方法論記事

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

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DOI：

10.3791/59084

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2019年2月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Molecular Brain Research, Ruhr University Bochum, 2Central Animal Facility of the Medical Faculty, Ruhr University Bochum

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

透過型電子顕微鏡と子宮内で伝達の組み合わせは、開発中に神経系の細かい微細構造の形態学的変化を研究するための強力なアプローチです。これらの併用は、神経可塑性の地形表現に関しての基になる構造の詳細の変更への深い洞察をことができます。

要約

本研究は興味の蛋白質によって影響される、明確に識別された地形構造の微細構造パラメーターの正確な寡を目指して透過型電子顕微鏡 (TEM) で子宮内で伝達を組み合わせたウイルスの転送を介して生物に導入されます。この手法により、細孔から微細構造同定へのスムーズな移行のため組織アトラスの次の地形のナビゲーション マップ。子宮導入組織の高分解能電子顕微鏡、神経とその可塑性パラメーター、断面のシナプスブートン エリア、シナプス小胞内のミトコンドリア数などの細かい微細構造を明らかにする、ブートン プロファイル、シナプス、断面の軸索地域、ミエリン鞘の太さ、髄鞘層板の数とミトコンドリア プロファイルの断面領域の長さ。これらのパラメーターの解析では、神経系の遺伝的構造のウイルスの伝達によって影響を受けるエリアの微細構造可塑性の変化に重要な洞察力を明らかにします。これらの併用のみ神経可塑性に遺伝子組み換えの生体分子や薬剤の直接影響を研究するため使用しないことができますが、また (のコンテキストでは例えば、神経可塑性の子宮内で救助を勉強する可能性を開きます神経変性疾患)。

概要

光子は、電子の深さのグレードで極薄の組織標本を貫通できます。これはナノメートル微細構造の光学顕微鏡技術と比較した場合の解像度の画像をキャプチャで TEM に貴重な利点を属性します。たとえば、TEM は、分泌顆粒、微小管、フィラメント、繊毛、絨毛上皮 (細胞表面の様々 なタイプ、メラノソーム、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラの可視化特殊化)、特に神経系1,2,3,4シナプスします。本方法論研究の全体的な目標です神経可塑性変化の微細構造認識出生前干渉時に開発時に子宮内での伝達と TEM の最新の技術を組み合わせることによって興味のバイラル符号化された蛋白質は、中枢神経系5,6、7、6脊髄などに子宮内で導入されています。例えば、子宮内で伝達電子顕微鏡との組み合わせでは細胞接着分子 L1 の運動 L1 と核内受容体タンパク質間の相互作用に関して、特に L1 欠損マウスにおける可塑性を学習に及ぼす影響を研究するため使用されています小脳ニューロン7。

神経可塑性パラメーターの解析には、中枢神経系内の最小領域の局在に関する正確な情報が必要です。したがって、微細構造の詳細とその他の構造についての正確な地形向きについて説明するのには十分です。本研究では光と電子顕微鏡観察に基づく明瞭な形態の区域の詳しい調査を目指して特定の準備メソッドが表示されます。このアプローチは、組織操作、マウスの脳および脊髄の子宮内での伝達から始まる、および灌流固定後のいくつかのテクニックを組み合わせた金型埋め込むと TEM の組織を処理します。埋め込みと TEM のティッシュの処理の間に含まれている重要なステップはの microphotographic と低倍率の正確なドキュメントは、干渉光の反射法による組織のドキュメント組織標本8,9,10。本手法により、神経組織表面と TEM の準備の前に供試体スライス プロファイルの地形と構造の詳細を検討する研究手法に組み込まれ、.

