この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。
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この記事について
サマリー
要約
モデル生物C.エレガンスは、生体内カルシウムイメージングを行うための優れたシステムを提供します。その透明なボディおよび遺伝的な操作性は遺伝的にコードされたカルシウムセンサーの標的化された発現を可能にする。このプロトコルは、標的細胞におけるカルシウムダイナミクス、特にワームの体壁筋の生体内イメージングに対するこれらのセンサの使用を概説する。シナプス前チャネルロドプシンの共発現を利用することにより、興奮性運動ニューロンからのアセチルコリン放出の刺激は、青色光パルスを用いて誘導され、細胞質カルシウムの筋肉脱分極および再現性の変化をもたらすレベル。2 つのワーム固定化手法は、さまざまなレベルの難易度で説明されています。これらの技術の比較は、両方のアプローチが神経筋接合部の生理学を維持し、カルシウム過渡の再現可能な定量を可能にすることを示しています。光遺伝学と機能性カルシウムイメージングを組み合わせることで、後代カルシウム取り扱いと恒常性の変化を様々な変異型の背景で評価することができます。提示されたデータは、固定化技術の両方を検証し、具体的には、C.エレガンスサルコ(endo)プラスミック網状カルシウムATPaseと体壁筋カルシウム調節におけるカルシウム活性化BKカリウムチャネルの役割を調べます。
概要
本論文では,光遺伝学的神経刺激を用いたC.エレガンス体壁筋の生体内カルシウムイメージングの方法を紹介する.遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を青色光で発現した筋肉を組み合わせ、神経脱分極を引き起こし、誘発されたシナプスカルシウム過渡を明確に観察するシステムを提供する。これは電気刺激の使用を避け、後のカルシウムダイナミクスに影響を与える変異体の非侵襲的な分析を可能にする。
GCaMPのような単一蛍光性GECは、そのN末端端部でミオシン軽鎖キナーゼのM13ドメインに融合した単一の蛍光タンパク質分子を使用し、C末端ではカルモジュリン(CaM)を使用する。カルシウム結合時に、カルシウムに対して高い親和性を有するCaMドメインは、蛍光強度1の増加につながる蛍光タンパク質のその後の立体構造変化を誘発する立体構造変化を受ける。GCaMP蛍光は488nmで励起され、473nmの同様の励起波長を有するチャネルロドプシンと組み合わせて使用することは不適当である。したがって、カルシウム測定値とチャネロドプシン刺激を組み合わせるには、GCaMPの緑色蛍光タンパク質を赤色蛍光タンパク質mRuby(RCaMP)に置き換える必要があります。RCaMPを発現した筋肉を用いて、チャネルロドプシンのコリン作動性運動ニューロン発現と組み合わせて、同じ動物内で光遺伝学と機能イメージングを同時に使用するワ....
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プロトコル
1. 顕微鏡セットアップ
- 蛍光機能を備えた複合顕微鏡を使用します。本研究では、励起用のLEDを装着した直立顕微鏡(材料の表)でデータを収集した。
- 体壁筋の蛍光変化を適切に可視化するためには、高倍率の目的を使用します。
- 解剖された調製物には、60x NA 1.0水浸漬目的(材料表)を使用してください。
- ナノビーズを用いる調製物には、60x NA 1.4オイル浸漬目的(材料表)を使用してください。この倍率はカメラセンサーの筋肉の十分な決断を保障する。
- 顕微鏡に取り付けられた高感度カメラを使用して、高フレームレートで画像をキャプチャし、カルシウムレベルの急激な変化を追跡します。本研究では、Ca2+信号の立ち上がり時間が数十ミリ秒と同じくらい速くなるように、100 Hzでフルフレームイメージングが可能なsCMOSシステム(材料表)を用いた画像を用いた画像を用いた。
- メーカーの指示に従ってImageJ10で実行されているマイクロマネージャソフトウェアでカメラの取得とLED蛍光励起を制御します(材料の表)。
- 外部オープンソースマイクロコントローラボ....
