我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。
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この記事について
サマリー
要約
神経変性疾患の発症と進行について理解する多くがあります, 責任を負う基礎となる遺伝子を含む.化学変異原を用いた前方遺伝子スクリーニングは、ヒトと保存された細胞経路を共有するショウジョウバエおよび他のモデル生物の間で変異型を遺伝子にマッピングするための有用な戦略である。目的の変異遺伝子がハエの発達初期の段階で致死的でない場合、クライミングアッセイは、低上昇率などの脳機能低下の表現型指標をスクリーニングするために行うことができる。続いて、脳組織の二次組織学的解析は、神経変性型をスコアリングすることにより遺伝子の神経保護機能を検証するために行うことができる。遺伝子マッピング戦略には、これらの同じアッセイに依存するメオティックおよび欠乏マッピングが含まれており、その後にDNAシーケンシングを行い、目的の遺伝子におけるヌクレオチドの変化の可能性を特定することができます。
概要
ニューロンは、ほとんどの部分は有人性のポスト・マイトティックのためのものであり、1、2を分割することができません。ほとんどの動物では、神経保護機構は、特にニューロンが損傷に最も脆弱である老年期に、生物の寿命を通じてこれらの細胞を維持するために存在する。これらのメカニズムの基礎となる遺伝子は、神経変性を示す変異体、前方遺伝プロトコルを使用して、神経保護の喪失のための目の前の指標で同定することができる。エチルメタンスルホン酸エチル(EMS)やN-エチル-N-ニトロスア(ENU)などの化学変異を用いた前方遺伝スクリーンは、それらが誘発するランダムな点突然変異のために特に有用であり、本質的に公平なアプローチをもたらし、光を当てた本質的に公平なアプローチをもたらす真核生物モデル生物3,4,5における多数の遺伝子機能(対照的に、X線変異はDNA切断を作成し、点突然変異6ではなく再配列を引き起こす可能性がある)。
一般的なフルーツフライショウジョウバエメラノガスターは、その高品質、よくアノテートゲノム配列、高度に発達した遺伝....
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プロトコル
1. ハエの準備と老化
- 遺伝的スクリーンに使用されるショウジョウバエ変異体のコレクションを6を取得または生成します。ここでは、第2染色体にマッピングされ、CyO上でバランスがとれたENU変異線が用いられる。
- トウモロコシ糖蜜培地上で25°C、12時間の光/暗いサイクルに設定されたインキュベーターで実験遺伝子型ラインを増幅します。
- 各実験遺伝子型から成人のエクロションの0〜2日の間に約20ホモ接合子孫を収集します。一貫して男性または女性のハエのいずれかを収集することにより、セックスバイアスを排除します。
- 29°Cで必要に応じてコーンミール糖蜜培地でハエを老化させ、年齢を加えるにつれて新鮮な食べ物にハエを維持するために2〜3日ごとにバイアルを反転させる。ここに表示される画面では、ハエは10-12日間熟成されました。
- 前述の10として2つのバイアルおよびテープを使用してクライミングアッセイ試験室を組み立てる。バイアルは、両方の開いている端に接続する必要があります。定規を使用して、チャンバーの一方の端に 5 cm の線をマークします。
2. プロトコル 1: クライミングアッセイ (Ali et al.10
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結果
このエアチクルでは、成人ハエにおける神経完全性の維持(例えば、神経保護)の維持に役割を果たす遺伝子脳腫瘍(ブラット)を同定するために用いられるステップを提示する17;神経保護に関与する遺伝子を同定するために使用できる方法論。我々は、前方遺伝的アプローチ(図1Aに概説されている戦略)を用いて、クライミングアッセイを用いて化学的に変異したハエのコレクションをスクリーニングした(このアッセイに使用される装置は図1Bに示されている)。235本のホモ接合線のうち、試験されたラインの約37%が10-12日齢で試験した場合、50%以下の上昇合格率を示した(図1C)。テストされたラインの58%は、一方通行のANOVA(図1D)を使用して、テストされたすべてのラインの平均.......
