Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

Summary

枯草菌胞子の内膜で 'germinosomes' の germinant 受容体蛋白質クラスター。超解像顕微鏡と蛍光レポーターのタンパク質を使用して germinosomes を視覚化するプロトコルについて述べる。プロトコルはまた、FM4 64 膜色素で染色が優先的に胞子内膜ドメインを識別します。

Abstract

胞子のサイズが小さく、発芽蛋白質の比較的低い豊かな落射蛍光顕微鏡を用いた顕微鏡分析の難しさを引き起こします。超解像 3次元構造化照明顕微鏡法 (3 D SIM) は、このハードルを克服し、枯草菌(枯草) 胞子の発芽の過程の分子の詳細を明らかにする有望なツールです。ここでは、変更された SIMcheck (ImageJ) の使用を述べる-アシスタント 3 D イメージング プロセスと枯草胞子 germinosomes、発芽蛋白質のクラスターの SIM 顕微鏡蛍光レポーター蛋白質。FM4 64枯草胞子膜の汚損のため (スタンダード) 3 D SIM イメージング手順を提案する.これらの手順を使用して、我々 は germinosome のローカリゼーションのための卓越した解像度を得られるし、示す > 休眠胞子は胞子形成培最小限モップの後得られた枯草KGB80 の 80% ある逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の 1 つまたは 2 つ巣。明るい巣も観察した FM4 64 ステンド胞子 3 D シム画像可能性があります異なる流動性の内膜脂質ドメインが存在することを示唆しています。更なる研究の共局在を評価し、このように内部胞子膜の菌発芽蛋白質の組織の最適な概観を得るダブル レポーター蛋白質膜色素と germinosome 手順をラベリングを使用するが可能。

Introduction

注文 Bacillales と Clostridiales の胞子は休眠代謝と過酷な除染体制に非常に抵抗力があるが、彼らは発芽する、しない限り、人間¹に有害な影響を引き起こすことはできません。枯草菌(枯草) 胞子の栄養 germinant トリガー発芽、開始イベント、germinant 受容体 (GRs) 胞子の内膜 (IM) に位置する germinant のバインディングです。その後、GRs は IM にもある SpoVA チャネル蛋白質に信号を変換します。これは、結果、胞子コア ピリジン-2, 6-ジカルボン酸 (ジピコリン酸; exchange の発症DPA;胞子コア乾燥重量の 20% を構成する) SpoVA チャネル経由で水のため。その後、DPA リリース トリガー皮質ペプチドグリカン加水分解の活性化、追加吸水^2,3,4に従います。これらのイベントは、コート層、その後破断伸長の発症に機械的ストレスにつながる、そして最後に、生長します。ただし、発芽過程の分子の正確な詳細はまだ遠くから解決されています。

胞子の発芽についての主要な質問にかかわる周囲の IM SpoVA チャネル蛋白質と同様に、IM の発芽タンパク質脂質の生物物理プロパティ。この主不動 IM 脂質二分子膜は胞子コアまたは細胞細胞質^5,6で彼らの行動を出すいくつかの毒性の化学防腐剤を含む多くの小さい分子の主な関門です。IM の脂質二重膜は、モバイル IM⁵脂質の大部分はあるもののゲル状態の可能性が高いです。胞子の IM も大幅な拡大⁵の可能性があります。したがって、IM の表面積増加 1.6 追加膜の合成することがなく発芽し、この膜の特性低透磁率および脂質不動^5,6の損失と一緒に伴われます。

B. 枯草菌胞子のサイズが小さいと発芽蛋白質の比較的低い豊かさが課題を提起発芽蛋白の活性化と胞子の IM 脂質の組織の分子の詳細は学習の魅力的なテーマが、顕微鏡解析。B. 枯草菌芽胞の足場蛋白質逆流性食道炎整理ゲラ、B と K GRs のための 3 つの GR サブユニット (A、B および C) グリフィスら落射蛍光顕微鏡証拠を魅力的な発芽蛋白質に溶ける蛍光レポーターを使用して示唆しています。クラスター⁷。彼らは発芽蛋白質のこのクラスターの 'germinosome' という言葉し、~ 300 nm 大 IM タンパク質巣⁸として構造を説明しました。胞子の発芽の開始、時に巣最終的に変更に大きな蛍光 germinosome 分散蛍光パターンと > L-バリン⁸で 1 h の胞子でこのパターンを表示する胞子人口の 75% が発芽しました。上記の使用紙平均統計的検出力を得るために、イメージング中に観測された低蛍光信号のハードルを克服するための連続した蛍光画像の数十からの画像であることに注意してください。細菌の胞子のこれらの構造のこの可視化された古典的な顕微鏡ツールとも単胞子の巣量評価と技術的に実現可能なものの端になかったより詳細な局在この方法で可能です。

