方法論記事

2 次元エレクトロスピニング ナノファイバー マットの 3 次元足場への拡張

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DOI：

10.3791/58918

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2019年1月7日

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1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

この記事について

サマリー

この記事は、亜臨界 CO2流体の減圧による 3 次元 (3 D) 足場に伝統的な 2 次元 (2 D) エレクトロスピニング ナノファイバー マットを拡大する方法を示します。これらの拡張の足場は 3 D、厳密に模倣細胞 nanotopographic キューであり、生物学的分子ナノファイバー内にカプセル化の機能を保持します。

要約

エレクトロスピニングは、細胞外マトリックス、組成、構造、および繊維の繊維径の簡単調節するバイオミミ クリーのため合成、機能性足場材料の生産に最寄りの技術をされています。ただし、これらの利点にもかかわらず、足場などの制限で来る伝統的なエレクトロスピニング ナノファイバー解体ナノファイバー向き、低気孔率、細孔サイズ、および主に二次元のマット。そのため、上記の制限を克服することができますエレクトロスピニング ペプチドナノファイバースキャフォールドを作製する新しいプロセスを開発するための大きい必要性があります。ここで、新規でシンプルな方法を説明します。伝統的な 2 D ナノファイバー マットは、所望の厚さ、ギャップ距離、気孔率、細胞および亜臨界 CO2流体の減圧によって増殖を許可する nanotopographic キューと 3 D 足場に変換されます。発生する組織再生用足場に加え、このメソッドはまた、薬剤の局所投与の抗菌ペプチドなどの生理活性物質をカプセル化する機会を提供します。CO2拡大ペプチドナノファイバースキャフォールド組織再生、創傷治癒、組織の 3 D モデリング、および局所薬物送達の大きな可能性を保持します。

概要

組織の修復・再生を支援する患者に注入することができる合成足場を開発のコンセプトは、何十年も再生医療の分野に浸透しています。理想的な合成足場周囲の健康な組織からの細胞の遊走を誘導するのに役立つ細胞播種・接着、シグナリング、増殖・分化、サポートの血管新生のアーキテクチャを提供します, 十分な酸素化が可能と栄養配信し、注入1の後の成功を確保するためホスト免疫活性を促進します。さらに、それ使用できますキャリアとして抗菌分子を埋め込むため創傷治癒1,3,6,7,8,9を支援します。合成の足場からこれらの生物学的分子の一時的なリリースを制御する能力は、工学骨格の1と見なされます別の望ましい属性です。

静電紡糸ナノファイバー足場1,2,3,4,5,6を生産するための適正使用法をされています。ここで説明したものなどナノファイバー足場を作成する以前の試みは、成功の度合いに行われています。しかし、伝統的なペプチドナノファイバースキャフォールドには、これらの目標を達成する能力が限られています。伝統的なナノファイバー足場はほとんど二次元マット1,3をされています。これらの nonexpanded の足場が小孔サイズを密集します。これは生体内で1,7,8,9を見られるには十分な環境を促進しない、細胞浸潤、移行、および分化を制限します。このため、2 D ナノファイバー マットに付属している固有の欠陥を修正するの 3 D エレクトロスピニング ナノファイバー足場の準備のより新しい技術が設けられています。これらの技術は、3 D の足場。しかし、彼らは水溶液を必要とし、手続きを凍結乾燥製法による適用を限った。この処理の結果、制限された組織、適切な厚さおよび/または細胞の遊走や増殖に必要な十分な nanotopographic キューを提供するために必要な気孔率なしナノファイバーのランダムに分布。これらの要因は、生活の十分な擬態を欠いている以前の 3 D エレクトロスピニング ペプチドナノファイバースキャフォールド組織1,7,8,9。

細胞外マトリックス (ECM) のより良いバイオミミ クリーを 3次元に拡張した足場の開発をより最近の試みはのよりよい制御を支援するため、水溶液中のナトリウム水素化ホウ素 (NaBH4) 固溶化熱処理とあらかじめデザインされた金型を使用して行われている、結果の形状は、7、8 を足場します。ただし、このメソッドはそれがポリマーや水溶性、任意のカプセル化された生体分子を妨げる水溶液・化学反応・凍結乾燥の使用を必要と適していません。使用される添加物は組織再生8,9時の副作用もあります。大きくこの資料に記載されている CO2拡張メソッド処理時間が短縮、水溶液の必要がある、量よりも大きい程度に生理活性分子の機能を保持、以前確立された方法9。

個別やエージェントを解放するこれらの足場の可能性を調査するための組み合わせで先行研究、抗生物質、銀、1 α、25 ジヒドロキシ D3、および抗菌ペプチドの LL 37 だったナノファイバー足場に読み込まれるさらに創傷治癒の9,10,12,13を支援します。ナノファイバー足場拡張のこの方法を実証を目的として Coumarine 6, 蛍光色素は、様々 な目的化合物と足場を埋め込むことの可能性を示すに足場にロードされます。カプセル化された生理活性分子と組み合わせて拡張ナノファイバー足場製造のこのメソッドは、組織再生、創傷治癒、組織の 3 D モデルの作成、薬の局所配信に大きな可能性を保持しています。

