方法論記事

ヒトの胎児微生物叢に対する介入レジメンの影響を推定するインビトロバッチ培養モデル

DOI：

10.3791/59524

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2019年7月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine- Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest School of Medicine, 3Department of Food Science and Technology, Isfahan University of Technology, 4Research Institute for Biotechnology and Bioengineering, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, 5Department of Geriatrics and Gerontology, Wake Forest School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ヒトのフェカル微生物叢のインビトロバッチ培養発酵システムを説明し、イヌリン(よく知られているプレバイオティクスと最も広く研究された微生物モジュレーターの1つ)を使用して、特定の効果を推定する上でこのシステムの使用を実証する。fecal微生物叢組成および代謝活動に対する介入。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

いくつかのヒト疾患における腸内微生物叢の新たな役割は、新しいツール、技術、技術のブレークスルーを必要とします。このような改善は、人間の健康上の利点のためのマイクロバイオームモジュレータの利用を解読するために必要とされます。しかし、マイクロバイオーム変調を検証し、関連する健康上の利点を予測するための変調器の大規模なスクリーニングと最適化は、多数の動物および/またはヒト被験者が必要とするため、実質的に困難な場合があります。この目的のために、インビトロまたはex vivoモデルは、マイクロバイオームモジュレーターの予備スクリーニングを容易にすることができる。本明細物では、プロバイオティクス、プレバイオティクスおよび他の食品成分を含む腸内微生物叢の様々な介入の効果を調べることができるex vivo fecalマイクロビオタ培養システムを最適化し、実証する。栄養補助食品および薬物、ヒト腸内微生物叢の多様性および組成物に関する。最も広く研究されているプレバイオティクス化合物およびマイクロバイオームモジュレーターの1つであるイヌリンは、健康なフェカル微生物叢組成物およびその代謝活性(フェカルpHおよび有機酸のフェカルレベルなど)への影響を調べるために、ここで例として使用される。乳酸および短鎖脂肪酸(SCFA)を含む。このプロトコルは、フェカル微生物叢プロファイルに対するモジュレーターの異なる介入の影響を推定し、その健康への影響を予測することを目的とした研究に役立つ可能性がある。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト微生物叢は、細菌、古細菌、ウイルスおよび真核生物微生物1からなる複雑なコミュニティであり、人体の内部および外部に生息する。最近の証拠は、肥満、糖尿病を含む様々なヒト疾患における腸内微生物叢および腸内微生物叢(ヒト消化管に見られる微生物とその遺伝子の全コレクション)の基本的な役割を確立している。心血管疾患、および癌1、2、3.さらに、腸内に生息する微生物は、私たちの健康に大きな影響を与える代謝産物の広いスペクトルを生成し、また、いくつかの疾患の病態生理学だけでなく、様々な代謝機能4に貢献することができます4、5.この腸内微生物集団の組成および機能における異常な変化(摂動)は、一般に「腸ジスビオシス」と呼ばれる。ジスビオシスは、通常、宿主の不健康な状態に関連付けられているので、宿主の健全な制御状態に関連する正常な(恒常性)微生物群相と区別することができる。腸内微生物叢ジスビオシスの特定のパターンは、多くの場合、様々な異なる疾患1、2、3、6、7に見出される。

