方法論記事

強化された神経化学的検出のための金ナノ粒子修飾炭素繊維マイクロ電極

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DOI：

10.3791/59552

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2019年5月13日

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1Department of Chemistry, American University, 2Center for Behavioral Neuroscience, American University

この記事について

サマリー

本研究では、炭素繊維マイクロ電極を金ナノ粒子で改変し、神経伝達物質検出の感度を高める。

要約

30年以上にわたり、炭素繊維マイクロ電極(CFM)は神経伝達物質検出の標準となっています。一般的に、炭素繊維はガラス毛細血管に吸引され、細かいテーパに引っ張られ、エポキシを使用して密封され、高速スキャン環状ボルタンメトリー試験に使用される電極材料を作成します。ただし、ベア CFCM の使用にはいくつかの制限があります。まず第一に、炭素繊維は、比較的低い表面積を有し、他のナノ材料よりも低い感性を得る主に基底平面炭素を含有する。さらに、グラファイトカーボンは、その時間分解能、および比較的低い導電性によって制限されます。最後に、神経化学物質と高分子は、それらがさらなる神経伝達物質の吸着をブロックする非導電性ポリマーを形成する炭素電極の表面で汚れすることが知られています。本研究では、金ナノ粒子を用いてCMEを改変し、高速スキャン環状ボルタンメトリーによる神経化学的試験を強化する。Au3+をCMFの表面にコロイド溶液から電気堆積または浸漬した。金は安定で比較的不活性な金属であるため、神経化学物質の分析測定に理想的な電極材料です。金ナノ粒子修飾(AuNP-CMEs)は、4時間以上にわたってドーパミン応答に対する安定性を持っていた。さらに、AuNP-CCMは、裸の未改変CFMよりも高い感度(環状ボルタングラムの高いピーク酸化電流)と高速電子伝達動態(低ΔEPまたはピーク分離)を示します。AuNP-CMFの開発は、ドーパミン濃度および他の神経化学物質の急速な変化を検出の下限で検出するための新しい電気化学センサーの作成を提供します。この仕事は神経化学的測定の増強のための広大な適用を有する。薬物乱用、うつ病、脳卒中、虚血の神経化学的影響を研究するために、げっ歯類やその他のモデルの生体内の神経伝達物質を検出する新しい電極センサの開発には、金ナノ粒子修飾CFMの生成が非常に重要です。および他の行動や病気の状態。

概要

炭素繊維マイクロ電極(CFM)1は、ドーパミン3、ノルエピネフリン4、セロトニン5、アデノシン6を含むいくつかの重要な神経伝達物質2の酸化を検出するためのバイオセンサとして最もよく使用されます。ヒスタミン7、および他の8.炭素繊維の生体適合性と大きさは、より大きな標準的な電極と比較して組織の損傷を軽減するため、移植に最適です。9 CMFは有用な電気化学的特性を有することが知られており、高速電気化学的技術、最も一般的に高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)10、11で使用すると迅速な測定を行うことができる。FSCVは、適用電位を迅速にスキャンし、特定の分析物12、13に対して特定の環状ボルタングラムを提供する技術である。高速スキャンによって生成される大きな充電電流は、炭素繊維上で安定しており、特定の環状ボルタングラムを生成するためにバックグラウンドを減算することができます。

その最適な電気化学と神経生物学的重要性のため, ドーパミンは広く研究されています。.カテコールアミンドーパミンは、神経系内の動き、記憶、認知、感情の制御に重要な役割を果たす必須の化学メッセンジャーです。ドーパミンの余剰または欠乏は、多数の神経学的および心理的干渉を引き起こす可能性があります。;これらの中には、パーキンソン病、統合失調症、および中毒性の行動があります。今日、パーキンソン病はドーパミン合成に関与する中脳ニューロンの変性による流行性障害であり続けている14.パーキンソン病の症状には、振戦、運動の遅さ、こわばり、バランス維持の問題が含まれます。一方、コカイン15やアンフェタミン16、17などの覚醒剤はドーパミンのオーバーフローを促進する。薬物乱用は、最終的にドーパミンの定期的な流れを置き換え、最終的に中毒性の行動につながるドーパミンの余剰を必要とする脳の条件。

近年、神経伝達物質検出18において電極機能の向上に重点が置かれている。電極感度を高める最も広く普及した方法は、繊維表面をコーティングすることによってある。驚くべきことに、炭素繊維19上の金属ナノ粒子電着に関する研究は限られている。金等の貴金属ナノ粒子は、他の機能性材料20を用いて繊維表面にエレクトロポジットしてもよい。例えば、神経伝達物質吸着が起こる電気活性表面積を増加させる。エレクトロデポジット金属ナノ粒子は、急速に形成され、精製することができ、炭素繊維に付着する。これらのナノ粒子の核生成と成長の制御を可能にするため、貴金属ナノ粒子の堆積と炭素繊維の表面増強の両方に電気化学は重要であり続けます。最後に、触媒および導電性特性の増加、および質量輸送の改善は、金属ナノ粒子を電気分析に利用する他の利点の一つである。

