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方法論記事

マウス乳腺へのクレオンゲンデノウイルスの誘導注射による乳癌のモデル化

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DOI:

10.3791/59502

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2019年6月7日

 ,  , 
1Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

このプロトコルの目的は、マウス乳腺へのクレ発現アデノウイルスの誘導注射に基づく新しい乳癌モデリングアプローチを記述することです。このアプローチにより、細胞型と臓器特異的の両方の発生イベントを一時的に制御した方法で操作できます。

要約

乳癌は不均一な疾患であり、起源の異なる細胞と発癌性イベントとの複雑な相互作用に起因する可能性がある。マウス モデルは、これらの複雑なプロセスに関する洞察を得るのに役立ちます。多くのマウスモデルは、乳房腫瘍形成に対する様々な発生性イベントおよび起源の細胞の寄与を研究するために開発されているが、これらのモデルはしばしば細胞型または器官特異的ではないか、または乳腺腫瘍形成の開始を誘導することができない一時的に制御された方法。ここでは、マウス乳腺(MG)へのクレ発現アデノウイルス(Ad-Cre)の誘導注射に基づいて新しいタイプの乳癌マウスモデルを生成するプロトコルについて説明する。乳管にAd-Creを直接注入するため、このアプローチはMG特異的であり、他の臓器に望ましくない癌誘導を行う必要はありません。誘導注射手順は、MG発症の異なる段階でマウスで行うことができる(したがって、癌誘導の時間的制御を可能にし、〜3〜4週間の年齢から始まる)。細胞型特異性は、異なる細胞型特異的プロモーターを使用してアデノウイルスベクター中のCre発現を駆動することによって達成することができる。我々は、明るさおよび基底乳質上皮細胞(MEC)が、それぞれケラチン8またはケラチン5プロモーターの制御下でAd-Creの誘導注射を介してCre/loxPベースの遺伝子操作を厳密に標的化できることを示した。条件付きCreレポーター(例えば、Cre/loxP誘導性Rosa26-YFPレポーター)を組み込むことにより、Ad-Creを標的とするMECおよびそれらに由来する腫瘍細胞を、誘導注射後のレポーター陽性細胞に従って追跡できることを示す。

概要

この方法の全体的な目標は、マウスMGへのAd-Creの誘導注射に基づく新しい乳癌モデリングアプローチを開発することです。Cre/loxP組み換えベースの遺伝的アプローチは、マウスのヒト乳癌のモデル化に広く使用されている。Cre/loxPベースの乳癌マウスモデルの第1世代は、MEC特異的プロモーターの制御下でCre発現トランスジェニックマウスを使用して生成される(例えば、明るさMECおよび基底MECの一部のMMTV-Creおよび基底MECの一部、Wap-Creおよび明面前駆体および肺胞の明面MECのためのBlg-Cre、基底および発光MECの一部のためのK14-Cre1、2、3、4、5)6、 7,8,9.しかし、これらのCreトランスジェニックラインは、Cre発現の空間制御を可能にする一方で(すなわち、MECの異なるサブセットで)、Cre発現およびCre/loxP媒介遺伝子操作の時間的制御を可能にしない。Cre/loxPベースの乳癌マウスモデルの第2世代は、誘導性Cre活性/発現アプローチ(例えば、タモキシフェンの投与時にのみCre/loxP組換えを誘導することができるCre-エストロゲン受容体融合[CreER]の使用)を利用し、その結果、これらの遺伝的ツールは、MEC(例えば、K8-CreER-およびK5-CreERベースのモデル)10、11、12の発動の空間的および時間的制御の両方を可能にする。 .乳癌マウスモデルの両方の世代において、CreまたはCreER発現を駆動するために使用されるプロモーターとして(例えば、Krt8、Krt5)も他の器官の上皮細胞において活性であり、それらは細胞型特異的であるが、臓器特異的ではない)または上皮細胞以外の細胞型(例えば、骨髄血素細胞に漏出活性を有するMMTV)において漏出発現を有し、これらのアプローチは他の臓器における望ましくない癌の発症につながる可能性がある。これらの予期しない癌が罹患したマウスで致死性を引き起こす場合、これらのマウスにおける乳癌のモデル化の本来の目的は禁止されるかもしれない(例えば、MMTV-Cre-駆動発癌事象は、造形悪性腫瘍およびマウスの早期死につながる可能性がある)、血化細胞におけるMMTVプロモーターの漏洩による)4.