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プロトコル

すべては、生体内での下記手続は、ネブラスカ大学医療センターで IACUC 委員会によって承認されました。

1. 標準静電紡糸用のソリューションを準備します。

  1. 20 mL ガラス管に poly(ε-caprolactone) の 2 g を溶解 (PCL、Mw = 80 kDa) ジクロロ メタン (DCM) の混合溶媒中と N, N-ジメチルホルムアミド (DMF) を 10% (w/v) の濃度で 4:1 比 (v/v) とします。
    注意: ハンドル DCM および換気フードに DMF ガスへの暴露を避けるために。プラスチック材料には、DCM を公開しません。
  2. ソリューションが明確になるまで、ラボ ローテータにガラス管を配置します。ソリューションを一晩混ぜることがあります。
  3. 足場にペプチドや薬物などの生体活性材料を埋め込むしようとすると、個別のソリューションを作成しを使用する準備ができるまで 4 ° C で格納します。
    1. PCL 溶液 20 mL を使用して蛍光色素溶液 (50 mg/mL) を準備します。

2. エレクトロスピニング装置 (図 1 a) を設定します。

  1. 21 ゲージ鈍針と PCL ソリューションを 20 mL の注射器に追加します。注射器と関連付けられているチューブに空気がないことを確認します。
  2. 地面コレクター針の先端から 12 cm と回転スチール ドラムを配置します。
  3. ワニ口クリップを使用すると、針に高電圧の直流 (DC) 電源を接続し、コレクターが接地されていることを確認します。
    注意: は、常に任意の接続材料を取り扱う前に電源をオフに。

3. エレクトロスピニング

  1. PCL 溶液 20 mL、に対してには、次のようにシリンジ ポンプのパラメーターを設定: 直径 20.27 mm、流量を = = 針の先端に液滴を形成する場合、0.5 mL/h のチェック。
  2. 生理活性分子の結合が必要な場合はコーアクシャル エレクトロスピニング(図 1 b)を許可するように装置を設定します。注射器の針を使用してカスタマイズされた同軸ノズルを作成します。
    注: このようなノズルも市販されています。色素の溶液を調製して、そのような分子を追加することをシミュレートすることに注意してください。
    1. 蛍光染料水にクマリン 6 の 1% 溶液を準備します。小さい注射器に 1% 染料の 3 mL を追加します。PCL ソリューションとして同じ同軸ノズルに注射器を接続します。もう一度、空気の泡がないことを確認します。
    2. この 3 mL のソリューションでは、次のようにシリンジ ポンプのパラメーターを設定: 直径 9.49 mm、流量を = = 0.02 mL/h のチェック、針の先端に液滴を形成しています。
  3. 20 の電位を適用 kV スピナレット (22 g 針) と地上のコレクター間にある紡糸から 20 cm。2,000 rpm で回転ドラムで一直線に並べられたナノファイバー マットを収集します。〜 1 mm の厚さに達すれば PCL ナノファイバー マットを収集します。

4. PCL ナノファイバーの生成は、アレイの穴マットします。

  1. PCL ナノファイバー マットを作製します。
    1. PCL ビーズ比濃度 10% (PCL) (w/v) で 4:1(v/v) の DCM と DMF から成る混合溶媒中に溶解します。0.7 mL/h 20 の潜在的な中のシリンジ ポンプを使用して流量で PCL ソリューションをポンプ kV がスピナレット (22 ゲージ針) の間適用され、接地コレクターある紡糸から離れて 12 cm。
    2. 500 rpm を超える回転速度と回転ドラムを用いたナノファイバー膜を収集します。
  2. 浸す液 N2 5 分で PCL ナノファイバー マット (すなわち。、堅くなる)。リキッド N2の PCL ナノファイバー マットを保ち、0.5 mm 径パンチで PCL ナノファイバー マットをパンチします。

5 2D ナノファイバーの拡張マット付き/なしの亜臨界 CO2液体を介してアレイの穴 (図 2)。

  1. 5 分間液体窒素に PCL ナノファイバー マットを置き、エッジの変形を避けるために液体窒素に浸漬しながら手術用はさみを使用して 1 cm × 1 cm の正方形にカットします。
  2. ドライアイスの ~ 1 グラムと 30 mL の遠心管にカット マットを置きます。しっかりと蓋をキャップし、液体 CO2に変更するドライアイスを可能にします。
  3. 液体がチューブの形成後すぐにキャップを開くことによって圧力を解放します。
    注意: は、液体窒素やドライアイスを使用するときに適切な熱保護具を使用します。顔に向かって加圧チューブを開かないでください。遠心管を繰り返し使用しないでください。
  4. 削除し、チューブから息切れの足場を確認します。ドライアイスと新しい遠心管に足場を置き、所望の厚さを達成するまでを繰り返します。細胞培養前にエチレンオキ サイドで展開されたペプチドナノファイバースキャフォールドを滅菌します。

