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方法論記事

蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

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DOI:

10.3791/59774

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2019年7月29日

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1Center for Translational Neuromedicine, University of Rochester Medical Center, 2Center for Translational Neuromedicine, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

経頭蓋光学イメージングは、無傷の頭蓋骨を介して生きているマウスの皮質における脳脊髄液輸送の広視野イメージングを可能にする。

要約

げっ歯類における脳脊髄液(CSF)の流れは、主にトレーサーの外生体定量を用いて研究されている。2光子顕微鏡や磁気共鳴イメージング(MRI)などの技術により、CSFフローの生体内定量化が可能になりましたが、イメージング量の減少と空間分解能の低下により制限されています。最近の研究は、CSFがげっ歯類皮質の動脈と貫通動脈を取り囲む血管周囲空間のネットワークを介して脳のパレンキマに入っていることを発見した。CSFのこの両頭膜エントリは、リンパ系の主要な運転者であり、有毒な代謝溶質(例えば、アミロイド-β)のクリアランスに関与する経路である。ここでは、生きたマウスの無傷の頭蓋骨を通して蛍光CSFトレーサーのリアルタイム、メソスコピックイメージングを可能にする新しいマクロスコピックイメージング技術を例示する。この最小限に侵略的な方法は多数の実験設計を促進し、CSFダイナミクスの単一または繰り返しテストを可能にする。マクロスコープは、高い空間的および時間的な解像度を持ち、その大きなガントリーと作業距離は、行動デバイス上でタスクを実行しながら、イメージングを可能にします。このイメージングアプローチは、この技術から得られた2光子イメージングおよび蛍光測定を用いて検証され、外生蛍光および無線標識トレーサーの定量と強く相関する。このプロトコルでは、経頭蓋マクロスコピックイメージングを使用して生マウスのリンパ輸送を評価する方法について説明し、より高価なイメージングモダリティに対するアクセス可能な代替手段を提供する。

概要

脳脊髄液(CSF)は、脳と脊髄を浴び、恒常性の維持、栄養素の供給、頭蓋内圧の調節に関与しています。くも膜下のCSFは皮質動脈を取り囲む周血管空間(PVS)のネットワークを介して脳に入り、その後、貫通動脈2に沿って流れ落ちる。一度、CSFは間質液(ISF)と交換し、アミロイドβ(Aβ)やタウタンパク質などの有害な代謝産物を脳外に運び、低抵抗性の白質路および経度空間2、3を通して凝集体する。.この経路は、アストログリアアクアポリン-4(AQP4)チャネルに依存し、したがってグリアリンパ系(リンパ系)系4と呼ばれた。神経ピルの廃棄物は、最終的に頭蓋骨神経の近くのリンパ管を介してCSF-ISFから、頸部リンパ節に向かって髄膜に取り除かされる5。このシステムの障害は、アルツハイマー病6、7、外傷性脳損傷3、虚血性および出血性脳卒中8などのいくつかの神経疾患に関与している。

CSF輸送は、過去にシスターナマグナ(CM)9、10およびリンパ研究にトレーサーを注入することによって可視化することができ、主に2光子顕微鏡検査4、11、12を利用している。 13, 磁気共鳴イメージング (MRI)14,15,16,17, および ex vivo イメージング3,6,11,18トレーサーの動態を評価する。2光子顕微鏡は、PVSおよび高い空間分解能によるCSFトレーサーの詳細なイメージングに適した方法ですが、視野が狭く、侵襲的な頭蓋窓や頭蓋骨の薄化が必要です。Ex vivoイメージングは、免疫組織化学と組み合わせることで、単一細胞から脳全体に至るまでのマルチレベル分析を可能にする19.しかしながら、死後組織を観察するために必要な灌流固定のプロセスは、CSF流向に大きな変化を生じ、PVSを崩壊させ、トレーサー12の分布および位置を著しく変化させる。最後に、MRIはマウスと人間の脳全体のCSF流れを追跡できますが、血管周囲流の空間的および時間的分解能を欠いている。

