューブに転送します。
  7. 70% のエタノールの渦は簡単に 1 つのボリュームを追加し、シリカ スピン列に適用します。
  8. 水の 30-100 μ L の RNA を溶出します。
  9. 初期の RNA 濃度を蛍光光度計 (資材表) を使用して量的に表わします。
  10. -80 ° C で浄化された RNA を保存します。

3. cDNA 合成や PCR 増幅

注: 以下の方法は、5'-レース11,12とスマート PCR 技術13に基づいています。詳細と反応の最適化は、キット15のマニュアルで説明します。マウス免疫グロブリンの原料は、2.10 の手順例です。ひと免疫グロブリンの原料は、サンプル、胎児の組織から例 PBMC、2.10 に 2.3 の手順の説明どおりに処理します。

  1. 5'-レース CD プライマー (オリゴ dT 含む) と15製造元の指示に従ってスマート PCR のオリゴヌクレオチド (資材表) を使用して総 RNA テンプレートの 10 μ g を 2 から最初繊維の cDNA を合成します。
    1. マウス免疫グロブリンで、普遍的な前方プライマーおよび免疫グロブリン クラス固有の逆のプライマー (表 1) を使用して忠実度の高い DNA ポリメラーゼと PCR 増幅 cDNA。として熱サイクリング条件を設定: 2 分後 30 94 ° C の 40 のサイクルの 94 ° C s、59 ° C 30 s、および 30 のための 72 ° C s、5 分 72 ̊ C で最終的な拡張ステップが続きます。
      注: 典型的な実験は、素朴な依存 Th1 と Th2 依存性 B 細胞 (図 3) を見て IgM、IgG1、IgG2c、Igk Igl の免疫グロブリン クラスを増幅します。
    2. ひと免疫グロブリンの 1st PCR のタグ シーケンスとユニバーサルの前方プライマーおよび免疫グロブリン クラス固有の逆のプライマー (表 1) を使用してを実行します。2nd PCR によって各サンプルのインデックスのシーケンスが含まれてインデックス シーケンスのプライマーを使用しています。次の PCR 条件および Taq のポリメラーゼを使用: 2 分、21 サイクル (1st PCR) または 32 サイクル (2nd PCR) 94 ° C で 30 94 ° C s、59 ° C 30 s、30 のための 72 ° C s。
      注: 典型的な実験は、IgM、IgD、(IgG1, IgG2, IgG3, igg4 抗体の IgG、IgA (IgA1 と iga2 は)、すべて B 細胞 (図 4) を見て Igl、Igk ige 抗体の免疫グロブリン クラスを増幅します。
  2. Agarose のゲルの PCR の製品を electrophorese し、シリカ膜のスピン列を使用して 600 に 800 bp フラグメントを浄化します。
    1. 3.2.1、3.2.2 2% の agarose のゲルからのサンプルを electrophorese します。
    2. UV transilluminator の DNA バンドを視覚化して 600 に 800 の間ブロード バンドを含んでいるゲルのスライスを bp。
    3. ゲルのスライスの 10 mg 当たりの膜結合溶液 10 mL を追加します。ミックスし、ゲルのスライスを完全に溶解するまで 50-65 ° C で孵化させなさい。
    4. ゲル溶液をシリカ膜のスピン-列に転送します。洗浄液で 1 回洗浄し、ヌクレアーゼ フリー水 (材料表) の 50 mL の DNA を溶出します。
  3. NGS の配列のための等しい量で各免疫グロブリンのクラスから、プールを蛍光光度計 amplicons と精製産物を定量化します。
    注: 通常、2 〜 10 mg 増幅 DNA は免疫グロブリンのクラスごとに回復されました。10-20 ng/mL の DNA を含む上昇 50 mL の溶液を与える DNA 量で均等に各サンプル ソリューションをミックスします。
  4. サイズとライブラリ ベースのマイクロ キャピラリー電気泳動を用いた DNA サイズ チップ (材料表) の濃度を決定します。20 ° C のライブラリを保存します。

4 ライブラリの NGS シーケンス

  1. シーケンス実行指定するサンプル名、インデックス情報の SampleSheet.cvs を生成し、.fastq ファイルのみを取得するように指示します。
  2. 試薬カートリッジ (材料表) とライブラリを解凍します。
  3. 0.2 N NaOH を行い目的のモル濃度を取得するライブラリを希釈します。
  4. すすぎし、乾燥のフロー ・ セル。試薬カートリッジのウェルに希薄と変性・ ライブラリ ・ ソリューションの 600 mL を追加します。
  5. シーケンス処理の実行を開始します。