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ディスカッション
ショウジョウバエにおける前方遺伝スクリーンは、加齢依存性神経保護5、23、24、および、異なる生物学的プロセスに関与する遺伝子を同定するための効果的なアプローチであった。25.この戦略を用いて、我々は新しい神経保護遺伝子17としてブラットを同定することに成功した。
このプロトコルの重要なステップの1つは、ヒスロジー分析のためのヘッドの適切な向き(セクション4.4.3.で説明されているように)を含みます。さらに、マイオティックマッピングに使用される線のマーカーは、新しい変異の表現型を妨げるべきではない(本研究:神経変性)。我々は、選択されたマーカーが自分自身の神経変性を引き起こさないことを確認するために、最初のテストをお勧めします。例えば、.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しない。
謝辞
私たちは、遺伝的スクリーンが行われた研究室で、神経保護遺伝子としてのブラットの同定と特徴付けを可能にしたバリー・ガネツキー博士に特に感謝しています。私たちは、この記事で提示された遺伝的スクリーンで使用されるENU変異ハエのコレクションを親切に提供してくれたスティーブン・ロビナウ博士に感謝します。ガネツキー研究所のメンバー、グレース・ボーコフ・ファルク博士、デビッド・ワッサーマン博士に感謝申し上げます。ウィスコンシン大学、キム・ラッキー博士、アラバマ大学光学分析施設
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 主要機器 | |||
| 組織学 | |||
| 光学顕微鏡 | ニコン | エクリペE100 | イメージングに適した対物レンズは20倍 |
| イメージングソフトウェア | ニコン | ||
| 顕微鏡カメラ | ニコン | ||
| サーマルサイクラー | エッペンドルフ | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR®ショウジョウバエバイアル、ナ | ローVWR | 75813-160 | |
| VWR®汎用実験室用ラベリングテープ | VWR89097-912 | ||
| 標準マウスパッド | |||
| ステレオスコープ | モティック | モデルSMZ-168 | |
| CO2麻酔ステーション(ブローガン、フットバルブ、アルティメットフライパッド) | ジェネシーサイエンティフィック | 54-104、59-121、59-172 | Doesn'CO2タンク |
| ファインチップブラシ | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophilaインキュベータ | ーVWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター | 6599 | |
| Drosophila ライン 組換えマッピングに使用 | ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター | 3227 | 遺伝子型: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A4094 | |
| クロロホルム | サーモフィッシャーサイエンティフィ | C298-500 | |
| 氷酢酸 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A38-500 | |
| フィッシャーブランド™ プレミアムマイクロ遠心チューブ:1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoiceクリアリングエージェント1x | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ リチャード・アラン・サイエンティフィック&トレード;取り付け媒体 | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine 顕微鏡スライド、75 mm x 25 mm x 1 mm、EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ カバーメガネ:長方形フィ | ッシャーブランド | 12-545M | 寸法:24ミリメートル×60ミリメートル |
| トレーサブ | タイマーVWR | ||
| スライドウォーマー | バーンステッド国際 | モデル番号26025 | |
| スライドトレイとラックDWK | ライフサイエンス | ラック20 | |
| ッシャーブランド&貿易; 汎用超長鉗子 | フィッシャーブランド | 10-316A | |
| キムワイプ&貿易; | キンバリー・クラーク&貿易;プロフェッショナル | ||
| 6インチピューリタンアプリケーター | 広葉樹製品会社、メイン州ギルフォード | 807-12 | |
| VWR®かみそりの刃 | VWR | 55411-050 | |
| 16 + 1 | のためのタッパーウェアかガラス容器 | ||
| ハイプロファイルコーティングされたミクロトームブレード | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ 蓋付き丸型アイスバケツ、4リットル | コーニング&貿易; | ||
| ビーカー | または氷水およびカセットのための他の容器 | ||
| ティッシュ バス | 精密科学的な会社 | 66630 | |
| ミクロトーム | ライカ バイオシステム | ||
| ズ分子analysis | |||
| Wizard®SVゲル&PCRクリーンアップシステム | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNAポリメラーゼ | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™セーフ&トレード;DNAゲル染色 | Invitrogen™ | ||
| ウルトラピュア&トレード;アガロース | Invitrogen™ | ||
| 1 kb plus DNAラダー | Invitrogen™ | ||
| ApE-Aプラスミドエディタソフトウェア | 無料でダウンロード可能 | ||
| Statistical analysis | |||
| Rソフトウェアパッケージ | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO;博士[1]/TM3, Sb[1] | ブルーミントン・ショウジョウバエ・ストック・ | センター59967 |
参考文献
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.....
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再版と許可