ここでは、細胞型と臓器特異的な発癌事象の両方を時間的に制御された方法で可能にするマウスにおける乳癌モデリングアプローチを報告する。このアプローチは、マウスMGへのAd-Creの誘導注入に基づいています(したがって、臓器特異的です)。Cre発現は、アデノウイルスベクターに埋め込まれた異なるMEC亜集団特異的プロモーターを用いて制御することができる(例えば、発光MECの場合はKrt8、基底MECのKrt5、したがって細胞型特異性を達成する)。 MGの癌誘導は、3〜4週齢(思春期)から成人期まで、異なる年齢のマウスにAd-Creを注射することによって一時的に制御することができる。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、ブリガムと女性病院の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. フロキサンマウスの生成と維持

  1. 乳癌関連のフロックス条件ノックアウト(例えば、Trp53tm1Brn[Trp53 L/Lと呼ばれる]、Brca1 tm1Aash [Brca1L/L])または条件付きノックインマウスライン(例えば、Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)イーガン)ジャクソン研究所(JAX)またはヒトがんコンソーシアム(MMHCC)リポジトリのNCIマウスモデルから。さらに、クレ媒介の組み換えを受けるMECの追跡を容易にするために、条件付きクレレポーターラインをJAXから得ることもできます(例えば、Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos[R26Y]と呼ばれます)。
  2. R26Yホモ接合レポーターマウスを持つ品種Trp53L/Lホモ接合マウスまたはR26Yレポーターのアレルと任意の追加のフロキセ条件ノックアウトまたはノックインアレルを運ぶホモ接合マウスを持つマウスモデルは、ヘテロジゴウスF1オスおよびメスの子孫を得る。
  3. 異性菌性F1オスおよびメスマウス間交差は、各対立遺伝子に対してホモ接合性であるF2化合物雌マウス(実験マウスとして)、ならびにR26Y-のみホモ接合雌(対照マウスとして)を得た。以下に示すPCRプライマーとサイクリング条件に基づく遺伝子型F2マウスは、2つの異なるPCRチューブに2つの標準的な20 μL PCR反応(Taq 5Xマスターミックスを使用)を設定することにより、1つはR26YプライマーとTrp53 Lを持つもう1匹プライマー。すべての繁殖に成体マウス(通常、生後2~4ヶ月程度)を使用する。
    1. R26Yの場合は、3分間94°CでPCRを行い、次いで30sで94°C、30sで60°C、35サイクルで1分間72°C、続いて3分間72°C、14°Cで維持します。プライマー (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TAT;(ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC;(iii) R26YFP-3: GGA GCG GAA GAA ATG ATG.
      注: 250 bp の単一 PCR バンドはR26Yホモ接一性を示し、500 bp の単一 PCR バンドはワイルドタイプ (WT) を示し、2 つの PCR バンド(R26Y: 250 bp、 WT: 500 bp) はR26Yヘテロジゴテ (図 1A)を示します。
      Trp53Lの場合は、3分間94°C、30sで94°C、30sで60°C、35サイクルで1分間72°C、続いて3分間72°C、14°Cで維持します。プライマー (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G;(ii) p53F2-10 1R: AGC ACA タグ ギャグ GCA ギャグ AC.
      注: 370 bp の単一 PCR バンドはTrp53L/Lホモ接着を示し、288 bp の単一 PCR バンドはTrp53+/+ WT を示し、2 つの PCR バンド (WT: 288 bp、 Trp53L: 370 bp) はTrp53 L を示します。/+ヘテロジゴット (図 1B)