新しい技術である経頭蓋マクロ画像は、生きているマウスの後頭皮質全体における血管CSF輸送の広視野イメージングを可能にすることによって、これらの限界のいくつかを解決する。このタイプのイメージングは、マルチバンドフィルタキューブ、微細LED光源、および高効率CMOSカメラ10を使用してエピ蛍光マクロスコープで行われます。これらのセットアップは、頭蓋骨表面の下1〜2ミリメートルまでのPVSを解決することができ、頭蓋骨を完全に無傷の10のままにしながら、皮質表面の下に5〜6ミリメートルまでの蛍煙を検出することができます。励起波長を素早く調整できるマルチバンドフィルタとLEDにより、複数の蛍光色素を使用することで、CSFは同じ実験で異なる分子量と化学的特性のトレーサーで標識することができます。

この手順では、頭蓋骨を露出させ、イメージングセッション中に頭部を安定させるために軽量ヘッドプレートを配置する簡単で最小限に侵襲的な手術が必要です。トレーサーは、頭蓋骨に穴をあけたり、ピペットまたはカニューレ9、20で皮質組織を貫通することなく、CMに送達することができます。CMカニューレとヘッドプレートの両方が数日間安定したままで、古典的なエンドポイントビジュアライゼーションと比較して、より複雑な実験設計を容易にします。このプロトコルは、麻酔/睡眠または覚醒マウスのCMに蛍光CSFトレーサーの急性または慢性注射後のリンパ系機能を研究するために経頭蓋マクロスコピックイメージングを使用する方法を説明する。

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プロトコル

すべての実験は、ロチェスター大学の動物資源に関する大学委員会(UCAR、プロトコルNo.2011-023)によって承認され、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って行われました。

1. シスターナマグナカニューレ、ヘッドプレート、ヘッドホルダーの準備

  1. 手術前にすべての手術器具とヘッドプレートを殺菌します。
    注:蛍光トレーサーは、シスターナマグナカニュレーションを介してCSFに直接送達されます。この手順の詳細については、Xavier et al9を参照してください。
  2. 簡単に言えば、針の運転手を使用して、30G x 12.7 mm (1/2インチ) 針の先端を折り、3/4の道を下り、針の鈍い端をポリエチレン10(PE10)チューブの一端(長さ約45cm)に置きます。PE10 チューブの境界からベベルだけが突き出ていることを確認します。
  3. 別の30G針の斜め端の1/4を切り離し、残りの針の鈍い端をPE10チューブのもう一方の端に置き、プラスチックLuerロックがまだ取り付けられています。
  4. 無菌、人工CSF(aCSF:126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO 4、2mM MgSO 4、2 mM CaCl 2、10 mM CCl2、および26 mM NaHCO3)で100 μLガラスシリンジを充填します。
  5. 注射器をラインの端に取り付け、ベバリング針の先端に達するまでaCSFで満たします。空気カラムは可変注入量になりやすいため、注射器は空気ではなくaCSFでバックフィルすることが重要です。
  6. 慢性的な実験の場合は、aCSF で満たされた線を残し、ステップ 1.7 をスキップします。
  7. 急性実験の場合は、注射器を注入ポンプに置き、約5mmの空気を取り出し、混合を防ぎます。その後、実験に必要なトレーサーの総体積を撤回します(デッドスペースの損失のために20%の余分な値が推奨されます)。
    注:PE10チューブは、トレーサーの積み込み時にガラスシリンジのプラスチックカフに気泡が入らないように十分な長さでなければなりません。典型的な実験では、プロトコルは0.5%でaCSFで希釈されたアレクサフルオール647(BSA-647)に結合したウシ血清アルブミンの10 μLを使用する。
  8. ヘッドプレートがヘッドホルダーに収まり、使用するマウスに適したサイズであることを確認します。これを確実にするための解剖学的マーカー:窓の上の境界線は眼間線に合わせ、後縁は後頭部に向かいます。
    注:ステンレス鋼の頭部版は殺菌され、再利用することができる。ほとんどのシアノクリレート混合物は、アセトン溶液で除去することができる。