5。 NGS データの品質管理

  1. 16「FASTX ツールキット」を用いた FASTQ データの品質管理を実行します。
    注: 使用するパラメーター設定の基本的な例は以下のとおりです。
    fastq_quality_trimmer v t 20 l 200 -i [InFilename.fastq] o [InFilename.fastq]
    fastq_quality_filter v q 20 p 80-i [InFilename.fastq] o [InFilename.fastq]
    fastx_reverse_complement v-i [InFilename.fastq] o [InFilename.fastq]
  2. 以下のコマンドで「fasta 核酸 (.fna)"に出力ファイルを書式設定。
    fastq_to_fasta - v の-n-i [InFilename.fastq] o [InFilename.fna]

6.fna データから免疫グロブリン シーケンスの抽出と分析。

注: サンプル プログラムは UNIX 環境で実装されました。例を参照してパフォーマンス可能性がありますオペレーティング システムとハードウェア環境に依存しているため、それらを使用してください。著者は、エラーまたは不作為について責任を負いません。プログラミング言語、Perl17、R18、および必要なモジュールは、引用のウェブサイト上の指示に従ってインストールする必要があります。IgBLAST プログラムは、適切な web サイト19,20上の指示に従ってインストールする必要があります。

  1. Https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine からレパートリー解析の社内プログラムの次の例をダウンロードします。
    03_PipeLine_Mouse.zip;マウス抗体シーケンスの解析のためのサンプル プログラムのセット。
    05_PipeLine_Human.zip;ひと抗体シーケンスの解析のためのサンプル プログラムのセット。
  2. シーケンス データを読み込み、抗体抽出: 各免疫グロブリンの一定した領域 (表 2) で署名シーケンスを検索する Perl プログラムによってデータ (.fna) から各免疫グロブリン クラスの免疫グロブリン (Ig) シーケンスを抽出します。
    1. マウス免疫グロブリン重鎖 (IgH) 遺伝子の以下のコマンドで、読み取りを抽出します。
      $ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [入力ファイル名] [出力ファイル名 (サフィックス)]
    2. マウス免疫グロブリンの軽鎖 (IgL) 遺伝子は、以下のコマンドで読み取りを抽出します。
      $ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [入力ファイル名] [出力ファイル名 (サフィックス)]
    3. ひと免疫グロブリンの重鎖 (IgH) 遺伝子を以下のコマンドで、読み取りを抽出します。
      $ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [入力ファイル名] [出力ファイル名 (サフィックス)]
    4. ひと免疫グロブリンの軽鎖 (IgL) 遺伝子を以下のコマンドで、読み取りを抽出します。
      $ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [入力ファイル名] [出力ファイル名 (サフィックス)]
  3. 注釈を付け、V (D) J の遺伝子組換えの生産性をチェックします。
    注: 以下の方法はスタンドアロン IgBLAST19 V (D) J 遺伝子セグメント シーケンス内のアノテーションを利用しています。説明20V (D) J の遺伝子のデータベースと IgBLAST のパラメーター設定を設定します。
    1. 次のコマンドでマウス免疫グロブリン重鎖 (IgH) 遺伝子注釈を付けます。
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-生物マウス - domain_system imgt-クエリ/$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_。file/mouse_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>./$OutName
    2. 次のコマンドでマウス免疫グロブリン軽鎖 (IgL) 遺伝子注釈を付けます。
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-生物マウス - domain_system imgt-クエリ/$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_。file/mouse_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>./$OutName
    3. 以下のコマンドでひと免疫グロブリン重鎖 (IgH) 遺伝子注釈を付けます。
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-生物人間 - domain_system imgt-クエリ/$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_。file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>./$OutName
    4. 以下のコマンドでひと免疫グロブリン軽鎖 (IgL) 遺伝子注釈を付けます。
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-生物人間 - domain_system imgt-クエリ/$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_。file/human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>./$OutName
  4. 抗体レパートリーのグローバル機能を視覚化します。
    1. 次のコマンドでマウス IgH レパートリーを視覚化します。
      $ .00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
      注: 入力ファイルは filename.fna (順序データ)、できれば 6.2.1 から出力ファイル。このファイルは、"filename"という下位ディレクトリ (フォルダー) に配置する必要があります。シェル スクリプトの行 50 の Para_4 の「ファイル名」を割り当てます。
    2. 以下のコマンドで人間の IgH レパートリーを視覚化します。
      $ .00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
      注: 入力ファイルは、filename.fna シーケンス データできれば 6.2.3 の出力ファイルです。このファイルは、配置する必要があります下のディレクトリ (フォルダー) の名前は「ファイル名」。シェル スクリプトの行 46 の Para_4 の「ファイル名」を割り当てます。
    3. 次のコマンドでマウス IgL レパートリーを視覚化します。
      $ .00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
      注: このパイプラインを持つ Igk と Igl 処理されます付随しています。入力ファイルは好ましくは filename.fna (順序データ)、6.2.2 から出力ファイル。このファイルは、"filename"という下位のディレクトリ (フォルダー) に配置する必要があります。シェル スクリプトの行 53 の Para_4 の「ファイル名」を割り当てます。出力ファイル名の「_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt」で終わる (図 3、IgL) 2 次元バー グラフ座標を与えます。
    4. 以下のコマンドで人間の IgL レパートリーを視覚化します。
      $ .00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
      注: このパイプラインを持つ Igk と Igl 処理されます付随しています。入力ファイルは、filename.fna シーケンス データできれば 6.2.4 の出力ファイルです。このファイルは、"filename"という下位ディレクトリ (フォルダー) に配置する必要があります。シェル スクリプトの行 53 の Para_4 の「ファイル名」を割り当てます。"_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt"で終わる出力ファイル名 (図 4IgL) 2 次元バー グラフの座標を与えます。

