CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。
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方法論記事
哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール
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この記事について
サマリー
要約
CRISPR-Casシステムを用いてゲノム編集を行い、様々な生物のゲノムを精密に編集する能力を大幅に向上させています。哺乳類細胞の文脈では、この技術は、機能的ゲノミクス研究のためのゲノム全体の遺伝的スクリーンを実行するための新しい手段を表す。すべての開いた読み取りフレームを標的とするガイドRNA(sgRNA)のライブラリは、遺伝子機能および細胞プロセスを含む特定の表現型をスクリーニングすることができる細胞の単一プール内の何千もの遺伝的摂動の顔の生成を可能にする公平で体系的な方法。CRISPR-Casスクリーンは、細胞の型示体の遺伝的青写真を明らかにするために、簡単で効率的で安価な方法を研究者に提供します。さらに、様々な細胞株や異なるがんタイプから行われるスクリーンの微分解析により、腫瘍細胞に文脈的に不可欠な遺伝子を同定し、特定の抗癌治療の潜在的な標的を明らかにすることができます。ヒト細胞でゲノム全体のスクリーンを実行することは、数千万個の細胞の処理を伴い、大規模なデータセットの分析を必要とするので、困難な場合があります。セルラインの特性認識、CRISPR ライブラリの考慮事項、解析中の CRISPR テクノロジの制限と機能の理解など、これらの画面の詳細は見落とされることがよくあります。ここでは、プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9ベースの画面の正常なパフォーマンスのための詳細なプロトコルを提供します。
概要
CRISPR-Casは、クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピートおよびCRISPR関連ヌクレアーゼの略で、合成ガイドRNA(sgRNA)と複合体内の単一のヌクレアーゼタンパク質(例えば、Cas9)から構成される。このリボヌクレオタンパク質複合体は、Cas9酵素を標的とし、特定のゲノム遺伝子座1で二本鎖DNA破断を誘導する。二本鎖の切断は、相同性指向修復(HDR)を介して修復することができ、より一般的には、非相同エンド結合(NHEJ)を介して、遺伝子機能を頻繁に破壊する挿入および/または欠失(INDELS)をもたらすエラーが発生しやすい修復メカニズム1.CRISPRの効率性とシンプルさは、以前のゲノム編集技術(すなわち、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZNF)または転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ()をはるかに上回る、これまで達成不可能なレベルのゲノムターゲティングを可能にします。TALENS)は、いずれも設計の複雑さの増大、トランスフェクション効率の低下、多重遺伝子編集2の限界に苦しんでいる。
CRISPRシングルガイドRNAベースのゲノム編集の基礎研究アプリケーションは、科学者が効率的かつ安価に個々の遺伝子の機能と遺伝的相互作用ネットワークのトポロジーを問うことを可能にしました。機能的ゲノムワイドスクリーンを実行する能力は、特にRNA干渉(RNAi)や遺伝子トラップ変異などの以前の遺伝的摂動技術と比較した場合、CRISPR-Casシステムの使用によって大幅に強化されました。特に、RNAiは高いオフターゲット効果と不完全なノックダウンに苦しんでおり、CRISPR3、4、5に比べて感度と特異性が低く、遺伝子トラップ法はハプロイドでのみ実現可能です。機能喪失画面のセルは、尋問可能なセルモデルの範囲を制限する 6.完全な遺伝子ノックアウトを生成するCRISPRの能力は、低ノイズ、最小限のオフターゲット効果と試薬5全体の一貫した活性で、変異型の現象型を調知するためのより生物学的に堅牢なシステムを提供します。ヒトゲノム全体を標的とするCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーが広く利用可能となり、1回の実験で何千もの遺伝子ノックアウトを同時に生成できる3、7、8、9.