腸内微生物叢による未消化食品、特に発酵性炭水化物/繊維の発酵は、エネルギーを生み出すだけでなく、短鎖脂肪酸(SCFA)、乳酸塩、受刑者、二酸化炭素を含む発散代謝産物を産生し、メタン、水素、エタノール6.さらに、腸内微生物叢はまた、葉酸、ビオチン、トリメチルアミン-N-酸化物、セロトニン、トリプトファン、γ-アミノブチル酸、ドーパミン、ノルエピネフリン、アセチルコリン、ヒスタミン、などの他の生理活性物質の数を生成します。デオキシコール酸、および4-エチルフェニル硫酸塩。これは主に、いくつかの身体プロセス、代謝機能およびエピジェネティック変化1、8、9に寄与する宿主微生物ニッチ内の固有の代謝フラックスの利用によって起こる。 10.しかし、このような微生物製品に対する様々な介入の影響は、簡単で効率的かつ再現可能なプロトコルの欠如のために、未だ不明のままである。ヒト腸内微生物叢組成物は非常に複雑で多様な生態系であり、したがって、人間の健康と疾患病理学におけるその役割に関する多くの疑問は未だに未解決のままである。腸内微生物叢の組成および代謝機能に対する多くの一般的な腸内微生物叢(例えば、プロバイオティクス、プレバイオティクス、抗生物質、女性移植および感染症)の影響は、大部分が解明されていない。さらに、生体内でのこれらの効果の検査と検証は、特に腸内微生物叢によって産生される栄養素や代謝産物のほとんどが腸内で同時かつ迅速に吸収または処分されるため、困難である。したがって、生体内でこれらの代謝産物(例えば、SCFA)の産生、量および処理を測定することは、依然として実用的な課題である。実際、動物やヒト被験者などの生理学的モデルは、腸内微生物叢の役割と宿主の健康に対する変調を決定するために重要であるが、これらは、異なるタイプのマイクロバイオーム調節剤の大規模なスクリーニングには適していないかもしれない。倫理的、金銭的、または時間的制約。この目的のために、インビトロおよび/またはex vivoモデルでは、インビトロで腸内微生物叢を培養し、異なる微生物叢に介入することで、時間とお金を節約する機会を提供することができ、したがって、予備的または大規模なスクリーニングを可能にすることができます。様々な成分(プロバイオティクス、プレバイオティクス、および他の介入化合物など)は、女性の微生物叢の多様性、組成および代謝プロファイルに及ぼす影響を調べたり予測する。腸内微生物叢のこのようなインビトロおよびex vivo系を用いる研究は、宿主の健康と疾患に寄与する宿主-マイクロバイオーム相互作用のさらなる理解を促進し、また、マイクロバイオームを標的とする新しい治療法を見つけることにもつながる可能性がある。宿主の健康を改善し、様々な疾患を予防し、治療する1.

インビトロ腸内微生物叢培養システムは実際の腸の状態を本当に複製することはできませんが、いくつかの研究室はそのようなモデルの開発に努めており、そのうちのいくつかはある程度実用的に発見され、成功裏に使用されています。異なる目的。最近の腸のモデルの1つは、胃、小腸、結腸の異なる領域を含む人間の消化管全体を模倣するヒト腸微生物生態系のシミュレータである。しかし、このような技術的に複雑なモデルは、世界中の他の研究施設からアクセスできない場合があります。したがって、マイクロバイオームモジュレーターを研究する研究室にとって、比較的シンプルで手頃な価格で実用的な新しい代替モデルの開発と、腸内微生物叢および宿主の健康への影響に対する重要なニーズが依然として存在する。したがって、インビトロ(またはex vivo)フェカル微生物叢培養システムの使用は、そのような介入の効果を研究するのに有用であろう11,12.具体的には、腸内微生物叢の多様性と組成物の周期的変化の観点から、異なるプレバイオティクスが微生物叢発酵能力に及ぼす影響、およびFECAL pH、およびSCFAおよび乳酸塩を含む微生物代謝産物のレベルを研究することができる。13.本明細書において、微生物叢調節剤の一例としてイヌリン(最も広く研究されたプレバイオティック成分の1つ)を用いて、この単純な生体生微生物叢バッチ培養系のステップバイステッププロトコルは、その使用を実証するために記載されている。微生物叢への介入後の女性微生物叢および微生物代謝産物の変化。