結果

マウス抗体レパートリ

全体としてマウス抗体レパートリーの観点は、細胞や組織、脾臓、骨髄、リンパ節、または血液などから入手できます。図 3は、単純なマウス脾臓からの軽鎖 (IgL) レパートリー IgM、IgG1、IgG2c、および免疫グロブリンの代表の結果を示します。読み取り番号の概要は表 3の通りです。たとえば、166,175/475,144 の読み取りに IgM 固有署名シーケンス (テーブル 2) が含まれているし、133,371/166,175 読み取りされた VDJ 生産的な IgBLAST19によって推論されます。

図 3は、3 D-VDJ-プロット、各ボールのサイズが読み取り; の相対的な番号を表します、VDJ 転位のレパートリー プロファイルを示しますつまり、全体の B 細胞で抗体 Mrna の数です。3-D メッシュは、染色体上の順序を反映するように配置、110 IGHV、12 IGHD と 4 IGHJ で構成されます。さらに、曖昧 IgBLAST によって割り当てられた遺伝子は立方体で 7,215 ノードを生じ、各 IGHV、IGHD、IGHJ ラインの最後の位置で個別に収集されました。

図 3には、2 D VJ プロットのプロファイルを示す VJ 転位 IgL レパートリーの中でも、表示されます。このプロットの各バーの長さは、読み取りの相対的な数を表します。X 軸は 101 IGLVκ と 3 の IGLVλ 遺伝子、y 軸は 4 IGLJκ、3 IGLJλ 遺伝子。Unannotated V- と J-遺伝子は、右の境界線で示されます。

相補性決定領域 3 (CDR3) 抗原結合特異性の大半を生じ、これらの生産的な読み取りのシーケンスが与えられた IgBLAST の出力。CDR3 はシーケンスを統計的に分析することができます、8、10上記として生物学的または技術的な複製を含みます。

ひと抗体のレパートリー

全体としてひと抗体のレパートリーの視点は、様々 な末梢血単核球 (PBMCs) を含む組織または病理組織から分析できます。総 IgG (IgG1、IgG2, IgG3, IgG4) ・ (IgA1 と iga2 は) IgA、IgD、IgE、IgL IgM の代表の結果を図 4に示します通常 PBMCs からレパートリー。読み取り番号の概要は、表 3の通りです。たとえば、90,238/1,582,754 ヒットが IgM 固有署名シーケンスを含む、67,896/90,238 読み取りされた VDJ 生産的。