2. 外科的処置

  1. マウスの重量を量り麻酔する(例えばケタミン/キシラジン;100mg/kgケタミン、10mg/kgキシラジン;i.p.)。
  2. マウスがつま先のピンチに反応しなくなったら、首と頭を無菌の水で湿らせて、バリカンを使って剃ります。領域を剃ったら、残りの髪を取り除くために、アルコール綿棒で再び領域を拭きます。
    注:クリッピングの前に毛皮を湿らせると、切開後のイメージングウィンドウの毛髪の量が劇的に減少します。
  3. 温度制御されたパッドの上に立体フレームにマウスを置き、乾燥しないようにマウスの目に石油眼科のオトレットを適用します。
  4. 露出した皮膚をクロルヘキシジン綿棒できれいにします。2分後、アルコール拭きでクロルヘキシジンを取り出します。最後に、乾燥したままにすることができるヨウ素溶液を適用します。
  5. 皮下鎮薬(0.25%ブピバカインHCl)を頭蓋骨と首の上部に注入する。
  6. 後頭紋を覆う首の部分から始めて、上の皮膚に中間線をカットし、軌道間線に向かってロスタカルに続けます。側頭筋が頭蓋骨に挿入される境界に横に切開する。前頭骨と頭頂部骨の両方を露出させるために、フシフォーム切開のすべての皮膚を取り除きます。
    注意:後世の静脈の目と大きな枝に後回りの胸部が横たわっています。これらの構造をスペアに切開する場合は注意してください。これが発生した場合は、無菌綿棒で止血を数分間維持して出血を停止し、続行します。
  7. 生理食生理食べ物で頭蓋骨を灌漑し、綿棒を使用して表面をきれいにし、画像の品質に干渉するので、破片や髪の毛がないようにします。頭蓋骨の透明度は、骨膜を残し、鼻隠しをそのままにしておくと、最もよく保存されます。
    注:これらの構造が誤って除去された場合、頭蓋骨は時間の経過とともに乾燥し、不透明になる可能性があります。aCSFで再湿らせるか、または急性実験21で頭蓋骨反射率を減らすためにパラフィン油とグリセロールの混合物を使用する。
  8. シスターナマグナカニューレの挿入に進む - この手順の外科的詳細については、Xavier et al9を参照してください。
  9. CMカニューレを挿入した後、国境の周りのヘッドプレートの腹部側にシアノクリレート接着剤を持つ歯科セメントの混合物を適用し、頭板の前縁が鼻骨とpoの後部先端と一致するように頭蓋骨の上に置きます。ステリア境界線は、腹間骨の前側の側面に整列し、矢状縫合糸(中線)が窓に対して中央に配置され、直線であることを確認します(図1B)。
  10. 接着剤アクセラレータのカップル滴を使用して、ヘッドプレートの位置を修正します。セメント混合物で残りのギャップを埋め、加速器でそれを治します。
    注意: シアノクリレートがマウスの目に接触したり、イメージング ウィンドウをブロックしたりしていないことを確認します。
  11. CMカニューレをヘッドプレートに接着して、輸送中やマウスが目を覚ますと、これらが取り外されないようにします。
  12. 急性実験の場合は、ステップ 2.16 に進み、次の手順に進み、手順を進めます。
  13. 慢性的な実験では、露出した頭蓋骨に透明乾燥シアノクリレート接着剤の薄い層を適用し、これらはイメージングを妨げるので気泡を作成しないように注意してください。接着剤は頭蓋骨の保護を提供し、イメージ投射を妨げない。接着剤が切開境界の皮膚まで露出した頭蓋骨を覆っていることを確認してください。
  14. ACSF充填PE10チューブをCMから2~3cm保持し、高温焼灼先端でラインを切るヘモスタットクランプを使用します。分離したら、溶かしたPE10チューブを平らにしてカニューレを密封します。
    注意:カニューレが密封されるまでクランプを離さないことを確認し、CSF瘻を防ぐためにチューブに漏れがないことを確認してください。
  15. カルプロフェン(3日間24時間毎に5mg/kg、i.p.またはs.c.)を投与し、マウスを温度管理されたシングルハウスケージに戻し、イメージングの前に少なくとも24時間回復できるようにします。それは厳しい回復を維持するために十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。無傷の頭蓋の窓は数週間安定したままである。
    注:慢性的な実験はここで一時停止することができます。
    注意: 術後合併症の中には、頭頸腫/下気腫、CSF瘻、感染症などがある。
  16. 急性実験の場合は、頭蓋を使用してマウスをヘッドホルダーに入れ、頭蓋骨が固定された位置に置きます。麻酔レベルを確認し、マウスの下に加熱パッドを配置してください。これで、マウスをマクロ スコープに取り込む準備が整いました。
    注意:慎重にカート上の注入ポンプと一緒にマウスを輸送します。CMのカニテーションが脱落すると、頭蓋内圧の低下を引き起こし、CSFリークによって実験結果が変わる。