トロントノックアウト(TKO)ライブラリー(Addgeneを通じて入手可能)と呼ばれる独自のCRISPR-Cas9ゲノムワイドsgRNAレンチウイルスライブラリを開発し、高解像度機能ゲノミクススクリーンを容易にするためにコンパクトでシーケンス最適化されています。最新のライブラリTKOv3は、経験データ10を使用して効率を編集するために最適化された71,090ガイドを持つ〜18,000人のヒトタンパク質コード遺伝子を対象としています。さらに、TKOv3は、単一のベクター上でCas9およびsgRNAを発現する1成分ライブラリ(LCV2:TKOv3、Addgene ID#90294)として利用可能であり、安定したCas9発現細胞を生成する必要性を緩和し、幅広いゲノムワイドノックアウトを可能にする。哺乳類細胞型。TKOv3は、Cas9(pLCKO2::TKOv3、アディジーンID#125517)を持たないベクターでも利用可能であり、Cas911を発現する細胞で利用することができる。
ゲノム全体のCRISPR-Cas9編集細胞集団は、次世代シーケンシングによって時間の経過とともに定量化されたsgRNAの豊富さと異なる増殖条件にさらされる可能性があります。摂 動。CRISPRノックアウトライブラリーは、摂動時に細胞フィットネス欠陥を引き起こし、中程度の薬物感受性(例えば、感受性または耐性遺伝子)、タンパク質発現を調節する(例えば、レポーター)、または特定の遺伝子を同定するために利用することができる。経路機能および細胞状態12、13、14。例えば、癌細胞株における差動適合性スクリーンは、腫瘍遺伝子および濃縮の枯渇または減少または腫瘍抑制遺伝子3、14、15の増加の両方を同定することができる。同様に、治療薬の中間用量を使用すると、薬剤耐性および感量遺伝子16、17の両方を明らかにすることができる。
ここでは、ライブラリー生成からデータ解析までの哺乳類細胞におけるトロントノックアウトライブラリー(TKOv1またはv3)を用いてゲノムスケールCRISPR-Cas9の機能喪失スクリーニングのための詳細なスクリーニングプロトコルを提供します。このプロトコルは、トロントノックアウトライブラリを使用してスクリーニング用に最適化されていますが、適用でき、すべてのCRISPR sgRNAプールライブラリにスケーラブルにすることができます。
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プロトコル
以下に概説する実験は、研究所の環境保健安全局のガイドラインに従うべきである。
1. プールされたCRISPR sgRNAレンチウイルスライブラリープラスミド増幅
- 既製のCRISPR sgRNAプラスミドDNAライブラリーをTEで50ng/μL(例えば、TKOv3)に希釈します。
- エレクトロコンピテントセルを使用してライブラリを電気ポレートします。以下に説明するように合計4つのエレクトロポレーション反応を設定する。
- 氷上の予め冷やされたキュベット(1.0 mm)に解凍された電気有能な細胞の25 μLに50 ng/μL TKOライブラリの2 μLを追加します。
- 製造元のプロトコルによって提案される最適な設定を使用して電気ポレートします。パルスの10s以内に、975 μLの回収媒体(またはSOC培地)をキュベットに加えます。
- 電ポレートされた細胞を培養管に移し、回収培地の1mLを加える。37°Cで1時間250rpmで揺れるインキュベーターでチューブをインキュベートします。
- ライブラリを盛り上げ、変換効率を推定するために希釈プレートを設定します。
- 回収した細胞の全8mLをプールし、よく混ぜます。プールされた細胞の10 μLを回収媒体の990 μLに移し、800倍の希釈を行い、よく混合します。
- 予め温められた10 cm LB +カルベニシリン(100 μg/L)寒天板に希釈のプレート20 μL。これにより、変換効率の計算に使用される変換体の 40,000 倍の希釈が行われます。
- 各プレート上の回収細胞のプレート400 μLを、合計20個の予温められた15cm LB +カルベニシリン寒天プレートにわたってにわたって行う。30°Cで14-16時間プレートをインキュベートします。
注:この低い温度での成長は長端の反復(LTR)18間の再組み換えを最小にする。 - 変換効率を計算するには、40,000 倍の希釈プレート上のコロニーの数をカウントします (ステップ 1.3.2)。すべてのプレート上のコロニーの合計数を取得するために、40,000 でカウントされたコロニーの数を乗算します。コロニーの合計数が sgRNA あたりの最小 200x コロニーに相当するライブラリー カバレッジを表す場合に続行します (最も最適なのは 500 ~ 1000 倍)。
- 例えば、TKOv3ライブラリー(71,090 sgRNA)の最小コロニー数は1.4 x 107であり、sgRNA当たり200倍のコロニーに相当します。コロニー表現が不十分な場合は、希釈プレート上のコロニー数に基づいてステップ1.2のエレクトロポレーションの数を増やし、最小のライブラリーカバレッジを達成します。
- 以下に説明するようにコロニーを収穫
- 各15cmプレートに、LB+カルベニシリン(100μg/L)培地の7 mLを追加し、細胞拡散機でコロニーを削り取ります。10 mLピペットを使用して、スクローした細胞を無菌1L円錐フラスコまたはボトルに移します。
- もう一度LB +カルベニシリン培地の5 mLでプレートをすすいで、ボトルに溶液を転送します。
- すべてのプレートが20枚のプレートから無菌ボトルに細胞をプールするために繰り返します。
- 集めた細胞を室温(RT)で1時間かき混ぜて混ぜて細胞塊を分解する。細胞を予め計量された遠心ボトルに移し、7,000 x gの遠心分離機をペレット細菌に移し、培体を廃棄する。
- 湿った細胞ペレットを計量し、遠心分離機の重量を減算して、湿ったペレットの最終的な重量を決定します。各カラムが処理できる細菌ペレットの量に応じて、マキシまたはメガスケールのプラスミド精製キットを用いてプラスミドDNAを精製する。
2. 大規模なCRISPR sgRNAライブラリーレンチウイルス産生
注: プロトコルのこのセクションのすべてのステップは、クラス II、タイプ A2 バイオセーフティ キャビネットの BSL2+ 機能で実行されます。
- ウイルスの18 mLは、通常、1つの15センチメートルプレートから収穫される推定に基づいて、ウイルスの生産に必要な15センチメートルプレートの数を計算します。
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結果