頭脳全体の区分のための特別なフレームは、定位座標に対応します。このフレームは神経組織の区域の形態の三次元 (3 D) 再構成を利点し、形態分析に使用することができます。可視化のセクションの macrographs が地形座標を割り当てられ、連番付きのセクション組織アトラスのマップを構築します。

樹脂加工後で超薄切片に埋め込まれた組織の断面 (< 70 nm) 上記組織アトラスの地図によると、選択したエリアを含んでいます。その内容と連絡先団地内近隣構造物への塑性パラメーター (例えば、シナプス ボタンまたは軸索線維のプロファイル領域を断面するなど) の高解像度の画像を取得する TEM を超薄切片を受けます神経網。

記載の方法で可視化破面観察からマイクロ構造およびナノ構造への滑らかな移行は以後の子宮内開発の神経形態学的神経可塑性の詳細な比較を許可します。システム。

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プロトコル

動物の主題のすべてのプロシージャは、ハンブルク、ドイツのノルトライン ・ ヴェストファーレン州の州の動物倫理委員会によって承認されています。 滅菌器具、手袋、外科プロシージャ全体で無菌のコートを使用します。

1. 子宮伝達で

  1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ph 7.4 でアデノ随伴ウイルス タイプ 1 (AAV1) (4 x 1011ウイルス粒子/μ AAV1) の目的のターゲットのためのコーディングを準備します。0.1 mg/μ L の高速グリーンを追加し、37 ° C で AAV1 高速グリーン混合物を保持
  2. 目的の形をした薄いキャピラリー先端を準備 (80 μ m と内側の外側の直径、長さ 8 mm 直径 50 μ m)、マイクロ ピペットの引き手を使用して (設定: 圧力 = 500、熱 700、プルを = = 0、速度 = 80、時間 = 200、材料表を参照してください ).それは 4-5 mm、キャピラリーの先端を破る。
  3. キャピラリーの先端に吸引器チューブ (44 × 0.7 cm) をアセンブルし、毛細血管に AAV1 高速グリーンの混合物の 15 μ L を吸引します。
  4. プロシージャ全体で 37 ° C の一定の生理的体温で動物の科目を維持します。
  5. エームスプレインキュベーションの商工会議所に妊娠 c57bl/6 マウス (萌芽期日 14.5) を置き、麻酔ガスの 4% イソフルランとマウス (体積気流率 0.6 0.8 L/分)。
  6. ブプレノルフィン (体重の 0.1 mg/kg) を皮下注入します。
  7. Prewarmed 外科プレート (37 ° C) を麻酔下のマウスを置きます。
  8. 潤滑剤で目をカバーします。
  9. 麻酔マスクを持つマウスを合わせて (0.6 から 0.8 の体積風量でガスの 1.5% イソフルラン L/分) 外科プレート、ひげをそる腹部皮膚領域。剃毛地域 3 X 75% エタノールとし、betadine ソリューションを拭いてください。
    注:麻酔下のマウスの呼吸動作を継続的に監視します。マウスの吸入吐出パターンに従ってイソフルラン麻酔ガスの濃度を調整します。
  10. マウスの後肢の指骨を絞ることによって足底反射の有無を確認します。
  11. 曲線鋸歯状アイリス鉗子 (10 cm) で皮膚をつかんで、ストレート超硬はさみ (10 cm)、リネア正中に沿って皮膚を切断し、ストレート ・ デュモン ピンセット (12 cm、0.2 mm と腹膜壁を掴んで腹部キャビティを開く× 0.12 mm) とストレート ヴァンナの白線に沿って壁を切断はさみ (8 cm)。
  12. 腹部の開口部に穴あきパラフィン フィルムの部分を置き、マイクロ モスキート止血鉗子 (12.5 cm の曲線) と両端にフィルムを修正します。
  13. 子宮角内の胚への損傷を避けるためにスプーンのようなデバイスと子宮角を公開します。子宮角に PBS (37 ° C) を数滴を滴下し、損害または奇形子宮嚢内胚を確認します。
  14. 子宮角の胚の位置や順序を文書化します。注入の目的の位置に到達するまで慎重に子宮嚢内胚をオンにします。
  15. AAV1 高速グリーンの混合物の 1-2 μ L を注入すると、注入部位 (例えば、脳室) および顕微鏡の下で染料の浸透を視覚的に調べることによって。
  16. 注入された胚を文書化し、腹腔内に注入された胚と子宮角を配置します。
  17. 腹腔内に PBS (37 ° C) を数滴を滴下します。腹腔の壁 (使用ポリアミド 6-0 サイズ縫合糸) や皮膚 (使用ポリアミド 3 0 サイズ縫合)、ホルステッドのモスキート止血鉗子 (12.5 cm) 曲線を使用して縫合して空洞を閉じます。また、単純なパターンに中断またはステンレス製縫合/ステープルを使用する腹部キャビティそして皮膚を閉じます。

