方法論記事

エチルメタンスルホン酸変異体による小粒作物におけるゲノム中の標的誘導局所病変(TILLING)集団の開発

DOI：

10.3791/59743

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2019年7月16日

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1Department of Plant Science and Landscape Architecture, University of Maryland, College Park

この記事について

サマリー

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記載は、エチルメタンスルホネート(EMS)をミュータゲンとして使用する小さな穀物作物における標的誘導局所病変(TILLING)集団を開発するためのプロトコルである。また、Cel-1アッセイを用いて変異検出するためのプロトコルも提供される。

要約

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標的化された局所病変INゲノム(TILLING)は、化学的変異と標的遺伝子の配列変動の検出を含む強力な逆遺伝学ツールです。TILLINGは、特に変換ベースのアプローチが重大な制限を持つ小さな粒において、遺伝子検証のための非常に貴重な機能ゲノミクスツールです。堅牢な変異型集団を開発することは、TILLINGベースの遺伝子検証研究の効率性を決定する鍵となります。全体的な突然変異頻度が低いTILLING集団は、望ましい変異を見つけるために非現実的に大きな集団をスクリーニングする必要があることを示し、一方、高い変異原濃度は集団の死亡率が高く、不十分につながる変異型個体の数。効果的な集団が開発されると、対象遺伝子の変異を検出する複数の方法があり、プラットフォームの選択は、リソースの実験規模と可用性に依存します。変異体同定のためのCel-1アッセイおよびアガロースゲルベースのアプローチは便利で、再生可能で、資源集約的なプラットホームである。それは簡単で、計算上の知識を必要としないという点で有利であり、基本的な実験室装置を用いて少数の遺伝子の検証のために特に適している。本記事では、投与曲線の調製、変異集団の変異形成および維持、およびPCRベースのCel-1アッセイを用いた変異型集団のスクリーニングを含む、良好なTILLING集団の開発方法を説明する。.

概要

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ゲノムの点の突然変異は、研究者にとって多くの有用な目的を果たすことができます。その性質と位置に応じて、これらの突然変異は、目的のタンパク質の遺伝子または異なるドメインに機能を割り当てるために使用することができます。一方、新規な遺伝的変異の源として、表現型スクリーンを用いて所望の形質に有用な変異を選択し、さらに作物改善に使用することができる。TILLINGは、化学的変異および標的遺伝子の配列変動の検出を含む強力な逆遺伝学ツールです。アラビドプシス1とショウジョウフィリアメラノガスター2で最初に開発され、TILLING集団は、ヘキサプロイドパン小麦(トリチカム・アエスチバム)3などの多くの小さな穀物作物で開発され、利用されています。大麦(大群)4, テトラプロイドデュラム小麦 (T. ディコカイドデュラム)5, ジプロイド小麦 (T. モノコカム)6と小麦エージロップスタウスキイの"D" ゲノム前駆者 7.これらのリソースは、アバイオティクスおよび生物学的ストレス....

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プロトコル

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1. 効果的な変異形成のための投与曲線の調製

  1. 蒸留水の50 mLを含む6つの250 mLガラスフラスコ(各フラスコで100個)に関心のある遺伝子型で100種を浸します。種子による浸漬のために室温(RT)で8時間100rpmで振る。
  2. ヒュームフードでは、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、および1.2%(w/v)エチルメタンスルホン酸(EMS)溶液を0.167、0.249、0.331、0.415、および0.498 mLのEMSをそれぞれ溶解して調用する。
    注:EMSは1.206 g/mLの密度のRTで液体である。
    注意:EMSを取り扱う間、適切な個人用保護具(PPE)を使用してください。
  3. 5つのフラスコから水を取り出し、浸漬種子を含む各フラスコに50 mLのEMS溶液を加え、0.0%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%のEMS溶液で6種類の処理が行われます。75 rpmおよびRTで16時間のフラスコを振る。
  4. EMS溶液をデカントし、チーズクロスを使用して処理ごとに別々に処理された種子を収集します。使用したEMS溶液を1体のEMS不活性化溶液(0.1M NaOH、20%w/v Na2 S2O3)を24時間添加して不活性化します。また、汚染されたフラスコとピペットの先端をEMS不活性化液で24時間治療します。
  5. EMS処理された種子を水道水の下で....

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結果

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図2は、ヘキサプロイドパン小麦品種ジャガー、ジプロイド小麦トリチカムモノコカム6、および小麦エージロップスタウシイ7のゲノムドナーの投与曲線を示す。所望の50%の生存率に対するEMS用量は、それぞれT.モノコカム、Ae.タウシイ、およびT.aestivumについて約0.25%、0.6%および0.7%であった。ヘキサプロイド小麦のEMS耐性が高いのは、そのゲノム緩衝能力によるものです。しかし、いずれも二元化であるにもかかわらず、T.モノコカムのEMS耐性はAe.タウシイのほぼ半分であった。したがって、これらの結果は、関心のある個々のゲノムタイプに対して適切なEMS用量を決定することの重要性を強調する。

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ディスカッション

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TILLINGは遺伝子検証のための非常に貴重な逆遺伝学ツールであり、特に変換ベースのアプローチが深刻なボトルネックを持つ小さな穀物に対して11.高い変異頻度で変異化集団を開発することは、機能的ゲノミクス研究を行う上で重要なステップの1つである。堅牢なTILLING集団を開発する上で最も重要なステップは、EMSの最適濃度を決定することです。M1における40%〜60%の生存率は、小麦および大麦4,6,18におけるEMS変異形成の有効性の良好な指標であることが見出された。生き残った植物は、目的の任意の遺伝子の突然変異を発見するのに役立つまともな突然変異周波数を提供することができます。米では、M1植物の生殖能力は別の決定要因であり、M1植物の生存に加えて、異なる種型20間で異なって報告されている。

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開示事項

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著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

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この研究は、USDA国立食糧農業研究所、ハッチプロジェクト1016879、およびMAESグラント第2956952号を介してメリーランド農業実験ステーションによって支援されました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェル1.1mlマイクロチューブ、マイクロラックナショナルサイエンティフィックTN0946-08R葉の組織を収集するため
アガロースIバイオテクノロジーグレードVWR0710-500G
バイオスプリント 96 DNAプラントキットQiagen941558DNA抽出用キット
Cel-1 エンドヌクレアーゼティルらによって記述されているように抽出 2006一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ
遠心分離機 5430 Rエッペンドルフ
エチルメタンスルホン酸シグマ アルドリッチM-0880-25GEMS、化学変異原
凍結乾燥/シェル凍結システムLabconco葉組織の凍結乾燥用
キングフィッシャーフレックス精製システムサーモフィッシャー サイエンティフィック5400610ハイスループットDNA抽出ロボット
My Taq DNAポリメラーゼバイオラインBIO-21107
ヌクレアーゼフリーウォーターSigma aldrichW4502-1L
NuGenius ゲルイメージングシステムSyngene
Orbit Environ-shakerLab-line
SPECTROstar NanoBMG LABTECHDNA定量用ナノドロップ
T100サーマルサイクラーBIO-RAD1861096

参考文献

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  1. McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
  2. Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
  3. Tsai, H.,....

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