ここでは、詳細な可視化を取得する構造化照明顕微鏡 (SIM) の使用とその IM 脂質ドメイン⁹のと同様、枯草胞子で germinosome(s) の定量化を紹介します。プロトコルには、ImageJ^10、11,12だけでなく、胞子形成、スライドの準備および SIMcheck (v1.0、imageJ プラグイン) による画像解析手順も含まれています。

Protocol

1 B. subtillis胞子形成 (タイミング: 顕微鏡観察する前に 7 日間)。

1. 日 1
   1. ルリア ベルターニカミラ スープ (LB) 寒天培地プレート (1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、1% 食塩水, 1% 寒天)¹³に細菌培養を連勝し、シングル コロニーを取得する 37 ° C で一晩インキュベートします。B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB mCherry 猫、逆流性食道炎 gfp 菅) ひずみとその親株背景に枯草PS4150 を使用 (PS832 ΔgerE::spc、ΔcotE::tet)⁷を前述のよう。
      注:ΔcotEΔgerEの背景を持つ胞子の使用は胞子コート レイヤー⁷の自発蛍光を最小限にするために germinosome 可視化に不可欠です。
   2. すべてのメディア、チューブ、pipets、適切な方法で使用される他の文化の資料を殺菌します。
2. 日 2
   1. 早朝に 5 mL の LB 培地に単一コロニーを接種して OD₆₀₀ 0.3 から 0.4 (約 7 時間) に達するまでに 200 回転/分、37 ° C でスクリュー キャップ チューブの連続撹拌下で文化を孵化させなさい。
   2. モップ媒体 (pH 7.5) 500 ml ペットボトル 3 nM (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.4 μ M H₃を含んでいる BO₃, 30 nM CoCl₂·6H₂O, 10 nM CuSO₄·5H₂O、10 nMZnSO₄·7H₂O、1.32 ミリメートル K₂HPO₄、0.4 mM MgCl₂·6H₂O、0.276 mM K₂₄、0.01 mM FeSO₄·7H₂O、0.14 mM CaCl₂·2H₂O、80 mMモップ、4 mM 0.1 mM MnCl₂·2H₂O、トリシン 10 mM D-グルコース-一水和物、および 10 mM NH₄Cl。
   3. スクリュー キャップ チューブ 10^-1- 5 mL の LB 文化 10^-7シリアル希薄でモップの培地を準備し、一晩 200 回転/分、37 ° C で連続攪拌下で文化を孵化させなさい
      注:ここで用意されるシリアルの希薄は翌朝早い指数段階の希釈を取得を目指します。このステップと次のステップ モップ バッファー成長媒体に適応するセルを許可に必要です。
3. 日 3
   1. 0.3 0.4 の OD₆₀₀モップ希釈液のいずれかを選択します。予め温めておいた (37 ° C) モップ培地 20 mL 円錐形の 250 mL のフラスコの中に文化の 0.2 mL を接種して OD₆₀₀に達する 0.3 から 0.4 (〜 7 h) まで連続攪拌下で孵化させなさい。
   2. 1.3.1 のステップから 1% (v/v) 前培養とモップ ベース胞子形成培地 (250 mL) を接種して連続攪拌下の円錐形のリットルのフラスコで 37 ° C で 3 日間インキュベートします。FM4 64 PS4150 胞子の染色、2 μ G/ml FM4 64 プローブ (材料表参照) 胞子形成培地 1 または 2 h に OD₆₀₀値 (一般に約 2) 栄養生長のピークに達した後を追加し、許可する文化その後感受性光⁵から保護しながら。
4. 7 日目: 胞子の収穫
   1. 位相暗細胞から段階明るい胞子とおそらく成熟した胞子を区別するために、100 倍の倍率で位相差顕微鏡を使用して胞子形成収率 (胞子対栄養細胞) を決定します。90% 相明るい胞子収量が期待されます。
   2. 4,270 x g丸底遠心チューブの 4 ° C で 15 分間で胞子をペレットします。50 mL コニカル遠沈管 (材料の表を参照) で 2-3 回滅菌超純水タイプ 1 脱水 40 mL で胞子ペレットを洗浄します。4,270 × gで 15 分 (4 ° C) で洗うたびにスピンダウンします。
5. 7 日目:胞子浄化
   1. 浄化を胞子: 20% 非イオン密度勾配媒体の 750 μ L で胞子ペレットを中断 (材料の表参照) し 800 μ L の滅菌マイクロ遠心チューブ用で 50% 非イオン密度勾配媒体に読み込みます。21,500 x gで 60 分間遠心します。得られたペレットには、無料の胞子が含まれています。20% 非イオン密度勾配媒体を 200 μ l 添加の胞子ペレットを中断し、1 mL 遠心チューブで 21,500 × gで 15 分遠心分離 50% 非イオン密度勾配媒体の上にロードします。
   2. 最終的な胞子準備・洗浄: 得られたペレットには精製の休眠胞子が含まれています。洗浄滅菌超純水タイプ 1 の 1.5 mL で 2-3 回胞子ペレット (材料の表を参照) を水と 4 ° C で 15 分間 9,560 x gで間にスピン ・ ダウン最後に、約 30 の最終の OD₆₀₀滅菌超純水タイプ 1 水でペレットを中断します。胞子の因数は、8 週間¹⁴-80 ° C で保存できます。