2. 隔離されたティッシュの Telemacrophotography

  1. バッファーの準備
    1. Na2HPO4と 1 l 蒸留水 200 rpm で攪拌下の瀬2PO4 2.18 g 溶解の 14.95 gデニスソレンセンのバッファー (1 L) を準備します。灌流末の胎仔および/または出生後の子犬期間、腹部や胃内注入用針の適切なサイズを使用して、ターミナル ナトリウム ペントバルビ タール麻酔濃度が 180 mg を超えないことを確認してください/体の kg の重量を量る。
    2. 75 ° C に蒸留水 500 mL を加熱することによってMugnainiの固定の解決 (5 L) を準備し、5 の 200 μ L を追加する、200 rpm で攪拌下パラホルムアルデヒド粉末 50 g を追加する N 水酸化ナトリウム、デニスソレンセンのバッファーの追加 1,500 mL、1,750 mL の蒸留水、と 25% グルタルアルデヒドの 500 mL。5,000 mL を蒸留水に詰めます。灌流のこの最後のバッファーを使用します。
      注: ボンネットの下の Mugnaini の固定の解決を準備、保護メガネを着用し、煙を避けるため。灌流のより良い視覚化のメチレン ブルー (0.05 g/L) を追加します。
  2. マウスの血流と組織の分離
    1. Transcardially が導入された胚 (胚研究) の場合、または標準手順6,7によると希望年齢 (例えば、生後 24 日目) で生まれた導入されたパブを運ぶ妊娠マウスを灌流します。 11,12,13,14,15,16,17, 腹腔内ターミナル ナトリウム ペントバルビ タールを使用して麻酔 (体重の 200 mg/kg)。
    2. マウス transcardially を注入マウスを吹き込む 26 G、針と、固定の前に 1 を使用して (500 U)、ヘパリン溶液を 10 ml、体内から血液を洗い流すし、30 ml 40 ° C prewarmed Mugnaini の transcardially を灌流する PBS の transcardially固定の解決。
      注:成体マウスの腹部大動脈14経由で代替の逆行性血流を実行します。
    3. 興味 (全脳や脊髄など) の灌流の組織を分離し、4 ° C で 24 時間の別の Mugnaini の固定の解決の少なくとも 10 mL で組織を置
    4. 室温で 3 h の 10 mL の PBS で組織を洗浄します。
  3. アガロース、およびドキュメントに埋め込み、セクショニング
    1. 再現性のある断面角度8,9,10特別なフレームの分離組織 (例えば、全脳) を調整します。また、調節可能な切削厚、vibratome を使用します。
    2. フレームに神経組織を配置、telemacrography のための組織を調整し、座標を文書化します。
    3. 3% 低融点アガロース埋め込みメディアの準備: agarose の 3 g を 100 mL のデニスソレンセンのバッファーの追加し、90 ° C の水浴中で混合物を熱
    4. 組織を含む枠の 3% の agarose (30 ° C) を注ぐ。暖かい金属ブロックとフレームをカバーし、それが硬化するまで待ちます。硬化中に埋め込まれた組織とその座標フレーム内のイメージを telemacrographic デバイスを使用します。
    5. 最初のフレームの座標に対応する切削ギャップのあるフレームに agarose 埋め込まれたティッシュを転送します。
    6. 薄いと振動のかみそりの刃を備えたデバイスで所望の厚さ (例えば、1.5 mm) のセクションに埋め込まれた組織を削減 (材料の表を参照してください)。
      注:かみそりの刃の滑走を改善するために埋め込まれた組織にグリセリン数滴を滴下します。
    7. PBS で各切片を画像フォルダーに画像を収集しています。