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プロトコル

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注意:適切な材料安全データシートを参照し、適切なバイオセーフティレベル2(BSL-2)トレーニングの指示とガイドラインに従ってください。標準的なバイオセーフティルールに従ってすべての培養手順に従い、無菌条件を使用してBSL-2キャビネットを使用します。さらに、異なるモデルおよびヒト被験者からのfecalサンプルは、微生物媒介性疾患を広める潜在的なリスクを持つ可能性があります。傷害や感染症の発生時に直ちに医療援助を求めてください。さらに、ヒトおよび動物用便サンプルの使用は、制度的倫理委員会を通じて承認され、サンプルおよび被験者情報を使用するためのプロトコルに準拠する必要があります。

1. 文化メディアの準備

  1. 培養メディアの準備、9種類のストックソリューションを用意
    1. 溶液A(1,000mL):塩化ナトリウム(NaCl)の5.4g、リン酸カリウム二水素(KH2 PO4)の2.7g、塩化カルシウム二水和物の0.16g(CaCl2~2H2O)、0.12gの塩化マグネシウムヘキサハイドレート(MgCl)・6H2 O)、塩化マンガンの0.06g(MnCl2~4H2O)、塩化コバルタス塩化物ヘキサヒドレート(CoCl2~6H2O)、硫酸アンモニウム5.4g(NH4)2 SO4、脱イオン水中で、総体積を1,000mLにします。
    2. 溶液B(1,000mL):脱イオン水中にリン酸カリウム(K2HPO4)を2.7g溶解し、総体積を1000mLにします。
    3. 微量ミネラル溶液(1,000mL):エチレンジアミジン-テトラ酢酸二水和物(Na2 EDTA)の500mgを溶解し、200mgの硫酸ヘプタヒドレート(FeSO4~7H2O)、10mgの硫酸ヘプタヒドレート(ZnSO4)を溶解・7H2 O、3mgのマンガン(II)塩化物四質水和物(MnCl2×4H2O)、リン酸30mg(H3 PO4)、CoCl2の20mg×2×1、クムリン塩化物二水和物1mg(CuCl2)・2H2O)、2mgのニッケル(II)塩化物ヘキサヒドレート(NiCl2・6H2O)及び脱硫水和物中のモリブ化ナトリウム二水和物(Na2 MoO4~2H2O)の3mgを脱イオン水中で、総体積を1,000mLにする。
      注:この解決は光に敏感であるため、暗い/黒またはアルミニウム包装されたチューブ/ボトルに保管されることを確認します。
    4. 水溶性ビタミン溶液(1,000mL):塩酸チアミン100mgを溶解し、Dパントジン酸100mg、ナイアシン100mg、ピリドキシン100mg、P-アミノベンゾ酸5mg、ビタミン0.25mgを総量に還元1,000 mL
    5. 葉酸:ビオチン溶液(1,000mL):葉酸10mg、D-ビオチン2mg、重炭酸アンモニウム100mg(NH4 HCO3)を脱イオン水中に溶解し、総容積を1,000mLにします。
    6. リボフラビン溶液(1,000 mL):5 mM HEPES(1.19 g/L)溶液中にリボフラビン10mgを溶解し、総容積を1,000mLにします。
    7. ヘミン溶液(10mL):10mM水酸化ナトリウム(NaOH)(0.4g/L)溶液で5,000mgのヘミンを溶解し、総体積を10mLにします。
    8. 短鎖脂肪酸ミックス(10 mL):Nバレートの2.5 mL、イソバレートの2.5 mL、等溶性2.5mLを組み合わせます:DL-α-メチルブチル酸塩。
      注:このソリューションは、臭いや煙を避けるためにヒュームフードで使用することをお勧めします。
    9. レサズリン(1,000mL):脱イオン水中に1gのレサズリンを溶解し、総体積を1,000mLにします。
  2. インビトロ嫌気性発酵に使用される培地
    1. この培地を調剤するには、溶液Aの330 mL、溶液Bの330 mL、トレースミネラル溶液の10 mL、水溶性ビタミン溶液の20 mL、葉酸の5 mL:ビオチン溶液、リボフラビン溶液の5 mLを混合します。ヘミン溶液2.5mL、短鎖脂肪酸ミックス0.4mL、レサズリン1mL、酵母エキス0.5g、炭酸ナトリウム4g(Na2 CO3)、システインHCl-H2O0.5g、トリプチケース0.5g、ジリチケース0.5gを添加し、296.1mLの水を添加する。
    2. pH を確認し、7.0 前後であることを確認します(そうでない場合は、1 N HCl または 1 N NaOH で pH を調整します)。無菌ワークステーションの下のボトルフィルターを使用してメディアを真空フィルタリングすることによって殺菌します。
    3. または、すべての成分(ビタミンおよびヘミン溶液を除く)とオートクレーブを121°Cで20分間混ぜ、室温まで冷まします。同時に、0.22 μmの膜フィルターを使用してビタミンおよびヘミン溶液を殺菌し、分配する前にオートクレーブおよび冷却された媒体にこれらを加える。

