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Summary

このプロトコルは、EVの降水量、密度勾配超遠心分離、粒子捕捉を組み込むことにより、高効率で歩留まりのあるビリオンから離れた細胞外小胞(EV)を分離し、合理化されたワークフローと開始の削減を可能にします。すべてのEV研究で使用するための再現可能な準備をもたらす容積の条件。

Abstract

今日の細胞外小胞(EV)研究の分野における主要なハードルの1つは、ウイルス感染の設定で精製されたEV製剤を達成する能力です。提示された方法は、EVをバイリオン(すなわち、HIV-1)から分離することを意味し、従来の超遠心分離法と比較して、より高い効率と収率を可能にします。当社のプロトコルには、EVの降水量、密度勾配分離、粒子捕捉の3つのステップが含まれています。下流アッセイ(すなわち、ウェスタンブロット、およびPCR)は、粒子捕捉に続いて直接実行することができる。この方法は、最小限の開始ボリュームの使用を可能にする他の絶縁方法(すなわち、超遠心分離)よりも有利です。さらに、複数の超遠心分離ステップを必要とする代替EV分離方法よりもユーザーフレンドリーです。しかし、この方法は、当社の粒子から無傷のEVを溶出することは困難であるため、機能性EVアッセイの範囲に限られています。さらに、この方法は厳密に研究ベースの設定に合わせて調整され、商業的に実行可能ではありません。

Introduction

細胞外小胞(EV)を中心とした研究、特にエキソソームは、30〜120nmのEVの一種であり、CD81、CD9、CD63の3つのテトラスパニンマーカーの存在を特徴とし、主に分離する方法の開発によって形成されてきた。興味のある小胞を浄化する。多面的なメカニズムを解剖する能力は、幅広い内容、サイズ、および広い範囲の異なる経路を介して生成された小胞の異種集団からなるサンプルを生成する複雑で時間のかかる技術のために妨げられてきた。密度。これはほぼすべてのEV研究の課題ですが、ウイルスやウイルス様粒子(VLP)は対象の小胞と直径が似ているため、ウイルス感染の文脈でEVを研究する際に特に重要です。例えば、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)は直径約100nmで、多くのタイプのEVとほぼ同じ大きさです。このため、これらの問題に対処するための新しい EV 分離ワークフローを設計しました。

EV分離の現在のゴールドスタンダードは超遠心分離です。この技術は、様々な小胞密度を利用して、各^段階1、2で、より高密度粒子と低密度粒子の差動堆積を伴う遠心分離によって小胞を分離することを可能にする。無傷の細胞(10分間300~400xg)、細胞破片(10分間は約2,000×g)、アポトーシス体/大小胞(10分間は約10,000 x g)を除去するには、いくつかの低速遠心分離ステップが必要です。これらの初期精製は、高速超遠心分離(1.5-2時間の100,000-200,000 x g)を堆積物EVに続きます。洗浄工程は、EVの純度をさらに確保するために行われるが、これにより絶縁されたEVの数が減少し、それによって総収^量3、4を低下させる。この方法の有用性は、十分な結果を達成するために、多数のセル(約1 x 10⁸⁾と大きなサンプル容積(> 100 mL)の要件によってさらに制限されます。

増大する懸念に対処するために、親水性ポリマーを用いた小胞の沈殿は、近年有用な技術となっている。ポリエチレングリコール(PEG)またはその他の関連する沈殿試薬は、ユーザーが選択した試薬でサンプルをインキュベートするだけでサンプル内の小胞、ウイルス、タンパク質またはタンパク質RNA凝集体をプルダウンし、その後に単一の低速を使用することができます。遠心分離^1,2,5.我々は以前に、従来の超遠心分離と比較してEVを沈殿させるためにPEGまたは関連する方法を使用すると、著しく高い収^率6をもたらすと報告しました。この戦略は、高速で簡単で、追加の高価な機器を必要とせず、容易にスケーラブルであり、EV構造を保持します。しかし、この方法の無差別な性質のために、得られたサンプルは、フリータンパク質、タンパク質複合体、EVの範囲、およびビリオンを含む様々な製品を含むので、所望の集団1を得るためにさらなる精製を必要^{とする。 、2、7、8}.