2. decoating

1. PS4150 胞子を扱うと 0.1 M 塩化ナトリウム/0.1 M NaOH/1% ナトリウム dodecyl 硫酸 (SDS)/1 h. の 70 ° C で 0.1 M ジチオトレイトール (DTT) 洗浄滅菌超純水水タイプ 1^15,16で 10 倍胞子。これによりいずれかは胞子の外膜で FM4 64 プローブを吸着し、外側の層が削除されます。

3. Coverslip とスライド準備¹¹ (タイミング: 観察する前に 1 H)

1. クリーン前高精度 coverslips は、優しく揺れ水浴中で 30 分間 1 M HCl で (材料の表を参照)。超純水の種類 1 水で 2 回 coverslips を洗浄し、100% (巻/巻) 江藤に保存します。乾燥し、使用する前に彼らの明快さを確認しましょう。中古 70% でスライド ガラスをきれい江藤。乾燥し、使用する前に彼らの明快さを確認しましょう。

4. サンプリング蛍光マイクロスフィアまたは胞子遺伝子フレーム スライド¹⁰ (15 分タイミング)

1. 前 2 つ 70 %etoh 掃除を暖かいと 70 ° C 加熱ブロックでは数秒の空気の乾燥したガラス スライド (材料の表を参照)、65 μ L 1 つのガラス スライド上に 70 ° C で開催された滅菌の 2% の agarose をドロップしてアガロース b を普及する上で他のガラス スライドを配置etween スライド。アガロースのパッチは約 5 分で乾燥します。
2. ガラス スライドの 1 つを削除した後に 1 × 1 cm 断面 agarose パッチをカット サンプル (蛍光マイクロスフィアまたは 10 〜⁸/mL の胞子)、0.4 μ を追加して、パッチに coverslip を配置することによって高精度の coverslip にパッチを転送し、オフにスライド。
3. 従って完了顕微鏡用スライド、フレームのすべてのコーナーを終了、coverslip を配置先、乾燥したスライド上に遺伝子のフレーム (1.5 x 1.6 cm²、65 μ L) を修正します。

5. イメージング^11,17(タイミング: 1 H)