2. 嫌気室および必要物質の調製

  1. 実験開始前に嫌気性室内の発酵実験に必要なすべての材料、溶液、およびツールを保管し、バッファー/溶液中のツールおよび可溶性酸素に関連する残留酸素が確実に取り外し、すべての材料は設定された嫌気性条件に順応される。
    注:嫌気性室内に必要な材料(実験開始の48時間前):(i)発酵培具;(ii)嫌気性溶液(セクション4.1に従って調製)、(iii)ボルテキサー、 (iv)計量バランス、(v)ムスリンチーズクロス、(vi)はさみ、(vii)漏斗、(viii)1.5、2.0、15、50mLチューブ、(ix)ピペッタ(2、20、200、1,000 μL)および互換性のあるピペットチップ、(x)ガンピペットおよびピペット(5および10mL)、(xi)紙組織、(xii)マーカー、(xiii)チューブは、異なるチューブ、(xiv)廃棄物箱、(xv)O2インジケータおよび(xvi)70%エタノールスプレーボトル(消毒剤)を表す。

3. チューブ・繊維の調製

  1. 重量300mgのイヌリンを50mLチューブに移し、続いて26mLの発酵培った発酵培った発酵培った添加を既に調製し、嫌気性チャンバーに保存する。各fecalサンプルタイプと実験チューブ(試験対象の化合物の数に応じて)に対して1本のブランクチューブを三分の1ずつ準備します。
  2. 発酵実験を開始する前にサンプルの水和を可能にするために、嫌気性室内にこれらのチューブを約24時間放置してください。接種時にチューブ温度が37°Cであることを確認し、したがって、嫌気性チャンバ内に囲まれたインキュベーター内のチューブを持参してください。

4. イヌマチンの調製

  1. 嫌気性希釈液(発酵実験前に少なくとも48時間):NaClの5g、ブドウ糖2g、システイン-HCl0.3gを脱イオン水中に溶解し、総体積を1,000mLにする。オートクレーブと使用前に少なくとも48時間嫌気性室内に保管してください。
  2. Fecalイヌキュラム製剤(発酵実験の日):50mL円錐管中の新鮮なfecalサンプルの5gの重量を量り、50 mL(1:10 w/v)の最終体積に嫌気性希釈液を加え、15分間または完全に均質化するまで渦を加える。無菌チーズクロス(オートクレーブ)の4層を通して均質化された混合物をフィルタリングし、メディアを含むチューブ内の接種のためにすぐにそれを使用します。
    注:被験者群の胎児サンプルは、実験目的が全体的な健康と病気の女性の微生物叢に対する特定の化合物/成分の効果を比較することであれば、プールすることができる。