それぞれのボールのサイズが読み取り; の相対的な番号を表します 3 D VDJ プロットに VDJ 転位のレパートリーのプロファイルが表示されます。つまり、抗体遺伝子発現の全体 PBMCs (図 4) の数です。3-D メッシュは 56 IGHV、27 IGHD、6 IGHJ、染色体上の順序で整列から成っています。さらに、曖昧 IgBLAST によって割り当てられた遺伝子は、立方体で 11,172 ノードを生じ、各 IGHV、IGHD、IGHJ ラインの最後の位置で別に表されます。

IgL のレパートリーで VJ 転位のプロファイルは、各横棒の長さが読み取り (図 4) の相対的な番号を表します 2 D VJ プロットで描かれています。41 IGLVκ と 32 の IGLVλ 遺伝子 x 軸、y 軸を表し、5 IGLJκ 5 IGLJλ 遺伝子。非注釈付き V- と J-遺伝子は、右の境界線で示されます。

人間 CDR3 シーケンスは IgBLAST で与えられる出力および8,10を前述のように統計的に分析することができます。

免疫グロブリン クラス感覚アンチセンス
マウス免疫グロブリン重鎖 (C57BL/6)
IgMAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCGACATTTGGGAAGGACTGACT
IgG1AAAACGACACCCCCATCTGTCGACAGATGGGGGTGTCGTTTT
(IgG1 のバリアント)AAAACAACACCCCCATCAGTCGACTGATGGGGGTGTTGTTTT
IgG2cAAAACAACAGCCCCATCGGTCGACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgG3GTGATCCCGTGATAATCGGCTAGCCGATTATCACGGGATCAC
伊賀TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAGTCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG
マウス免疫グロブリン軽鎖 (C57BL/6)
IgκCTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCGCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
Igλ1TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGCTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ2TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAGCTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ3TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAGCTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA
Igλ4TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGCTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA
ひと免疫グロブリンの重鎖
IgMGGGAGTGCATCCGCCCCAACGTTGGGGCGGATGCACTCCC
IgGGCTTCCACCAAGGGCCCATCGATGGGCCCTTGGTGGAAGC
伊賀GCATCCCCGACCAGCCCCAAGACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgDGCACCCACCAAGGCTCCGGATCCGGAGCCTTGGTGGGTGC
IgEGCCTCCACACAGAGCCCATCGATGGGCTCTGTGTGGAGGC
ひと免疫グロブリンの軽鎖
IgκACTGTGGCTGCACCATCTGCGCAGATGGTGCAGCCACAGT
Igλ1、2、6GTCACTCTGTTCCCGCCCTCGAGGGCGGGAACAGAGTGAC
7 Igλ3GTCACTCTGTTCCCACCCTCGAGGGTGGGAACAGAGTGAC

表 2: 免疫グロブリン署名シーケンスの概要

マウス IgH合計読み込みIgMIgG1IgG2c
入力475,144
IgC 含む166,175229,67136,628
VDJ 生産性133,371196,58331,446
マウス IgL合計読み込みIgKappaIgLambda
入力527,668
IgC 含む178,94821,446
VJ 生産性160,92416,988
人間 IgH合計読み込みIgMIgG伊賀IgDIgE
入力1,582,754
IgC 含む90,2385,29894,06175,5492,932
VDJ 生産性67,8962,77578,20356,4953
人間 IgL合計読み込みIgKappaIgLambda
入力1,582,754
IgC 含む120,31664,148
VJ 生産性97,16952,324