ゲノムスケールCRISPRスクリーニングワークフローの概要
図1は、単一の統合イベントと適切なライブラリ表現(通常200~1000)を確保するために、低MOIでCRISPRライブラリーレンチウイルスを持つ標的細胞の感染から始まる、プールされたCRISPRスクリーニング作業フローの概要を示しています。-フォールド)。感染後、細胞は抗生物質ピューロマイシンで処理され、トランスプリケートされた細胞を選択する。選択後、ベースラインT0細胞ペレットを収集し、スクリーニング開始時のライブラリー分布を評価します。遺伝的摂動の不均一な集団で構成される残りの細胞は、遺伝子編集と結果の効果が現れるように、15〜20倍の3〜4日ごとに所望のライブラリー表現で通過する。薬物治療を伴うスクリーンは、通常、細胞がウイルス感染およびピューロマイシン選択から回復した後、T3またはT6で追加さ...
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ディスカッション
使用の簡易性および高い準備性のために、CRISPRの技術は精密なゲノム編集のための選択の用具として広く採用されている。プールされたCRISPRスクリーニングは、単一の実験で何千もの遺伝的摂動を尋問する方法を提供する。プールされたスクリーンでは、sgRNAライブラリは分子バーコードとして機能し、各配列は一意であり、標的遺伝子にマッピングされます。細胞集団からゲノムDNAを分離することにより、目的の表現型を引き起こす遺伝子は、次世代シーケンシングによりsgRNAの存在量を定量することによって決定することができる。サンプル中のsgRNAを定量化するために非常に並列シーケンシング法が利用されるため、複数の独立した細胞集団を同じシーケンシングレーンにプールしてコストを最小限に抑えることができます。
大規模なスクリーニングプロジェクトに着手する前に、適切に特徴付けられており、技術的に最適化されたモデルを持つことが重要です。遺伝的背景、成長速度、および経発効率は、スクリーニングのために細胞株を選択する際に重要な要因です。たとえば、成長率と編集効率によって、モデルのスケーラビリティと技術的適合性が...
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開示事項
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
謝辞
この研究は、ゲノムカナダ、オンタリオ州研究基金、およびカナダ保健研究所(MOP-142375、PJT-148802)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22ミクロンフィルター30 | |||
| °C;Cプレートインキュベーター37 | |||
| °C振盪インキュベーター37 | |||
| °C;C、5% CO2インキュベーター | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N 塩酸溶液 | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% エタノール | |||
| アラマーブルー | サーモフィッシャー サイエンティフィック | DAL1025 | |
| ブルーライトトランスイルミネーター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | G6600 | |
| ウシ血清アルブミン、ヒートショックアイソレーション、フラクションV.最小98%、バイオテクノロジーグレード | バイオショップ | ALB001.250 | |
| ダルベッコのイーグルス修正 ミディアム | ライフテクノロジー | ズ 11995-065 | セル培養培地 |
| エレクトロポレーションキュベット | BTX | 45-0134 | |
| エレクトロポ | レーターBTX | 45-0651 | |
| Enduraエレクトロコンピテントセル | Lucigen | 90293 | |
| ウシ胎児血清 | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T包装細胞 | ATCC | CRL-3216 | 推奨通過番号 <15 |
| 臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン) | シグマ | H9268 | 質導入効率を高めるカチオン性ポリマー |
| 臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン) | |||
| カルベニシリン | |||
| カルベニシリン | |||
| 低分子量DNAラダー | ニューイングランドバイオラボ | N3233S | |
| ナノドロップ分光光度計 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 マスターミックス | ニューイングランドバイオラボ | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | 還元血清培地 |
| プラスミド マキシ精製キット | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (エンベローププラスミド) | Addgene | プラスミド#12259 | レンチウイルスシステム |
| psPAX2 (パッケージングプラスミド) | Addgene | プラスミド #12260 | レンチウイルスシステム |
| ピューロマイシン | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick ゲル抽出キット | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR アッセイ | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit 蛍光光度計 | Q33226 | ||
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C 回収培地 | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | 脂質ベースのトランスフェクション試薬 |
参考文献
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