1. 胞子の伝送と蛍光画像だけでなく、赤の混合物をキャプチャし、構造化照明顕微鏡黄緑色のカルボン酸修飾微粒子蛍光は油客観的 (x 100 装備 (材料の表参照)開口数 = 1.49)、CCD カメラと画像解析ソフトウェア (材料の表を参照)。周囲の光の妨害することがなく室温ですべての画像を生成します。目的とイメージングの前に 75% エタノール スライド x 100 を常にきれいにすることを確認します。
2. 100 nm (直径) 蛍光マイクロスフィアに焦点を当てるし、対称の psf が得られる、画像のぶれを最小限に抑えるまで 100 x 目的の補正リングを調整することによって点拡がり関数 (psf) を最適化します。Psf は、インパルス応答またはイメージング システムの点光源または point オブジェクトへの応答。
3. 約 10 ラウンド蛍光マイクロスフィアとビューのフィールドを選択します。回折格子を適用ピント調整の両方 561 nm と画像解析ソフトウェアのためのガイドとして 488 nm 励起波の長さ。
4. 透過光で胞子を集中し、イメージごとに 200 ミリ秒のエクスポー ジャーを持つ 16 × 平均モードで透過光像をキャプチャします。
5. 照明モード読み出しモード電子乗算 (EM) 利得 10 MHz にカメラ設定「3 D シム」では、14 ビットと 175 で EM ゲインと胞子の 3D SIM raw 蛍光画像をキャプチャします。レーザー出力の 20% で 561 nm のレーザー光で PS4150 胞子で FM4 64 プローブと照明時間 400 ms を刺激します。
6. エキサイト GerKB mCherry と KGB80 で逆流性食道炎 GFP 胞子、それぞれ、561 nm レーザー光で 30% レーザー パワーで 1 s、および 488 nm レーザー光 60% で 3 s. Z スタック設定は/ステップのモードでは、0.2 μ m を下へ、7 つのステップ、germinosome の 20 の手順で電源をレーザーとIM 解析、それぞれ。
   注:これらのレーザーのパラメーターは、約 4,000 のヒストグラム ウィンドウの明るさの最大値を保証するために適用されました。

6. 3D SIM FM4-64 PS4150 の胞子を染色の Raw 画像を再構築します。

1. PS4150 胞子の生データを染色 FM4 64 N SIM スライス再構成を実行します。N-シム スライス再構成ウィンドウを開く N SIM パッド] タブ シートに再構成スライス Paramボタン クリックします。
2. N SIM スライス再構成ウィンドウで復元パラメーターを設定します。最適な再構成画像を得るため N SIM 命令の提案に従うし、照明変調コントラスト (IMC)を自動高に設定するN SIM スライス再構成ウィンドウに適切なコントロールをクリックしてください解像度ノイズ抑制 (HRNS) 1.00、焦点ぼかし抑制 (OFBS) から開始点として 0.05 〜。
3. イメージを再構築するN SIM スライス再構成ウィンドウで再構成スライス] ボタンをクリックします。高速フーリエ変換 (FFT) 画像と復興¹²後表示復興のスコアによる再構成画像の品質を評価します。
4. 0.10 からHRNSを調整 5.00 そしてのOFBSには 0.01 から 0.50 によって最適なパラメーター設定が得られるまでN SIM スライス再構成ウィンドウ内の適切なコントロールをクリックします。
5. 変更されたパラメーターを適用するN SIM スライス再構築] ウィンドウで [適用] ボタンをクリックします。ウィンドウを閉じるに [閉じる] ボタンをクリックします。
6. [FM4-64 ステンド PS4150 の胞子の raw 画像のアクティブなN SIM パッド] タブ シートのスライスの再構築ボタンをクリックしてスライス再構成を実行するを確認します。再構築された画像を保存します。