2. 術前の準備

  1. 手術の1日前にすべての外科用具をオートクレーブ。
  2. リン酸緩衝生理食べ物(PBS)に0.1%ブロモフェノールブルーを調製し、4°Cに保存します。0.01 M CaCl2とブロモフェノールブルーのDMEM培地中注射に使用されるAd-Creを1:10の比率で希釈します(すなわち、注射混合物)。
    注:ここで使用されるAd-Creは、アイオワ大学ウイルスベクターコアから得られたもので、株式ウイルス量付けは〜1010-1011 pfu/mLです。
  3. 雌マウスを麻酔する(ステップ1.2に記載されているF2世代、年齢3~4週齢から成人まで)イソファルラン室を用いて眼軟膏を塗布する。手順の間に、マウスが酸素中の1%-2.5%イソファランを吸入することを保証することによって、マウスを連続的に麻酔する。つま先のピンチを行うことによって、少なくとも15分ごとに麻酔の深さを確認してください。呼吸数の変化がないかマウスを注意深く監視し、必要に応じてイソファランのレベルを調整します。
  4. 外科的処置の前に5 mg/kgの用量で皮下に鎮薬としてメロキシカムを注入する。
  5. 脱毛クリームのいくつかの滴を適用することにより、乳頭の外科部位を公開します。柔らかいペーパータオルを使用して、過剰なクリームやゆるい髪を削除します。
    注: 手術を行う場所とは別の領域でこの手順を実行します。乳首の損傷を避けるためにシェービングはお勧めしません。化学脱毛剤を適時に除去するために注意してください。薬剤を長時間放置すると、皮膚に化学的な火傷を引き起こしかね
  6. 最初にヨードファーで外科部位を消毒し、続いて70%のアルコールを使用し、スクラブヨードファーの最終的な適用で終わる。ガーゼスポンジまたは綿の先端アプリケータを使用して、作業領域の中心から周辺に向かって円運動でこれを行います。サイクルを3x-4x繰り返します。

3. 誘導内注射

  1. 外科的処置を通して無菌技術を使用する。
  2. 2つの4番目の鼠径性MGの間に約1cmの長さで皮膚に切開部位を作る(図2)。皮膚フラップ(MG付き)を頭蓋管から慎重に分離し、乳管木を視覚化します。
  3. ウォッチメーカーの鉗子で乳首を注意深く保持し、マイクロ解剖はさみを使用して、近くの皮膚を切断することなく、外側の乳首を取り除きます。
  4. アドクレ注入混合物を25 μLハミルトンシリンジに33Gの金属ハブ針を貼り付けて~3~5μLの負荷をかけます。混合物に含まれる青色染料に基づいて、注射器中の注入混合物の体積を推定する。
    注:授乳中のメスのMGに注入する場合は、より小さな体積(例えば、3μL)を使用し、授乳中のメスのMGに注入する場合は、より大きな体積(例えば、10μL)を使用してください。
  5. 細かい湾曲したツイザーで皮膚フラップの端をそっと保持し、乳首にゆっくりとAd-Cre注入混合物を注入し、乳腺のダクトツリーに青色染料の広がりを監視します。管内膜の損傷を避けるために、射出速度をできるだけ低く保つ。
    注:注入された流体(含まれるブロモフェノール青色染料によって示されるように)は、間質区画に漏れることなくダクトツリー全体に広がり、ダクダクト内注入が成功したことを示す。
  6. 注入された液体の漏出を避けるために乳首から針をそっと引き出す。
  7. MGの遠位側(すなわち、乳首から離れた)または注入された乳頭の周囲の領域を調べる。なお、膨潤した青色染料(すなわち、近くの間質に拡散する色素)は、誘導内注射に成功するのではなく、乳腺脂肪パッド注射を示す。
  8. 創傷クリップで皮膚の外科的創傷(ステップ3.2から)を閉じます。

4. 術後ケア

  1. 麻酔からマウスを取り出し、回復のためにきれいなケージ内の加熱パッドに置きます。
  2. 手術後24時間、再び5mg/kgでメロキシカムを皮下投与する。
  3. 動物の一般的な状態を監視し、5日間切開部位で感染の兆候を探します。
  4. 創傷クリップは、手術後〜7〜10日後に除去される。