表 3: 読み取り数値実験の概要

figure-results-1
図 1: 個々 のマウスにおける抗体レパートリーを分析するためのシーケンス処理戦略の概略図。(免疫細胞や組織からの A) 総 RNA は逆転写され、普遍的な前方のプライマーを用いた PCR 増幅し、免疫グロブリン クラス固有逆プライマー。各免疫グロブリンのクラスから amplicons プール、次世代シーケンサー用に表示されます。(B)生物的複製 c57bl/6 マウスから脾臓が次のように扱われたよう: 脾臓サンプルから精製した総 Rna と Cdna の 5'-レースで普遍的なプライマーおよび抗体のクラス特定のプライマーを使用して増幅されました。彼らは、個々 のマウス用プライマー付け次世代シークエンシングのため表示されていました。図の部分は、権限を持つ8から適応されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2
図 2: 個々 のマウスにおける抗体レパートリーを分析するためのデータ処理フローチャートのスケマティック。次世代シーケンス後に得られた私アンプリコン読み取りを次のように処理された: (1) リードの配列が抗体クラス固有の署名シーケンス; の有無をチェック(V、D、2) シーケンスを調べたし、J の遺伝子断片 IMGT/HighV-探求および/または IgBLAST; を使用して(3) 生産性 VDJ ジャンクションを含むシーケンスを採取されました。(4) これらのシーケンスが使用された CDR3、全体的なレパートリー機能の解析などをこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-3
図 3: グローバル データ可視化マウス抗体レパートリー 。各抗体のクラスの全体のレパートリーのプロファイルは、3 D VDJ プロットによって想像されたもの。X 軸は、110 の IGHV 遺伝子が染色体上で注文を表します。Y 軸と z 軸を表し、12 IGHD 4 IGHJ 遺伝子、それぞれ。各ノード上のボリュームでは、読み取りの数を表します。赤球: 非注釈付きの V、D、J の遺伝子。IgL を読む各横棒の長さが読み取りの相対的な番号を表します 2 D VJ プロットの分布を示します。X 軸は 101 x IGLVκ と 3 の x IGLVλ 遺伝子を表し、y 軸は IGLJκ と x IGLJλ 遺伝子の 3 x 4 を。非注釈付きの V と J の遺伝子は、右の境界線で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4
図 4: ひと抗体のレパートリーのためのグローバルなデータ可視化。各抗体のクラスの全体のレパートリーのプロファイルは、3 D VDJ プロットによって想像されたもの。X 軸は、56 の IGHV 遺伝子が染色体上で注文を表します。Y 軸と z 軸を表し、27 IGHD 6 IGHJ 遺伝子、それぞれ。各ノード上のボリュームでは、読み取りの数を表します。赤球: 非注釈付きの V、D、J の遺伝子。IgL 読み取りは、各横棒の長さが、読み取りの相対的な番号を表します 2 D-VJ のプロットに配列されます。X 軸は IGLVκ と 32 の x IGLVλ 遺伝子 x 41 を表し、y 軸は 5 x IGLJκ と 5 つの x IGLJλ 遺伝子を。非注釈付き V- と J-遺伝子は、右の境界線で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明した方法は、抗体 rna の 5'-レース メソッドを使用して増幅された NGS を利用します。縮退 5'-V のH遺伝子のプライマーを使用する方法と対照をなして各抗体クラスの Mrna は、均等に普遍的な前方のプライマーを使用して増幅されます。さらに、定数領域 1 (CH1) 抗体遺伝子のアンチセンス プライマー特定の使用レパートリーが特定免疫グロブリン クラスのプロファイリングを有効にします。これクラス固有の抗体応答を解剖するためだけでなく、素朴な免疫レパートリー8,9を比較するために非常に有益です。

メソッドの最も可能性の高い落とし穴は、増幅された免疫グロブリン メッセージの不足です。実質的にこのプロトコルによって得られる抗体レパートリーの深さは、3.1 と 3.2 の手順に記載されている pcr によって異なります。レパートリー深さが正しく得られない場合テンプレート cDNA と階段 3.2.1、3.2.2 でプライマーの比率を変更することは強くお勧めします。

通常、NGS によって生成される抗体読み取りの約 20% は、あいまいなシーケンス21です。でも確立「補正法」, 5-10% のままあいまいな3。我々 は、したがって、シーケンスを解析、免疫グロブリン定数領域 (CμH1、Cγ1H1、Cγ2cH1 など) に対応する署名シーケンスを含んでいる生の読み取りをフィルター処理します。したがって体細胞超変異の解析には、慎重な検査が必要があります。

このメソッドの制限の 1 つはその免疫グロブリン重と軽鎖のペアは推論することができます。したがってこのメソッドによって得られるレパートリー ビューは全体ではありません。ただし、データ10の統計解析による一流のペアを近似することが可能です。また、免疫グロブリンのペアだったシーケンスする手法が最近3,4が報告。