アメリカン大学の高度な実験室シーケンスコース(実験生物化学IおよびII CHEM 471/671-472/672)は、分析、物理、生化学の研究室の組み合わせです。前期は、研究室の技術の概要です。2学期は学生主導で主導的な研究プロジェクト21です。これらのプロジェクトについて、学生は以前に生体分子、タンパク質、ペプチド、および金ナノ粒子22、23のアミノ酸促進合成のメカニズムを調べた。最近の研究では、電極表面における金ナノ粒子(AuNP)産生の形成と、CFCが神経伝達物質を検出する能力に対するAuNP効果の評価に焦点を当てています。本研究では、この技術を応用して、ドーパミン酸化を検出するCFMの感度が繊維表面上へのAuNPの電着を通じて高められることを実証した。各裸CFMEは、CFMEの表面にドーパミン酸化を測定するためにドーパミン酸化電流を検出する際に、様々なスキャン速度、安定性およびドーパミン濃度によって特徴付けられます。その後、Au3+をAu0に還元し、同時にナノ粒子として繊維表面にエレクトロデポジットし、続いて一連の特性解析実験を行った。直接比較の後, AuNP-CMS はドーパミン検出の高い感度を持っていることがわかりました。.電着を介して繊維表面にAuNPの均一なコーティングは、より高い電気活性表面積をレンダリングします。したがって、ドーパミンの吸着を修飾電極表面に増加させる。これは、より高いドーパミン酸化電流につながった.AuNP-CMEsのドーパミン酸化および還元ピーク(+Ep)の潜在的な分離も小さくなり、より速い電子伝達動態を示唆した。この研究の将来の研究は、ドーパミンの検出のための裸とAuNP-CMの両方の生体内試験が含まれています.

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プロトコル

炭素繊維マイクロ電極の構築

  1. 炭素繊維の調製
    1. 炭素繊維マイクロ電極を作成するには、まず手、手袋、へらを使って炭素繊維(炭素繊維、直径7mm)を1つずつ分離します。
    2. ねじれた糸から繊維を引っ張るか、引っ張ります。
    3. 隔離された炭素繊維をガラスキャピラリー(マイクロフィラメントなしの単一バレルホウケイ酸塩キャピラリーガラス、外径1.2mm、内径0.68mm)に吸引する。
    4. 長さ約10cm、幅25cmの段ボールを切断して電極ホルダーを作成します。
  2. 垂直毛細管プーラーを使用して電極を引っ張ります。
  3. 垂直毛細管引きの引き戸を開きます。
  4. ガラスキャピラリーを挿入するのに十分なスペースでドリルチャックを反時計回りに回転させることによって、金属ホルダーロッドを緩めて取り外します。
  5. ガラスキャピラリーを電極ホルダーに挿入します。ガラス毛細血管を手作業で垂直毛細血管の上部に手動で上げます。
  6. ガラス毛細血管を壊したり粉砕したりすることなく、ドリルチャックでガラス毛細血管を時計回りに締めます。
  7. ヒーター 1、ヒーター 2、および磁石の設定を製造元に調整し、ガラスキャピラリーを電極材料の細かいテーパに引っ張るように提案しました。
  8. 赤いスタートボタンを押してコイルコイルを加熱し、圧力、重力、加熱を介して電極を引っ張ります。
  9. コイルを赤い熱い状態から冷やします。2つの引っ張った電極を上から下に接続するはさみで炭素繊維を切ります。ドリルチャック法を使用して、反時計回りにねじれ、垂直毛細管プーラーからガラス毛細血管を除去します。

2. 炭素繊維マイクロ電極製剤

  1. ステレオスコープまたは顕微鏡の下で、外科はさみまたは鋭いかみそり刃でガラス毛細血管の表面から突き出た炭素繊維を約100-150 μmの長さに切断する。
  2. 綿棒を用いて25mLバイアルに10gのエポキシと0.2mLの硬化器を混ぜてエポキシの溶液を調出す。
  3. 各電極の先端だけをエポキシおよび硬化器溶液に約15sの間浸します。
  4. 炭素繊維マイクロ電極の前述の上部をアセトンに約3秒浸し、炭素繊維マイクロ電極のバレルから余分なエポキシを洗い流す。

