方法論記事

組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

DOI：

10.3791/59460

⸱

2019年3月30日

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1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

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サマリー

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miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA 治療細胞周期と血管新生を阻止の活動を識別するために使用されます。

要約

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肺がん (LC) は、世界中の癌関連死亡の主要な原因です。他の癌細胞と同様に、液晶セルの基本的な特徴は、無秩序な増殖と細胞分裂です。細胞周期の進行の停止によって増殖抑制は、LC を含むがん治療の有望なアプローチをする示されています。

miRNA 治療重要な転写後遺伝子調節因子として浮上しているし、ますますがん治療で使用するために検討されています。近作では、ミール 143 とミール-506、細胞周期の進行を調節する 2 つの Mirna を利用しました。A549 非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞をトランスフェクションした、遺伝子発現を解析していた、治療によるアポトーシスの活動を最後に行った。サイクリン依存性キナーゼ (Cdk) のダウンレギュレーションが検出された (すなわち、CDK1、CDK4、CDK6) 細胞周期を G1 ・ S ・ G2/M 相転移で停止し、。経路分析では、潜在的な抗血管新生治療のアプローチを多面的な活動に寄与する活動を示した。ここでは、血管新生の阻害によって細胞周期抑制、アポトーシスの誘導、治療の血管内皮細胞に対する影響についての miRNA の活動を識別するために使用する方法論が説明されます。ここに提示されたメソッドが miRNA 治療と対応するアクティビティに関する今後の研究をサポートすることと、代表的なデータが解析中に他の研究者を導くことが望まれます。

概要

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細胞周期は DNA ・細胞増殖分裂プロセス1の重複を許可する複数の規制イベントの組み合わせです。サイクリン依存性キナーゼ (Cdk) を調節する細胞周期2を推進しています。その中で、分裂 CDK (CDK1) と中間期 Cdk (CDK2、CDK4, CDK6) 細胞周期進行3で極めて重要な役割があります。網膜芽細胞腫タンパク質 (Rb) は、CDK4/CDK6 複雑な細胞周期進行4を許可するによりリン酸化され、CDK1 活性化5正常な細胞分裂に不可欠です。多数の CDK 阻害剤を開発し、がん治療における Cdk をターゲットの可能性を示す最後の数十年間、臨床試験で評価。乳癌の治療のため 3 CDK 阻害剤が承認されている実際には、最近6,7,8、の9,10。したがって、Cdk、とくに CDK1 と CDK4/6 は癌細胞の進行を調節するのには大きな関心と。

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プロトコル

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1. ミール 143 とミール 506 トランスフェクション

注意: は、記述されている実験の実行中、ラテックス手袋、保護眼鏡、および実験室のコートを使用します。必要な場合は、キャビネットのファンに気道をブロックまたは層流気流を乱すことがなく、安全キャビネットを使用します。製造元によって説明するよう常に適切な高さに保護ガラス ウィンドウを設定します。

  1. 種子、T25 cm2フラスコ/6/96 ウェル プレート DMEM/F12K メディアの非小細胞肺癌 A549 細胞 10 %fbs と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (培地) ティッシュ文化フードを補充し、37 ° C 5% CO2組織文化のインキュベーターで一晩インキュベートします。
  2. ミール 143 および/またはミール 506 mimics を中断またはエージェントの株と siRNA をスクランブル (株エージェントの 14 μ L で混合されたミールの 2.4 μ g;材料の表を参照してください) トランスフェクション メディアと 1.5 mL の血清、抗生物質フリーの 500 μ L に DMEM/F12K メディアで、最終的なマイクロ Rna 濃度 100 nM。マイクロ Rna 量は、さまざまな細胞や濃度の最適化を必要があります。適切なアプローチは、興味の遺伝子の発現のダウンレギュレーション....

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結果

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RT qPCR とゲル電気泳動による遺伝子発現解析

Rt-qpcr を用いた差動遺伝子発現解析は、CDK1、CDK4, CDK6 ターゲット遺伝子の重要な低下を示した。CDK1 と CDK4/6 それぞれ G2 と G1/S 遷移のため尽力することが示されました。実行の分析は、個々 miRs と組合せミール活動間の直接比較を許可しました。スクランブル siRNA のプロシージャからの干渉の評価を許可 transfecting エージェントでの使用は、最小限だった遺伝子のダウンレギュレーションを検出しました。データを統計的に 2 尾スチューデントのtを使用して行った-テスト、およびp < 0.05 は、統計的に有意な (図 1) と考えられていた。QPCR、前にプライマー シーケンスが評価されたプライマー ブラストを使用.......

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ディスカッション

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Mirna の発現レベルの破綻を認識し、がん治療の標的治療として動作正常組織対病気にかかった。この研究の目的は潜在的に複数の段階の細胞周期の進行を止める Mirna を決定します。ミール 143 とミール 506 がこの組合せ miRNA 治療の活動を理解することを目的と示されたプロトコルや、がん細胞の細胞周期を停止が確認されました。

説明の方法論は、Mirna の機能の包括的な理解を提供します。Mirna を研究の課題は、複数の遺伝子をターゲットし、したがって複数の経路に影響を与える能力に関連付けられています。具体的な目標は、治療前に指定されている場合、説明 qPCR 分析は興味の特定の遺伝子の表現の識別を許します。たとえば、ここでの主な焦点 CDK1 と CDK4/6 と細胞周期の表現であった。

したがって、propidium ヨウ化と流れ cytometry のプロトコルを用いた細胞周期解析は細胞周期の段階に従って細胞数の変化を検出するための信頼性の高い方法です。このメソッドは pi で細胞周期の段階に対応する DNA .......