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結果
この技術は、カルシウムの取り扱いや筋肉の脱分極に影響すると考えられている変異体の変化を評価した。ベースライン蛍光レベルおよび蛍光過渡を可視化し、筋肉内の細胞質カルシウムおよびカルシウム動態を休止して評価した。動物は、少なくとも3日間全トランス形直結で成長し、その後、チャネルロドプシンを活性化することが重要である(図2A)。動物が全トランス・レチナルにさらされていない場合、筋肉カルシウム過渡は引き起こされない(図2B)。これらの動物は、ベースライン細胞細胞性カルシウムレベルを評価するためにまだ使用することができますが、カルシウムの動的な変化は捕捉されません。さらに、動物または解剖の健康のための内部制御として、動物は青色光刺激後に収縮する。固定化にナノビーズを使用する場合、ワームの体の総運動を最小限に抑える筋肉収縮を伴う記録がデータ収集のために選択された。生蛍光値を収集するために使用される筋.......
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ディスカッション
GECはC.エレガンス神経生物学の強力なツールです。これまでの研究では、カルシウムイメージング技術を用いて、感覚反応や行動反応など、ニューロンと筋肉細胞の両方で多種多様な機能を調べ、様々な刺激方法を用いた。いくつかの研究は、感覚ASHニューロン22、23、または咽頭筋肉24でカルシウム波を誘導するために化学刺激を使用しています。別のグループは、ワームがマイクロ流体チップに保持されている間に機械的刺激を利用し、タッチ受容体ニューロン25におけるカルシウム応答を調べた。それでも、他の人は、ニューロン26と体壁筋肉27のカルシウム変化を可視化するために電気刺激を採用している。これらの研究の間で一般的なのは、カルシウム過渡を引き起こすソリューションや機器などの外部刺激の要件です。ここで概説されるプロトコルは、神経特異性を提.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
著者らは、ZX1659のアレクサンダー・ゴッチョルク博士、ワーム株を含むRCaMPとチャネルロドプシン、slo-1(例えば142)ワーム株のホンギョン・キム博士、およびsca-1(tm5339)ワーム株の国家生物資源プロジェクトに感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| all-trans 網膜 | Sigma-Aldrich | R2500 | チャネルの励起に必要 ロドプシン |
| 琥珀色LED | RCaMP照明 | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | 蛍光照明を制御 |
| 青色LED | チャネルロドプシン照明 | ||
| BX51WI顕微鏡 | オリンパス | 固定状態の化合物顕微鏡 | |
| 電流制御 低ノイズ リニア電源 | Ametek | Sorenson | 制御 LED強度 |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | グラフ作成ソフトウェア |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | 画像処理ソフトウェア |
| LUMFLN 60x 水 NA 1.4 | オリンパス | 水浸し 目的解剖準備 | |
| Master-8 刺激装置 | A.M.P.I | 画像取得とLED照明用マスタータイマー | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | カメラ取得とLED励起を制御します | |
| Microsoft Excel | Microsoft | スプレッドシートソフトウェア | |
| pco.edge 4.2 CMOSカメラ | pco. | 4.2 | ハイスピードカメラ |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | オリンパス | ナノビーズ調製用油浸対物レンズ | |
| ポリビーズミクロスフェア | Polysciences, Inc. | 00876-15 | ワーム固定化 |
| ソリッドステートスイッチ | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | LED照明のタイミングを制御します |
| トランスジェニックひずみ、sca-1(tm5339);[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond Lab | SY1627 | 興奮性ニューロンチャネルロドプシンおよび体壁筋RCaMPは、SERCA変異対立遺伝子 |
| トランスジェニック株、slo-1(eg142);とワームラインを発現しています。[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond Lab | 興奮性ニューロンチャネルロドプシンおよび体壁筋RCaMPは、カルシウム活性化BKカリウムチャネル変異対立遺伝子 | |
| トランスジェニック株、[zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Gottschalk Lab | ZX1659 | 興奮性神経チャネルロドプシンと体壁筋RCaMP発現ワームライン |
参考文献
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. G....
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再版と許可