出力 .fna データで免疫グロブリンのシーケンスは、免疫グロブリン遺伝子の署名の存在に基づいて抽出されました。セグメントは、注釈が V、D、J の遺伝子と V (D) J の再編成の生産性を評価しました。相補性決定領域 3 (CDR3) シーケンスされた注釈も。.Fna データで免疫グロブリン シーケンスのこれらの体系的な検査は、IMGT/HighV-クエスト サーバー22,23,24によって提供された便利。ただし、自動処理パイプラインを構築すると、大きな実験データを分析するメリットがあります。各目的のためにカスタマイズされたパイプラインは、スタンドアロン IgBLAST プロトコル19を使用して設定することが可能です。このアプローチは、基本的なプログラミングのリテラシーが必要が免疫グロブリンのシステムの詳細な分析に便利です。記載されているパイプラインは、カスタマイズされたプロトコル (図 2) の例を示します。

抗体の数を読み取りますで抗体の抗体成分を反映したサンプルの Rna 抗体の量に比例した時間ポイント5,8,25を与えられます。ここで説明する方法は、V (D) J R プログラム8,18,26を使用して抗体レパートリー国憲の鳥瞰図を提供します。

個々 の素朴なマウスの IgM 抗体レパートリーのグローバル ビューでは、特異的な IgG1 または IgG2c8に比べて非常に節約された VDJ プロファイルを明らかにしました。未熟なゼブラフィッシュ VDJ 組み合わせが非常にステレオタイプ化された9であると報告されました。対照的に、人間 VDJ の組み合わせは非常に歪んだ6のことが報告されます。ナイーブ B 細胞の非常に節約された決定的 VDJ プロファイルが自動抗原体の提示でおそらくどちらか歪んだ VDJ 再構成によって生成されたまたは負の選択。たとえば、IGHV11 2 は胎児の IgM レパートリー27で優先的に表現され、この優位性は IGHV11 2 の老化赤血球27に対して自己反応性に起因します。興味深いことに、IGHV11 2 は素朴な IgM8の以前に発行された分析で最も一般的な主要なレパートリーであったも。

ここで説明したメソッドはキー抗体レパートリー8の不注意な省略を避け、個々 の体に生成された抗体レパートリー スペースを総括して分析することにより抗原応答性抗体レパートリーを解読するのに便利 10。このメソッドを使用を容易にする、詳細な抗体ネットワーク ダイナミズムの検討新興国に対する保護抗体の発見を加速するも病原体。

開示事項

著者はある利益相反を開示します。

謝辞

この作品は、アメッド許可番号 JP18fk0108011 の下でからの助成金によって支えられた (KO と SI) と JP18fm0208002 (TS、KO、および YO) と KO に文部省、文化、スポーツ、科学および技術 (15 K 15159) から補助金。貴重なテクニカル サポート、さゆり山口と佐々木聡子に感謝します。Editage (www.editage.jp) 英語の言語を編集するために感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 mL ストリップチューブサーモフィッシャーサイエンティフィックAB0452120
ストリップ 100 bp DNA ラダー東洋紡DNA-0350.5 mL
2100 バイオアナライザーシステムアジレントテクノロジーG2939BA/2100
酢酸和光017-00256500 mL
アガロース、NuSieve GTGロンザ50084
アンモニウム塩化物和光017-02995500g
クロロホルム和光038-02606500mL
ダルベッコのPBS(-)」ニッスイ」ニッスイ 08192
エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (2NA)和光345-01865500 g
ファルコン 40 & マイクロ;m セルストレーナーFalcon35234050/Case
ling lock tube 1.7 mLBM EQUIPMENTBM-15
ling lock tube 2.0 mLBM EQUIPMENTBM-20
MiSeq Reagent Kit v2illuminaMS-102-2003500 cycles
MiSeq SystemilluminaSY-410-1003
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Potassium Hydrogen Carbonate Wako166-03275500 g
PureLink RNA Mini Kitlife technologies12183018A
Qubit 3.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32854500 アッセイ
よりスマートなレース5 '/ 3'キット クロンテック 
TaKaRa Ex Taq ホットスタートバージョン タカラバイオ株式会社 RR006A 
Trizma baseSigmaT60661 kg
TRIzol 試薬AmbionThermo Fisher Scientific15596026100 mL
Ultra Clear qPCR CapsThermo Fisher ScientificAB0866120 strips
UltraPure Ethidium BromideThermo Fisher Scientific15585011
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System プロメガ A9282
ズ 634858の

参考文献

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V D J 5 RACE

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