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開示事項

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著者らは RNA シーケンス データとテキサス大学南西医療センター、マクダーモット センター次世代シーケンシング コアのためのパスウェイ解析に彼の援助のためのルイジアナ州立大学ジョン Caskey を認識したいです。RNA シーケンスとデータ分析を実行します。この研究は、薬学の大学、ルイジアナ大学モンロー立ち上げ資金のため、国立機関の健康 (NIH) 国立研究所の一般的な医療科学助成金 5 P20 GM103424-15、3 P20 GM103424 15S1 をによって支えられました。

謝辞

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利害の対立が宣言されていません。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
-80度;C フリーザーVWRVWR40086A
96ウェルプレートセルトリート サイエンティフィック 50-607-511
96ウェルマイクロウェルプレート  Thermo Scientific12-556-008
A549 非小細胞肺がん細胞ATCCATCC CCL-185
アガロースVWR0710-25G
アジレント 2100 バイオアナライザーアジレント テクノロジーズ G2938c
アンビオン サイレンサー ネガティブ コントロール No. 1 siRNAアンビオンAM4611
抗生物質-抗真菌剤溶液 (100x)Gibco15240-062  
抗体アレイアッセイキット 2反応Full Moon BioKAS02
明視野顕微鏡  マイクロスコプティクス IV-900
明視野顕微鏡  New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 SlidesFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceSteps 5.14; 6.13: 細胞周期の段階および分析のための集団分布の計算に使用アポトーシス 
CFX96 リアルタイムシステムBioRadCFX96 光学モジュール
Chemidoc タッチイメージングシステムBioRadChemidoc タッチイメージングシステム
CO2 インキュベーターThermo ScientificHERAcell 150i
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixTrevigen3433-010-01
デジタルカメラAmScope FMA050
DMEM 4.5 g/L グルコース、ピルビン酸ナトリウムなし、L-グルタミンVWRVWRL0100-0500
DNAse IZymo ResearchE1010
内皮細胞増殖サプリメント (ECGS)BD Biosciences356006
Eppendorf Pipette Pick-A-Pack SetsEppendrof05-403-152
エタノール、絶対 (200 プルーフ)、分子生物学グレード、 Fisher BioReagentsBP2818500
Ethidium bromideAlfa acarL07462
F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, CorningCorning45000-354
FACS Calibur FlowcytometerBecton Dickinson
Fetal Bovine Serum - PremiumAntlanta BiologicalsS11150
Fetalウシ血清 (FBS)フィッシャーサイエンティフィック10438026
フィッシャーブランド Basix マイクロ遠心チューブ 標準スナップキャップ付きフィッシャーブランド Basix02-682-002
Forma シリーズ II ウォータージャケット CO2 インキュベーターThermo Scientific
ヘパリン溶液 (5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
Horixontal 電気泳動システムベンチトップラボシステムBT102
has-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
has-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)Thermo ScientificPHC9394  
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)個々のドナーIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenResults: Used for bioinformatics pathway analysis
Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10-977-015
リポフェクタミン 2000年 Invitrogen11-668-027
ローディング染料 10Xward's science+470024-814
Medium M199 (with Earle′塩、L-グルタミン、重曹)Sigma AldrichM4530
顕微鏡デジタルカメラAmScope MU130
Modfit LTVerity ソフトウェアステップ 5.15: 細胞周期の集団分布
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
ペニシリン-ストレプトマイシン 10/10Antlanta BiologicalsB21210
Power UPsybrの緑のマスターミックス応用バイオシステムズA25780
ヨウ化プロピジウムMP バイオケミカルズLLCIC19545825
Proscanarray HTマイクロアレイスキャナーパーキンエルマーASCNPHRG.励起レーザー波長は543nmで使用しました。
q PCR 光学接着カバーApplied Biosystems4360954
Quick-RNA KitsZymo ResearchR1055
リボヌクレアーゼA ウシ膵臓由来SigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerステップ 7.33: マイクロアレイ解析ソフトウェア
ShakerThermo Scientific2314
SimpliAmp サーマルサイクラーApplied Biosystems
SpectraTube 遠心分離管 15mlVWR470224-998
SpectraTube 遠心分離管 50mlVWR470225-004
TBS バッファー、20x 液体VWR10791-796
温度制御  遠心分離Thermo ScientificST16R
温度制御されたマイクロ遠心分離機Eppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite 細胞培養処理フラスコThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96 ウェルフルスカートプレートThermo ScientificAB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA 合成キット(100 回分)Thermo ScientificAB1453B
Ultra Low Range DNA LadderInvitrogen10597012
VWR 標準固体ドアラボ用冷蔵庫VWR
を解析するための代替ソフトウェア機

参考文献

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  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M.

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訂正

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

タグ

miRNAqPCRRNA

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