3. イメージング用マウスの準備

注: プロトコルは、画像化実験が麻酔(ステップ3.1で開始)または目を覚ます(ステップ3.2で開始)マウスで実行されるかどうかによって異なります。

  1. 麻酔マウス
    1. ヘッドホルダーをマクロスコープのステージに置き、シリンジポンプからCMカニューレまでのラインにキンクがないことを確認し、トレーサー注入に影響を与える可能性があるため、タウトがないことを確認します。
    2. 粘膜の呼吸数とピンク色を観察し、良好な酸素化を示します。必要に応じて水和レベルを確保するために皮下に生理生理を注入する。動物が十分に麻酔され、必要に応じて再用量であることを確認してください。
    3. マクロスコープカメラとLEDをオンにし、LIVEモードを開始します。
    4. フィールド上部のナソフロント縫合糸と下部のラムドイド縫合糸を、矢状縫合糸を平行にして画像の中央に中央に配置して、画像フィールドの拡大を確認します(図1C)。ヘッドホルダーをテープでマクロスコープステージに固定します。
    5. 露出した頭蓋骨にマクロスコープを合わせます。被写界深度が比較的大きいマクロスコープにもかかわらず、マウスの頭蓋骨の曲率は特定の領域に焦点を合わせるだけです。最良の結果は、焦点面が冠状縫合糸の後部の頭蓋骨の側面に位置する場合に得られる。
      注:これは、ほとんどのCSF流入が発生する中大脳動脈(MCA)の位置です(図1D,E)10.
  2. 目覚めマウス
    1. イメージングセッションの前に、動物がヘッドプレート手術から少なくとも24時間回復してみましょう。より長い回復期間(5-7日)もお勧めします。この間、回復期間中、1日あたり0.5〜1時間、拘束管のステージに固定されるマウスを訓練する。
      注:習慣は、マウスが麻酔なしでヘッドホルダーに取り付けることを可能にし、実際の実験中にストレスや不安を軽減します。これが実現不可能であり、麻酔が実験を妨げない場合、吸入麻酔薬の誘導用量(例えば、1-2 L/min O2流量でイソムラン2%)を使用して、マウスを頭部ステージに素早く取り付けることができる。
    2. マウスをヘッドホルダーと拘束管に固定したら、手順 3.1.1-3.1.5 に従います。

4. 蛍光CSFトレーサーの注入

  1. 急性CMカヌレーション
    1. トレーサーはステップ1.6のシスターナマグナに置かれる前に既にカニューレにロードされていたので、注入ポンプを所望の速度および容積に置く。日常的に使用される注入パラダイムは、1-2 μL/minで5-10 μLですが、これらのパラメータは、特定の実験、または動物のサイズと年齢に応じて調整することができます。
  2. 慢性CMカヌレーション
    1. イメージング セッションを開始する前に、急性実験の手順 1.2-1.7 に従って、トレーサーを提供する注入ラインを準備します。
    2. ラインが準備されたら、止膜クランプを使用して、慢性CMカニューレの密閉端をカットした。ステップ4.2.1で調製したラインから針を取り、カニューレにそっと挿入します。クランプを解放し、シリンジポンプを使用して、トレーサーがCMに埋め込まれた針に達するまで実験のために所望の注入速度(例えば、2 μL/min)でCSFトレーサーを進める。
      注意:ラインを接続するときに針がチューブを貫通する場合は、針を取り外し、ピアスセグメントをカットし、この手順を繰り返します。PE10チューブの裂け目は漏れを引き起こし、実験結果に影響を与えます。