5. 乳腺腫瘍の発症のモニタリング

  1. 注射されたマウスを週2回触診して、乳腺腫瘍の発症の兆候を監視する。
  2. 腫瘍が触知可能になったら、毎日マウスを監視し、腫瘍のサイズ(例えば、マウスの体重の10%〜15%に達する)または腫瘍の状態(例えば、潰瘍性または壊死性)によって決定される、実験エンドポイントに達するまで腫瘍サイズを測定する。マウスの一般的な健康状態(例えば、昏睡、モリバンド)。
  3. 二酸化炭素窒息によってマウスを安楽死させ、続いて二次的方法(例えば、子宮頸部脱臼)を行う。
  4. 乳腺腫瘍組織を単離し、フローサイトメトリー、免疫蛍光、または発現プロファイリング(例えば、RNAシーケンシング[RNAseq]またはマイクロアレイによって)によってそれらを分析し、前述の12。
  5. 系統陰性細胞のゲーティングによるフローサイトメトリック解析を行う(Lin-: 系統マーカーに対して陰性CD45[ロイコサイトマーカー]、CD31[内皮細胞マーカー]、およびTER119[赤血球マーカー])を行い、腫瘍内の細胞を分析する。YFP、CD24、および CD29 の表現。

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結果

R26YおよびTrp53Lアレルの代表的な PCR ジェノタイピング結果を図 1に示します。

原則として、10個のMGすべてをダクタルインジェクション手順に従うことができるが、実際には、2つの4番目の鼠径性MGは、その容易なアクセシビリティと大きなMGサイズのために、通常、注射のために選択される(図2)。手術中は、消毒し整頓された作業領域を維持し、滅菌ツールで手順を実行することが重要です(図3)。誘導注射中に、注入混合物に青色染料(例えば、ブロモフェノール青色)を含めることは、ダクトツリー全体へのAd-Creの正常な注入の視覚化に役立ちます(図4)。乳房内注射...

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ディスカッション

MECの異なる亜集団から乳腺腫瘍を誘導するためのこのアプローチの成功は、適切な細胞型特異的プロモーター(Cre発現を駆動する)を選択するだけでなく、誘導注射手順自体にも依存する。このアプローチの背後にある考え方は、注入されたAd-Creウイルスは、内膜を持つ隠された構造であるダクトツリーに保持され、したがって、MECだけがウイルスにさらされ、Ad-Creによって感染しているということです。乳管内の内膜空間が限られているため、各MGに少量の注入混合物(すなわち~3-5 μL)を注入することが重要です。注入された体積はまた、マウスの年齢に基づいて調整されるべきである(すなわち、3〜4週齢のマウスに注入される際に、より小さな体積を使用すべきである)。注入された流体の体積が注射および限られた管内膜空間からの圧力のために過剰である場合、流体は上皮層を通して間質に「押し出される」ことがあり、間質細胞の望ましくないウイルス感染を引き起こす。

細胞型特異性は、クレクターを駆動するためにアデノウイルスベクターで使用されるプロモーターによって達成されるので、このアプローチの限界は、特定のMECサブ集団...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金R01 CA222560と国防総省ブレークスルー賞W81XWH-18-1-0037によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
33ゲージニードルハミルトン7803-05ポイントスタイル 3 鈍い
7mm 反射クリップブレインツリー サイエンティフィックRF7 CS
アデノウイルス、Ad-K5-Creアイオワ大学ウイルス ベクター コアAd5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)
アデノウイルス、Ad-K8-Creアイオワ大学ウイルス ベクター コアAd5mK8-nlsCre
アルコールフィッシャーHC800-1GAL使用中に70%に準備
ビオチン化CD31eBiosciences13-0311-85
ビオチン化CD45eBiosciences13-0451-85
ビオチン化TER119eBiosciences13-5921-85
ブロモフェノールブルーシグマ-アルドリッチB0126-25G
CD24-AF-700BD Pharmingen564237
CD24-PEeBiosciences12-0242-83
CD29-APCeBiosciences17-0291-82
CD29-PEeBiosciences12-0291-82
ヘアリムーバー ローションナイア9 オン
ハミルトン シリンジハミルトン7636-010.025 mL
ヨードフォアベタジン10%ポビドンヨード
イソフルランバクスターNDC 10019-360-401-2.5%
ロキシカムノーブルックNDC 55529-040-105 mg / ml
潤滑剤眼軟膏AkornNDC 17478-062-35
解剖はさみペンテア9M時計職人の鉗子
マイクロ解剖ピンセットモンM5
Taq 5X マスター ミックスニューイングランド バイオラボM0285L
ス マイクロデュ

参考文献

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