5. 発酵とサンプリング

  1. セクション4.2に従ってチューブを準備し、希釈および濾過された気体の接種の4 mLでブランク/コントロールおよび実験管を接種する。嫌気性室内の37°Cで接種チューブをインキュベートします。チューブを1時間に1回振り、繊維と接種を再び中断するために穏やかに反転します。
  2. 2 mLアリコートサンプルをそれぞれの発酵管から2mLチューブに取り出して、発酵中に0、3、6、9、24時間ごとに、必要に応じて頻繁にサンプルを収集します。
  3. 実験室のpHメートルを使用してアリコートのpHを測定する(サンプルに直接pH電極を挿入することによって)。残りのサンプルを14,000 x gで10分間4°Cで遠心分離します。直ちに液体窒素中の上清とペレットを凍結し、スナップ凍結後、SCFA分析用の上清とペレットを-80°Cで保存します。

6. 短鎖脂肪酸(SCFA)と乳酸定量

注:マイクロバイオーム培養の上清中のSCFAおよび乳酸塩は、他の場所で13、14、15、16に詳細に説明された方法に従って正確に測定することができる。

  1. 簡単に言えば、氷上の制御および処理サンプルからセクション5で得られたスナップ凍結上清を解凍し、氷上のすべてのさらなる処理ステップを実行する。0.45 μmの膜フィルターを通して上清をろ過し、無細胞サンプルを使用して、HPX-87Hカラムを搭載した210 nmのDAD検出器を使用してHPLCシステムを使用してSCFAと乳酸塩の濃度を測定します。各サンプルに10 μLの注入量を使用し、H2 SO4(0.005 N)を使用して、35°Cで0.6 mL/minの流量でカラムを溶出します。

7. フェカルマイクロバイオーム分析

注:他の場所で詳細な方法とパイプラインに従ってマイクロバイオーム分析を実行 7,13,14,17.

  1. 簡単に言えば、fecal DNA抽出キット13を用いて約200mgのfecalスラリーペレットからゲノムDNAを抽出する。
  2. 細菌16S rRNA遺伝子の超可変領域を増幅するバーコードプライマーを他の場所に記載の方法に従って13に従って使用し、地球マイクロバイオームプロジェクトプロトコル18に記載されているプライマー配列を用いる。
  3. 得られたアンプリコンを磁気精製ビーズで浄化し、ピコグリーンまたは同等の方法で定量します。シーケンサー13上で同じモル濃度と配列で精製されたPCR産物をプールします。
  4. 非多重化、品質フィルタリングとクラスタリング、分類割り当てと希少性、および下流分析の結果のシーケンスを、微生物生態学(QIIME)ソフトウェアに関する定量的洞察を使用して処理します。カポラソら19.

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結果

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このプロトコルは、特定のプレバイオティクス(すなわち、微生物叢組成および代謝活性に対するイヌリンの効果を、胎児pHの変化および健康なヒト被験者の胎児における乳酸およびSCFAの濃度の観点から実証するために用いられる。イヌリンによる治療後の異なるタイムポイント)。fecal pHとは、乳酸およびSCFAのフェスカルレベル(図1)、および微生物叢組成物(図2および図3)を0(ベースライン)で測定し、イヌリンの有無にかかわらず9及び24時間のインキュベーションを行う。結果は、イヌリン処理の有無にかかわらず、インビトロ発酵中にfecal微生物叢組成およびその代謝活性がどのように調節されるかを示す。

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ディスカッション

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ここで提示されるインビトロフェカルスラリー発酵モデルは、ヒトの大腿骨微生物叢の組成に対する異なる基質および微生物株(例えば、プレバイオティクスおよびプロバイオティクス)の影響を近似する単純な単一バッチモデルである。fecal pH および SCFA レベルの面で代謝活動.本明細に提示された結果は、イヌリンの接種がfecal pHを減少させ、非処理されたフェカル微生物叢培養と比較してイヌリン処理されたfecal検体におけるSCFAおよび乳酸のレベルを有意に増加させることを示している(図1)。さらに、腸内微生物叢シグネチャは、イヌリン処理サンプルと未処理サンプルの間でも異なっているように見える(図2および図3)。これらのデータは、このシステムが胎児のマイクロバイオームの多様性と組成だけでなく、その代謝活動に対するイヌリンの影響を反映する方法を例示する。また、特定の実験目的や仮説に応じて、このシステムを用いて様々な他の因子を測定することもできる。さらに、16S rR...