7. 画像解析

1. KGB80 germinosome の擬似広視野画像を変換します。
   1. ImageJ プラグインSIMcheckユーティリティRaw データ SI 擬似広視野¹²左クリックでアクティブにして擬似広視野画像に 3 D SIM KGB80 の raw 画像を変換します。擬似広視野生 SIM データから画像の平均値し、の比較のため、従来の広視野照明¹²と同等のイメージを組み立てます。ImageJ 自体は、https://imagej.net/Welcome を参照してください。蛍光の擬似広視野画像で後で germinosome 分析の各逆透過像の ~ 25 胞子がランダムに選択します。
   2. 2 枚のスライドからの眺めの 14 のフィールド (この例では、346) の合計約 350 KGB80 胞子で選択します。選択した KGB80 の胞子の逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry 蛍光巣番号は、2 つの研究者によって独立してカウント必要があります。研究者胞子で別蛍光 germinosome 巣の存在を疑うときは常に 3 D SIM の raw 画像を参照できます。
   3. 各逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry フォーカスの最大強度と ImageJ で各 KGB80 胞子の 3 D 画像の強度を評価します。
2. KGB80 germinosome の擬似広視野画像を分析します。
   1. KGB80 胞子の統合された信号強度として 7 スタックの平均強度値を使用します。同一の設定を使用してバック グラウンドひずみ PS4150 イメージングによるバック グラウンド強度を決定します。背景と明確に区別している場合 germinosome 巣として個々 の KGB80 の胞子の輝点を考えてください。
   2. ソフトウェアの起源 9.0 と意義を決定するため一方通行 ANOVA テストを適用します。P 値を考慮した < 0.05 として統計的に重要な。スピアマンの順位相関係数¹⁸を使用して、逆流性食道炎 GFP と GerKB mCherry の巣数の相関は、信号強度の測定を評価します。

Results

現在のプロトコルは細菌の胞子の SIM 顕微鏡イメージング手順を示します。胞子形成とスライドの準備手順は、イメージングの前に図 1に示すように、行われました。イメージングおよび分析手順が適用された後で、両方の点心 (発芽タンパク質を標識蛍光タンパク質) と明るい (脂溶性プローブ染色 IM) 胞子サンプル次のテキストのよう。

B. 枯草菌芽胞の germinosomes の局在

逆流性食道炎と GerKB のレベルは、胞子、あたり 3,500 〜 と 〜 700 の分子が、それぞれに報告された豊富な胞子形成培地¹⁹の準備の胞子からの抽出物の西部のしみの分析に基づきます。KGB...

Discussion

提示されたプロトコルには、FM4-64 B. 枯草菌芽胞をステンド胞子形成、スライドの準備、画像形成プロセスの解析のための標準 3D SIM プロシージャが含まれています。さらに、プロトコルが変更された SIMcheck (ImageJ) について説明します-3 D イメージング蛍光レポーターの付いた菌胞子 germinosomes の SIM 顕微鏡のためのプロセスを支援します。後者の手順では、拡張されたコントラストと薄暗いこの部分構造を観察することができました。2 つの画像処理手順を結合することによって発芽過程のメカニズムの理解のための私達の基礎を向上させる、同じ SIM 顕微鏡と同じ胞子の離散構造を可視化することが可能です。〜 100 の水平解像度で動作する手順メモ nm と 200 〜 250 の軸解像度 nm。これは、グリフィス⁷で使用される差動干渉の対照 (DIC) 広視野顕微鏡のアプローチよりも優れています。時間分解 germinosome 発芽の開始時に外観の解析目的次のステップになります。残念ながら、SIM 顕微鏡は、原則として互換性ラ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
空気乾燥ガラススライドMenzel	Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× 油対物レンズ (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, & デルタ;cotE::tet)
Erlenmeyer フラスコ 1 L	Sigma-Aldrich	Z567868
Erlenmeyer フラスコ 250 mL	Sigma-Aldrich	Z723088
FluoSpheres カルボン酸修飾マイクロスフェア	Invitrogen, 0.1 μm	F8803
FM4-64	サーモフィッシャーサイエンティフィック	F34653
Histodenz nonionic density gradient medium	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
LB Agar	Sigma-Aldrich	L2897
マイクロチューブ 1.5 mL	サーモフィッシャーサイエンティフィ	3451PK
顕微鏡イメージングソフトウェア	ニコン	NIS-Element AR 4.51.01
ミリQ 超高純度デミネリル水	ミリポア	ミリキューム IQ 7003
ニコン エクリプス Ti 顕微鏡
ポリプロピレン スクリューキャップ ボトル 180 mL	サーモフィッシャーサイエンティフィ	75003800
精密カバースリップ	Paul Marienfeld	117650
丸底チューブ 15 mL	サーモフィッシャー サイエンティフィック		Nunc TM
スクリューキャップチューブ 50 mL	サーモフィッシャーサイエンティフィック		Nunc TM