3. 電解

  1. 作動電極(炭素繊維マイクロ電極)を基準電極に加えて0.5mM HAuCl4の溶液中に入れ、マイクロマニピュレータを用いて塩化銀銀(Ag/AgCl)を用いた。
  2. 作動電極と参照電極をポテンショスタットとヘッドステージに接続します。
  3. UNC HDCV ソフトウェアを開きます。ソフトウェアの設定を変更して波形を適用します。コンピュータの設定に次の波形を入力します: 0.5 mM HAuCl4を含む 0.1 M KCl ソリューションで 0.2 V から -1.0 V まで、10 サイクルのスキャン レートで 50 mV/s のスキャン速度でスキャンします。緑色の矢印を押して波形を適用します。次に、開始ボタンを押して測定値の記録を開始します。

4. 走査型電子顕微鏡

注:画像裸と金ナノ粒子は、走査電子顕微鏡装置(SEM)を使用して炭素繊維マイクロ電極を改変しました。サンプルを黒い導電性テープにロードし、製造元の指示に従います。

  1. 楽器の電源を入れ
    1. キーを START およびリリースに切り取します。
    2. InTouchScope ソフトウェアをダブルクリックして開きます。
    3. キーを放します。それは単独でIシンボルに着陸する必要があります。
    4. EVAC ボタンが点滅しなくなるまで待ちます。
    5. EVACボタンが点滅しなくなったら、VENTボタンを押します。
    6. VENT ボタンが点滅しなくなるまで待ちます。
    7. 作業距離(WD)が20 mm ~ 30 mm であることを確認します。
    8. 待っている間に、サンプルを準備します。
  2. スキャン
    1. VENTボタンが点滅を停止したら、サンプルを計測器にロードします。
    2. サンプルをロードする際に、サンプルホルダーの曲面部分が計測器の方を向いていることを確認します。
    3. サンプルが読み込まれたら、EVAC ボタンを押します。
    4. 作業距離を 10 mm に調整します。
    5. EVAC ボタンが点滅しなくなったら、コンピュータの電源を入れます。
    6. デスクトップ上にあるインタッチスコープソフトウェアをクリックします。2つのインタッチスコープソフトウェアがあり、緑と黄色の円のないものをクリックしてください。
    7. ソフトウェアが開いたら、オブザーブ(画面右上)をクリックしてビームをオンにします。観察をクリックする前に、EVACボタンが点滅しなくなったことを確認します。
    8. サンプルの分析を開始します。
    9. 電圧、動作距離(WD)、プローブ電流(PC)の設定が許容可能であることを確認します。
    10. ズームアウト(約50X)を高い設定にし、低い設定で拡大します。
    11. 作業距離を 10 mm に設定します。
    12. サンプルの写真を撮る前に、画像が目的のコピー先フォルダに保存されていることを確認してください。
    13. 目的のフォルダを選択するには、設定(画面の左上)をクリックします。
    14. フラッシュ ドライブを使用してコンピュータから画像をエクスポートします。
  3. オフ
    1. ビームをオフにするには、[観察]をクリックします。
    2. VENT ボタンを押し、点滅が停止するのを待ちます。
    3. VENT ボタンが点滅するのを待っている間、作業距離を 20 mm - 30 mm に戻します。
    4. VENT ボタンが点滅しなくなったら、サンプルを計測器からアンロードします。
    5. EVAC ボタンを押し、点滅が停止するのを待ちます。
    6. EVAC ボタンが点滅しなくなったら、ソフトウェアから終了し、コンピュータをシャットダウンします。
    7. O記号のキーをオンにして、楽器を完全にオフにします。

5. 高速スキャン周期的なボルタンメトリーテスト

  1. 炭素繊維マイクロ電極をポテンショスタットとヘッドステージにAg/AgClリファレンス電極と接続します。
  2. マイクロマニピュレータを使用して、X、Y、Z測定ノブを手動で調整することにより、炭素繊維マイクロ電極をフローセルにしっかりと下げる。
  3. DI水中(131.5 mM NaCl、3.25 mM KCl、1.2mM CaCl 2、1.25 mM NaH2PO4、1.2mM MgCl2、および2.0 mM Na2SO4)で緩衝液を調べて7.4に調整します。
  4. フローセルをリン酸緩衝生理食べ物(PBS)バッファーで埋めます(pH = 7.4)。
  5. 充填された60 mLバッファーシリンジを使用して、約1 mL/分でフローセルにPBSバッファを注入します。
  6. 電極をフローセルに入れ、緑色のボタンを押して波形を適用します。オシロスコープを観察し、電極を切断するか、ゲインを調整して過負荷を防ぎます。各電極の実行間の平衡化の約10分を可能にする。
  7. 既定の波形をドーパミン波形に設定します。10 Hz および 400 V/s で 0.4 V から 1.3 V までスキャンします。
  8. 10 mMドーパミン、セロトニン、ノルエピネフリン、および過塩素酸の他のストック溶液を調調します。ピペットを用いてPBSバッファーの10mLにドーパミンストック溶液の1μMをピペッティングすることにより、バッファー中の1μMの最終濃度に神経化学物質を希釈する。
  9. 測定を開始するには、録音ボタンを押します。10 s の後, フローセルまたは神経伝達物質の任意の他の濃度に 1 μM ドーパミンの 0.2 mL を注入します。.それに応じて、濃度、スキャンレート、波形(保持電位またはスイッチング電位)を調整します。合計実行時間を 30 s に設定します。
  10. HDCV解析ソフトウェアを使用して実行を分析します。必要に応じてパラメータを変更します。
  11. 実験が完了したら、3 mLの水を注入してフローセルをきれいにし、フローセルのバッファーと注入ポートにそれぞれ3回空気を注入します。
  12. 波形と計器をオフにします。