5. イメージング セッションの設定

  1. 注入される蛍光トレーサーに基づいて、各チャネルの励起波長と露光時間を決定する。タイムラプスイメージングの時間分解能を最大化するために、トレーサーを視覚化するために必要な最短の露出時間を選択します。この露光時間は、異なる動物間のCSF輸送を比較することを目的としたすべての後続の実験に使用されます。
    注: 1 つのヒントは、CM ラインのトレーサーを使用して露出時間を調整することです。これは便利な最初のアプローチですが、時間の経過とわりなって最適化する必要があります。
  2. 実験の期間と画像を取得する間隔を選択します。実験は通常、リンパ輸送のどの段階が関心があるかに応じて30〜60分の間続く。1フレーム/分以上のフレームレートは、ほとんどの実験で十分です。
  3. ファイル名と保存ディレクトリを設定します。
  4. 画像化が他の変数(例えば、心電図、動脈血圧、電気生理学)の同時取得に加えて収集される場合、マクロスコープおよびポンプは、データ集録ソフトウェアによってトリガされるプログラムされることができる。次の手順に進む前に、マクロスコープのトリガー機能が正しいことを確認してください。

6. 経頭蓋光学イメージング実験

  1. トレーサー注入とイメージングを同時に開始します。
  2. CMカニューレとPE10チューブを定期的にチェックして、漏れの兆候がないか確認してください。CM でトレーサーがリークしている場合は、この実験の結果を除外する必要があります。
    注:トレーサーが小脳に蓄積し始め、MCAのリンパ経路を移動しない場合、CMカニューレが小脳に注入された可能性が高い。このデータは含めるべきではありません。
  3. 急性実験の場合は、実験終了後、顕微鏡からマウスを取り出し、まだ十分な麻酔が行われていることを確認します。迅速にマウスを切断し、脳組織を収穫します。4%パラホルムアルデヒド(PFA)で脳を4°Cで一晩浸漬します。
    1. 慢性実験の場合は、イメージングが完了したら、カニューレからCMラインを取り出し、無菌aCSFでフラッシュし、高温焼灼先端でCMカニューレを再シールします。ヘッドスタンドからマウスを取り外し、ケージに戻します。さらなるイメージングが不要になるまでこの手順を繰り返し、手順 6.3 に従います。

7. データ分析

注: CSF フロント トラッキングなどの Matlab ベースの分析では、これらのイメージング データセット10,22のトレーサーフロントから大量の定量データを抽出できます。しかし、これらのファイルタイプは、フィジー23のようなオープンソースの画像解析ソフトウェアで簡単にインポートして分析することもできます。

  1. バイオフォーマットインポートツールを使用して、画像スタックをフィジーにインポートします。この関数は、時間とピクセルの解像度を含むファイル メタデータを保持します。イメージ スタックを .tiff ファイルとして保存します。
  2. ポリゴン選択ツールを使用して、頭蓋骨または対象領域の周囲に関心のある領域(ROI)を手動で描画します。例えば、図1Gでは、外傷性脳損傷後のイプシタルと反対半球に対してROIが別々に描かれました。ROIマネージャ(分析>ツール>ROIマネージャ) にROIを追加して保存してください。
    注:CSF輸送は、2つの主な方法で定量することができる:1)時間の経過に対する蛍光強度を意味するか、または2)しきい値を適用した後、ROIまたは総面積(mm2)のパーセンテージとして表される流入領域。後者の方法(図1H)については、次のステップで説明する。
  3. 最大蛍光を持つフレームのしきい値を設定します([画像]を選択します。;[しきい値を調整]を選択します)。大津のような自動しきい値法は、通常、CSFトレーサの検出が得意です。しきい値を適用します。
  4. 先に進む前に、[測定値を解析];[測定]でオプションの面積と面積の分数が選択されていることを確認してください。次に、ROIマネージャで、[その他]を選択します。
  5. 出力から ROI の面積値を使用して%エリア値を mm2に変換します。%エリア値は、CSF トレーサーを使用した後皮質サーフェスのパーセントを反映します。
  6. 時間の関数として mm2で CSF トレーサーの流入をプロットします。