3. 分離組織の透過電子顕微鏡用の準備

注:フードの下で動揺のプラットホームのしっかりと開閉蓋とガラス皿で培養の以降のすべての手順を実行します。

  1. PBS で 2 x 30 分間ティッシュ セクションを洗います。室温で 2 時間 2% 水溶液四酸化オスミウム ソリューション (OsO4) のセクションを孵化させなさい。
    注意:四酸化オスミウムは有毒、皮膚接触すると有害のおそれ。
  2. PBS で 2 × 30 分の osmicated セクションを洗います。
  3. 10-15 分の室温で 30%、50%、70% エタノールでセクションを孵化させなさい (オプション: 4 ° C で 70% エタノールで一晩インキュベート)。
  4. LED RGB 光8,9,10 (2 x 15 W) 70% エタノールで osmicated の標本は、45 ° の角度で左右からサンプルに適用するイメージ。散乱とイルミネーションの中に、光の反射を最小限に抑えるため黒い皿および鈍い黒の背景を使用します。
    注意:イメージ投射の間を乾燥させるセクションを許さない。
  5. シリーズ フォルダー内の画像を収集することにより、座標を持つセクション画像のアトラスを作成します。
  6. 100% エタノール (30 分の 2 倍)、室温で 100% のプロピレンの酸化物 (30 分の 2 倍) に標本を孵化させなさい。
    注意:セクションにソリューションを変えながら乾くようにしてください。
  7. ドデセニルこはく酸ガラス容器内の 240 mL と優しくガラス棒で攪拌しながら 260 mL の樹脂を混ぜます。不均質性、泡と汚れを定期的にチェックします。非常に優しく、少なくとも 45 分手でかき混ぜます。
  8. 1:2 と 1:1 の比率で樹脂/プロピレンの酸化物を準備し、3% アクセラレータ (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol) を追加.
  9. 1:2 のステップ 3.8 2 h し 1:1 の埋め込みソリューションのステップ 3.8 から 2 時間室温で回転ホイール上からソリューションを埋め込み組織を孵化させなさい。
  10. フラット ポリプロピレン皿にティッシュを置き、ティッシュをかぶせて 3% アクセラレータを含む新鮮な樹脂と 12-24 時間の 65-85 ° C で埋め込まれた組織を治します。
  11. 埋め込まれた組織を室温に冷却し、ポリプロピレンの料理から樹脂包埋標本を削除します。