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開示事項

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著者は何も開示していない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、糖尿病、肥満と代謝のためのセンターと臨床翻訳科学センター、ウェイクフォレスト医学部、国防総省の資金援助(助成番号:W81XWH-18-1-0118)からの資金援助を感謝します。カーミットグレンフィリップスII心臓血管医学の椅子;国立衛生研究所は、クロードD.ペッパー古いアメリカ人センター(P30AG12232によって資金提供)に資金を提供しました。R01AG18915;R01DK114224および臨床翻訳科学センター(臨床研究ユニット、UL1TR001420によって資金提供)はまた、ありがたいことに認められている。また、この実験中に、ボランティアの方々と他のラボメンバーの技術支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
重炭酸アンモニウム (NH4HCO3)Sigma-Aldrich217255
硫酸アンモニウム (NH4)2SO4 TGIC2388有毒
カルシウム二水和物 (CaCl2•2H2O)Sigma-AldrichC3306刺激性
塩化コバルト性六水和物(CoCl2•6H2O)Sigma-Aldrich255599
銅二水和物 (CuCl2•2H2O)Acros organics2063450000有毒で刺激的な
システイン-HClSigma-AldrichC121800
D-ビオチンSigma-AldrichB4501
D-パントテン酸Alfa AesarA16609
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム 二水和物 (Na2EDTA)Biorad1610729
DL-α-メチル酪酸Sigma-AldrichW271918
硫酸第一鉄七水和物(FeSO4•7H2O)Sigma-AldrichF8263有毒
な葉酸Alfa AesarJ62937
グルコースSigma-AldrichG8270
HeminSigma-AldrichH9039
HepesAlfa AesarA14777
IsobutyrateAlfa AesarL04038
イソ吉草酸アルファ エーザーA18642
塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2•6H2O)Sigma-AldrichM8266
マンガン四水和物(MnCl2•4H2O)Sigma-Aldrich221279
ナイアシン(ニコチン酸)Sigma-AldrichN4126
塩化ニッケル(ii)塩化物六水和物(NiCl2•6H2O)Alfa AesarA14366有毒
な吉草酸N-吉草酸Sigma-Aldrich240370
P-アミノ安息香酸MP 中国102569有毒で刺激性
のあるリン酸 (H3PO4)Sigma-AldrichP5811
リン酸二水素カリウム (KH2PO4)Sigma-AldrichP5504
リン酸水素カリウム (K2HPO4)Sigma-Aldrich1551128
PyridoxineAlfa AesarA12041
ResazurinSigma-AldrichR7017
RiboflavinAlfa AesarA11764
炭酸ナトリウム(Na2CO3)Sigma-Aldrich1613757
塩化ナトリウム(NaCl)Fisher BioReagents7647-14-5
水酸化ナトリウム(NaOH)Fisher ChemicalsS320
モリブデン酸ナトリウム二水和物(Na2MoO4•2H2O)アクロス有機物206375000
チアミン塩酸塩(チアミン-HCl)アクロス有機物148991000
トリプチカーゼBDバイオサイエンス211921
ビタミンB12Sigma-AldrichV2876
酵母抽出物Sigma-Aldrich70161
硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4•7H2O)Sigma-AldrichZ0251
0.22 & マイクロ;m メンブレンフィルター
AMPure 磁気精製ビーズAgencourt
インキュベーター付き嫌気性チャンバーForma 嫌気性システム、Thermo Scientific、米国
ボトルフィルターコーニング
チーズクロス
イルミナ MiSeq シーケンサーMiseq 試薬キット v3
pHメーター
Qiagen PowerFecal kitQiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeterInVitrogen
VortexThermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC systemWaters Corporation
塩化塩化塩化

参考文献

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