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結果

CSF流入は、マウス皮質におけるCSFトレーサー輸送のメソスコピックイメージングを可能にするエピ蛍光マクロスコープ(図1A)上で画像化される。全頭蓋骨の頭部プレートは、中心の前頭骨と頭頂部骨の両方、および頭間骨のrostral部分を口頭で視覚化することができる(図1B)。イメージング中に、ナソフロント、矢状、冠状、およびラムドイド縫合糸を容易に同定することができる(図1C)。CSFトレーサーのCMへの注入が始まると(図1D)、基底槽、オルファクト前頭水槽、および松間凹部付近の四肢骨槽のくも膜下CSFの大きなプールでトレーサー蛍光が最初に見られる(図1E)、左)。CSFトレーサーは、中大脳動脈(MCA)の皮質動脈の血管領域に沿って脳に入る(図1E、

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ディスカッション

我々は、市販の蛍光マクロスコープおよびトレーサーを用いて生きたマウスで経頭蓋CSFイメージングを行うための詳細なプロトコルを説明した。この技術は、シンプルで最小限に侵略的でありながら定量的です。生体内イメージングでは、CM送達後に3つのH-dextranおよび14 C-inulinを含む無線標識トレーサーの液体シンチレーション計数などの敏感な方法と相関し、およびex vivo冠動脈定量10と相関する。 18.2光子顕微鏡での検証は、マクロスコープの下で皮質血管に沿って見られるCSFトレーサーが、主にMCAおよびその分岐10の血管領域内に位置することを示している。これらのCSF流入経路は、リンパ系19の重要な構成要素である。このプロトコルではカバーされていないが、これらのセットアップはまた、髄膜および頸部リンパ節25、26などのCSFクリアランス経路を画像化するために使用することができ...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、神経障害と脳卒中の国立研究所と老化に関する国立研究所(米国国立衛生研究所;)R01NS100366およびRF1AG057575からMNへ、フォンダシオン・レダック大西洋横断ネットワーク・オブ・エクセレンス・プログラム、およびEU Horizon 2020の研究とイノベーション・プログラム(助成金第666881号;SVDs@ターゲット)。また、グラフィックイラストのエキスパートの支援をダン・シュエに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% ブピバカイン HClロチェスター大学 ビバリウム
100 & マイクロ;L ガスタイト シリンジ モデル 1710 TLL、PTFE ルアー ロックハミルトン カンパニー81020
AMシステム デンタルセメントパウダーフィッシャーサイエンティフィックNC9991371
カルプロフェンロチェスター大学 ビバリウム
クロルヘキシジンプレバンティクスB10800
CMOS カメラ浜松オルカ フラッシュ 4.0
ヘッドプレートロチェスター大学カタログなし #ロチェスター大学機械工場でカスタムメイド
高温焼灼Bovie Medical CorporationAA01
インスタセット アクセラレータボブ・スミス・インダストリーBSI-151
イソフルラン - フルリソ獣医 One502017ロチェスター大学 ビバリウム
ケタミンストロングメモリアル病院薬局
Krazyエルマーの製品、株式会社カタログ#なし、コメントのリンクを参照してくださいhttps://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore外科テープフィッシャーサイエンティフィック19-027-761
パラホルムアルデヒドシグマ-aldrichP6148
PE10 - ポリエチレン.011 "×.024"フィートあたり、100ft. 連続Braintree ScientificPE10 100 FT
ポンプ 11 エリート 注入のみ デュアル シリンジハーバード 装置70-4501
PURALUBE VET 軟膏Dechra
ピューリタン PurSwab コットンチップ クリーニング スティックフィッシャー サイエンティフィ22-029-553
研究 マクロ ズーム顕微鏡オリンパスMVX10
シンプルヘッドホルダープレート(マウス用)Narishige International USA IncMAG-1
使い捨て針、BD MedicalVWRBD305106
滅菌アルコール調製パッドフィッシャーサイエンティフィック22-363-750
チューナブルLEDPRIOR ルーメン 1600-LED
キシラジンロチェスター大学ビバリウム
ー ズ 接着剤ック

参考文献

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