4. 定量分析のための超微細構造の神経可塑性パラメーターの選択

  1. 関心のある領域のマッピング
    1. (例えば、海馬や小脳) 関心の領域を選択し、このエリアを含むアトラス (ステップ 3.5) からイメージを選択してセクション アトラス地区をローカライズします。
    2. 断面画像に関心のある領域の境界線をスケッチし、樹脂試料の上にこれらの地域のボーダーを見つける/スーパーイン ポーズします。
    3. スクラッチ マーク (26 G、1 で) 細針ゲージを使用して、樹脂試料 (例えば、海馬や小脳) 関心のある領域の国境。
    4. トリミング用樹脂を柔らかくしたり、また、トリミング装置、薄い刃またはサンドペーパーを使用するオーブンで 85 ° C に樹脂試験片を加熱します。
    5. かみそりの刃をもつ樹脂試料から関心のある分野を消費税 (材料の表を参照してください)。試料をマウント接着剤など (直径 8 mm) と長さ 1 cm 必要な口径のアクリル ガラスのバーを保持しています。準超薄切片とマウントされた試料をトリミングします。
    6. グリコールメタクリル (0.75 μ m) を準備し、極薄 (70 nm)、ウルトラミクロトームを使用してトリミング領域のセクション: 0.75 μ m 厚 1.5 mm/s と 70 nm 厚さ 0.7 mm/s でそれを設定。
    7. ガラス担体にグリコールメタクリル セクションを収集し、(4 分) 用 PBS で青 1% トルイジンのセクションを染色します。
    8. 何度か脱イオン水内のセクションを洗います。4 x を使用して光学顕微鏡の下でステンド グラスのセクションを調べる (0.1 ∞ の NA/-), 10 (0.22 ∞/0.17 の NA)、x 40 x (0.65 ∞/0.17 の NA)、(1.25 ∞/0.17 の NA) 目標 × 100。
    9. ニッケル グリッドの超薄切片を収集します。180 で TEM グリッドの対象 kV、3、200 x、6, 000 x および/または 8,000 倍の倍率。
  2. TEM 分析
    1. 定量的な TEM 分析 (例えば、小胞とミトコンドリアや有髄と無髄の軸索の研究) のための興味の微細構造パラメーターの選択し、これらのパラメーター未満 3 8,000 倍の倍率や 6,000 x 500 x の TEM 画像を取る。

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結果

マウスの信頼性と高速麻酔の安全な多数のパラメーターが考慮されたと麻酔ユニットの最適化されたワークスペースが十分な (図 1A) をあることを証明しました。単位は、マウスやラットなどの小動物の手術の成功に必要な精度で液体イソフルランと周囲の空気の混合を制御するために設計されています。空気とイソフルランは目的の設定によると気化器の混合し、動物 (図 1A) ボックスに、マスクを配信しました。スカベン ジャーは、収集し、安全な作業環境を提供するため、生成される任意のイソフルラン麻酔余剰ガスを不活性化します。ガスの収集し、カートリッジ (図 1A) でアクティブな石炭を通過しました。

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ディスカッション

子宮内での情報伝達の重要なステップは、注入の手順です。脳室または興味の別の領域に精密成形には、経験と実践的なスキルが必要です。シンナーのマイクロキャピ ラリー チップ以下の組織の損傷が発生します。しかし、これは射出圧力の増加を犠牲にしては。子宮内でエレクトロポレーション19,20,21,22と対照をなして子宮内で伝達後注入された胚の生存率は非常に高い。子宮角のすべての胚は、胚は子宮角の根元に位置し、子宮嚢内に再調整される必要がある場合でも注入することができます。インジェクションや分析の発達段階は、科学的な質問に合わせることができます。