6. 拡張ペプチドナノファイバースキャフォールドのキャラクタリゼーション

  1. 形態と構造の走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して展開されたペプチドナノファイバースキャフォールドを特徴付けます。
    1. 金属スタッドと 40 のプラチナ コート両面導電性テープのサンプルを置く s 40 でスパッタ コーターを使用して mA。
    2. 以前の研究9によると SEM を用いた繊維を調べます。15 の加速電圧で画像を収集 kV。
  2. リリース プロファイル体外とリリースされたペプチドの活性を特徴付けます。
    1. 重量ナノファイバー膜前に、と CO2の拡大後の 10 mg です。
    2. PBS バッファーのサンプルを浸すし、異なる時間ポイント (0-28 日) に清の 10 μ L を収集します。
    3. 収集した上澄みの LL 37 ペプチド濃度を定量化するのに酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) キットを使用します。
  3. 細胞浸潤の体内とホストの応答を調べる。
    1. 9 週間の古い Sprague-dawley (SD) ラットを麻酔室に入れて、イソフルラン蒸気に接続し、ラットを麻酔します。ラットになる感情の無い完全な麻酔後、手術台にラットを転送します。継続的に手術中に気化器とイソフルラン ノーズコーンを用いたラットを麻酔します。動物のシェーバーでラットの背中の毛を剃るし、ヨードとアルコールの皮膚のスクラブで滅菌します。メス背上棘上サイトに 1.5 cm の切開から皮下ポケットを作成します。
    2. 各切開のピンセットを使用して皮下のポケットに 1 つの拡張されたナノファイバー足場 (1.5 mm 厚) を挿入します。ホッチキスを使用して切開部を閉じる。
    3. 1、2、および 4 週間は 95% の CO2とラットを安楽死させます。そっと外植体と手術用のはさみを使用して周囲の組織を解剖します。組織学的分析の前に、少なくとも 3 日間、ホルマリンで組織のパラフィン包埋を埋め込みます。ミクロトーム、組織のセクションし、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) を実行マッソンのヒアリン染色します。

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結果

異なる容量の亜臨界 CO2流体の減圧による 3 D 足場に伝統的な 2 D エレクトロスピニング ナノファイバー マットを拡大の有効性を示した: 1 mm 2.5 mm に未処理のときから足場の厚さが増加したと1 と 2 の CO2治療と 19.2 mm それぞれ (図 3 aの C)。細胞にとって重要なアーキテクチャの気孔率の特性-も厚みが増加 (図 3) に対応するように増加しました。(図 3 D

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ディスカッション

伝統的な 2 D エレクトロスピニング ナノファイバー マットを経由でCO2減圧を行った拡張 3 D 足場に変換。伝統的な 2 D ナノファイバー マットは、亜臨界 CO2流体を介して正常に拡張です。重要なステップは、最適化された条件下で 2D ナノファイバー マットを作製し、エッジを変形させないで、マットをカット (e.g。 を使用して鋭い外科はさみ)。この CO2-拡張ペプチドナノファイバースキャフォールド梱包密度 (図 3 D・ H)、およびより高い気孔率 (図 3 D) 以下層状構造 (図 3 aB) を含む伝統的な 2 D マット上多くの利点があります。この拡張メソッドは処理する方が迅速だという点でにも拡張の既存の方法の相対的な有利であり水溶液のこの方法の除外に伴う...

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開示事項

著者は、利害の対立がないことを宣言します。

謝辞

この作品が支持されたによって付与から国立科学研究所の一般医療 (日の出) (2 P 20 GM103480-06 と J.X. に 1R01GM123081)、NIH でネブラスカ大学医療からオーティス グリーブ医療研究財団、NE LB606、スタートアップ資金センター。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ポリカプロラクトンSigma-Aldrich440744
N,N-ジメチルホルムアミドフィッシャーケミカルD-199-1
ジクロロメタンフィッシャーケミカルAC61093-1000
クマリン 6シグマ-アルドリッチ546283
回転スチールドラムカスタマイズエレクトロスピニング中のコレクターとして機能します。
シリンジポンプフィッシャーサイエンティフィック14-831-200同軸紡績には、2つのシングルシリンジポンプが必要です。
リボルバーラボネットインターナショナルH5600ソリューション用の調整可能なラボローテーター
下注射針(27G x 1 1/2インチ)エクセリントインターナショナル株式会社26426これは、示されている同軸ノゼルをカスタマイズした例の一部です。
皮下注射針 (21G x 1 1/2")EXCELINT International Co26416これは、示されているカスタマイズされた同軸ノズルの例の一部です。
高電圧DC電源ガンマ高電圧研究ES30
走査型電子顕微鏡FEINova 2300
蛍光顕微鏡イスアクシオイメージャー2
LL 37 ELISAキットHycultバイオテックHK321-02
混合皮ツァ

参考文献

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
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  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
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3D CO2

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