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結果

図1では、FSCV試験を用いてインビトロ中の神経伝達物質の濃度を測定する回路図を示す。図1は、適用されたドーパミン波形を表示する。三角形の波形は、400 V/s で -0.4 V から 1.3 V までスキャンします。図の左の2番目の部分では、ドーパミンオルソキノン(DOQ)へのドーパミンの酸化を表示し、電極の表面に分析体の表面から2つの電子伝達プロセスが起こる。最後に、現在の時間プロットと時間プロットがカラープロットでオーバーレイされます。現在の時間プロットと時間プロットは、ドーパミン酸化の表現です。ドーパミン酸化がない場合は平坦であり、ドーパミンがドーパミンオルソキノンに酸化され、分析剤の吸着物としてドーパミンに還元され、その後、電極の表面からdesorbsが低下すると、垂直に上昇します。カラープロットは電流の3次元プロットです。黄色の電流は背景電流(ゼロに近い)であり、緑色のプロットは正の酸化電流(ドーパミンオルソキノンへのドーパミン酸化)であり、...

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ディスカッション

本研究では,高速スキャン環状ボルタンメトリーを用いてドーパミンなどの神経伝達物質を検出するための金ナノ粒子修飾炭素繊維マイクロ電極を構築する新しい方法を示す.この方法は、生体分子検出の感度を高めるための効率的で、緑色で比較的安価なアプローチです。炭素繊維の表面に堆積した金の厚さは、電着の時間と電着溶液中に存在する金の濃度によって制御することができる。金改質炭素繊維マイクロ電極は、電子移動運動性の高速化に加えて、裸電極よりも有意に高い電気活性表面積を有することが示された。また、裸の未改変電極材料よりも高い感度と検出限界を持っていました。さらに、電極は、少なくとも4時間のフローセルで試験した場合、ドーパミン検出に向けた安定性を示した。電極の表面への吸着制御を示す金改変炭素繊維電極のスキャン速度と濃度の両方に関してドーパミン検出のためのピーク酸化電流に対して線形応答があった。

プロトコルの重要なステップは、垂直毛細管プーラーを用いた炭素繊維マイクロ電極の引っ張りおよびエポキシを用いたガラス毛細血管と炭素繊維との間接接着を達成することを含む。さらに、炭素繊維の表面に金の電着は、電極の表面に...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

アメリカン大学、教員研究支援助成金、NASA DCスペースグラント、NSF-MRI#1625977に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ドーパミン塩酸塩シグマ アルドリッチH8502-5G
リン酸緩衝生理食塩水シグマ アルドリッチP5493-1L
パイン ウェーブニューロ ポテンショスタットパインインスツルメンツNEC-WN-BASICこの注文は、ヘッドステージ、アダプター、コード、その他の電子機器
パインフローセルとマイクロマニピュレーターパインインスツルメンツNEC-FLOW-1こちらもマイクロマニピュレータ、フローセル、ノブ、チューブ、コネクタなどを含む一括注文です。
ガラス毛管AMシステム602500
T-650カーボン繊維GoodfellowC005711
エポン828エポキシミラースティーブンソンEPON 828 TDS
ジエザリントリアミングマAldrichD93856-5ML
塩化物金(III)グマAldrich254169HAuCl4またはAuCl3
pHメートルフィッシャーS90528
ファラデーケージAMETEK TMC81-334-03
シリンジポンプ新時代ポンプNE-1000
ッペンドルフピペットとチップエッペンドルフ2231000222これはまた、複数のピペットとチップを含む大量注文です
10 -1,000mLビーカーVWR10536-390
カーボンファイバーGoodfellowC 005711
SEMJEOLJSM-IT100
など、他のすべてのアクセサリーと一緒に大量に提供されますシシとして来てエ

参考文献

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