脳室に注入、AAV1 粒子が全体の心室システムを介して脳脊髄液を介して配布されます。開発は、表面構造海馬と小脳を適用されたウイルス粒子5,...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、そのサポートと動物のケアのため医学部、ルール大学ボーフムで飼養施設の同僚をありがちましょう。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,4,6-トリス(ジメチル-アミノメチル)フェノールServa36975
26 G x 1'' 針Henke-Sass, Wolf GmbH
410 エアポンプ用麻酔ユニットBiomedical Instruments (Univentor)8323102
アデノ随伴ウイルス血清型 1 (AAV1)UKE (Viral Core Facility)-AAV1の参考文献および標的領域については、https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ および以下も参照してください:Designer gene delivery vectors:分子工学および遺伝子導入強化のためのアデノ関連ウイルスベクターの進化。クォンI、シェーファーDV。Pharm Res. 2008年3月;25(3):489-99.血清型1、2、および5のウイルスカプシドでシュードタイプされた組換えAAVウイルスベクターは、中枢神経系の異なる領域に送達した後、異なる効率と細胞親和性を示します。バーガーC、Gorbatyuk OS、ベラルドMJ、Peden CS、Williams P、Zolotukhin S、Reier PJ、Mandel RJ、Muzyczka N. Mol。2004年8月;10(2):302-17.自己相補型組換えアデノ随伴ウイルス(scAAV)ベクターは、DNA合成とは無関係に効率的な形質導入を促進します。マッカーティDM、モナハンPE、サムルスキーRJ。ジーン・サー。2001年8月;8(16):1248-54。
アガローSigma-AldrichA9414低ゲル化アガロー
エアポンプバイオメディカル機器 (Univentor)Eheim 100
AralditeCIBA-GEIGY23857.9の埋め込み用
樹脂 チューンアセンブリSigma-AldrichA5177-5EA
呼吸マスク マウス陽極酸化アルミニウムバイオメディカル機器 (Univentor)-
ブプレノルフィンテムゲシックアンプル鎮痛剤
毛細血管科学-製品GB100TF-10、フィラメントド
デセニルコハク酸無水物フルーカ44160
デュモンピンセット(#3、12 cm、ストレート、0.2 x 0.12 mm)FST11203-23
電気シェーバーフィリップス-
エチコン縫合糸(エチロン、6-0および3-0)エチコンポリアミド
眼潤滑剤Bepanthene-Fast
GreenSigma-AldrichF7252注入された液体の視覚化用
ガスルーティングスイッチ 4/2コネクタバイオメディカルインスツルメンツ(Univentor)8433020
ハルステッドモスキート止血鉗子(12.5cm、ストレート)FST13011-12
ヘパリン-ナトリウム比薬25 000 I.E./5 mL
マウス用誘導ボックス
水平移動蓋付き.
内寸LxBxH:155 mm x 115 mm x 130 mm.
壁の厚さ:6 mm		生物医学器具(ユニベントール)-
虹彩鉗子(10 cm、湾曲、鋸歯状)FST14007-14
虹彩はさみ(11 cm、ストレート、炭化タングステン)FST14501-14
イソフルランOP Tisch、電気加熱、sm
外形寸法:257mm x 110 mm x 18 mm.
加熱エリア:190 mm x 90 mm
呼吸マスクが<下向きに逃げる除去
>		メディカル機器(ユニベントール)-
イソフルラン(アタネ)JDメディカル吸入麻酔
LED RGBライトカメオCLQS15RGBWLED 2 x 15 W
光学顕微鏡 ベーシックDM Eライカ-4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) 対物レンズ
マイクロピペットプーラーScience-ProductsP-97
モスキート止血鉗子 (12.5cm、湾曲)FST13010-12
ニッケルグリッド、200メッシュテッドペラ1GC200
オスミウム(VIII)-オキシドデグサ73219
プロピレンオキシドフルーカ82320
カミソリの刃シック87-10489
トバルビタールナトリウム(ナーコレン)メリアルGmbH-
TC01mR 1-Channal温度調節器フィードバック付きBiomedical Instruments (Univentor)-
Technovit 4004 2 成分接着剤Kulzer
Telemacrodeviceキヤノン-キヤノン Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM 対物レンズ, 延長 150 mm, 手動延長チューブ 7 mm リング, 14 mm リング, 28 mm リング, マクロリバース リング (58 mm), キヤノン コピー スタンド.
サーモプーラーP-97ッターインスツルメンツ-
薄い振動カミソリブレードデバイスKrup-Szabo薄いブレードトル
イジンブルーシグマ-Aldrich89640
型電子顕微鏡C20フィリップス-最大200kV
Tygon 6/4 すべての部品を接続するためのチューブ材料
外径:6 mm
内径:4 mm
Wa
ll 厚さ:1 mm		Biomedical Instruments (Univentor)-
Ultracut EReichert-Jung-ultramicrotome
Univentor ScavengerBiomedical Instruments (Univentor)8338001
Vannas はさみ (8 cm、ストレート)FST15009-08
ス ス 組織吸引器 バイオペンサ透過

参考文献

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