様々な降水法から得られるEVの不均一性を克服するために、密度勾配超遠心分離(DG)は、その密度に基づいて粒子をより良く分離するために利用される。この方法は、タンパク質、タンパク質複合体、ウイルスまたはウイルス様粒子(VLP)からのEVの分離を可能にする、iodixanolまたはショ糖などの密度勾配媒体を用いて段階的勾配を用いて行われる。DGはEV亜集団のより正確な分離を可能にすると考えられていたが、現在では様々な小胞の大きさと密度が重なり合うことが知られていることに注意することが重要である。例えば、エキソソームは1.08-1.22 g/mL⁹の浮入密度を持つことが知られており、ゴルジ(COPI+またはクラ^トリン+)から分離された小胞は1.05-1.12 g/mLの密度を持ち、子宮内膜網状(COPII+) 1.18-1.25 g/mL^{1、2、3、4、9で}堆積物。さらに、外染分分をウイルス粒子を含む画分と比較したい場合、目的のウイルスの密度に応じて、HIV-1以外のウイルスが同じで平衡化する可能性が高いウイルスが存在する可能性があります。外染陽性分^画2としての密度。

最後に、下流の可視化と機能的アッセイのためのEV準備の充実は、EV研究に不可欠です。EV濃縮ナノ粒子、具体的には、直径700~800nmの多機能ヒドロゲル粒子の使用は、濃縮EVの準備を達成する上で重要なステップです。彼らは選択性を促進するために多孔質の外ふるい殻によって封入された高い親和性の芳香族餌を有する。本研究で利用されるナノ粒子には、様々な試薬や生体流体からのEVの捕捉を増加させる異なるコア餌(反応性赤120 NT80;チバクロンブルーF3GA NT82)を用いた2つの異なる調製物が含まれる(材料の表を参照)。 )^6,10,11,^12,13,14,15.この粒子は、iodixanol画分、細胞培養上清、血漿、血清、脳脊髄液(CSF)、^尿6、尿などの患者の生体流体を含む多数の出発物質からEVを容易に濃縮します。.

ここで提示する方法は、いくつかの技術を組み合わせることによって、現在のEV浄化技術の効率を向上させる。EVの降水量、密度勾配超遠心分離、粒子捕捉により、ワークフローを合理化し、サンプル要件を低減し、歩留まりを高め、すべてのEV研究で使用するより均質なEVサンプルを得ることができます。この方法は、大きな不要な小胞とVLPを除外する0.22 μmの濾過ステップと、効果的に密度に基づくEV集団全体の分離を含むため、ウイルス感染時のEVおよびその内容の調査に特に有用である。EVをバイリオンから隔離する。

Protocol

1. 細胞外小胞(EV)の濾過と沈殿

1. 感染またはトランスフェクトされた細胞(すなわち、細胞株および/または一次細胞)から培養上清を調製するために、適切な培養培地で37°Cおよび5%CO2で5日間の後期ログ細胞の約10mLを培養する(すなわち、10%の胎児ウシを用いたRPMIまたはDMEM)血清[FBS])。
   注:すべての培養培地試薬はEVを含んでおらず、90分間100,000 x gで血清を事前に遠心分離して購入するか(材料の表を参照)、または社内で調製することができます。このプロトコルは、CEM、Jurkat、293T、U937(未感染ライン)、U1、J1.1、ACH2、HUT102、MT-2(HIV-1およびHTLV-1感染ライン)、複数のトランスフェクト細胞、および原発性骨髄およびT細胞(両方とも)を含む、いくつかの一般的に使用される細胞株で成功しています。感染し、未感染);ただし、このプロトコルは、特殊なメディアまたは培養条件を必要とするセルタイプを含め、あらゆるセルタイプに使用できます。セルの密度は、異なるセルタイプに合わせて最適化する必要がある場合があります。最高密度は、5日後の細胞死を最小限に抑え、使用することをお勧めします。
2. ペレット細胞に5分間3,000 x gで培養を遠心分離し、ペレットを廃棄する。
3. 無菌0.22 μmフィルターを使用して培養上清を濾液を濾液を洗浄し、きれいなチューブに濾液を集める。
4. 濾過された上清にPEG沈殿試薬(1:1比)を同量に加えます。チューブを数回反転させ、均質な混合物を確保する。
   注:渦を起さしないでください。
5. 一晩4°C(O/N)で混合物をインキュベートします。
6. 室温(RT)で30分間1,500xgの遠心混合物を、異種EVペレットを得た。
   注:EV ペレットは、白またはオフホワイトの色で表示されます。
7. EV枯渇培養上清を廃棄する。
8. カルシウムとマグネシウム(PBS)を使用せずに1xリン酸緩衝生理食塩分の150~300μLでEVペレットを再停止し、氷の上に保ちます。

2. 密度勾配の構築

1. 図1Aに示すように、1x PBSでiodixanol密度勾配媒体を混合し、6~18%のiodixanolから1.2%ずつ増加する11種類の1mL密度画分を作成します。
2. 各チューブを混ぜ合わせるために渦。
3. 層密度分画は、図1Bに示すように、分数#18から始まり、分数#6で終わる、あらかじめ洗浄された乾燥したスイングバケット超遠心管チューブに分化する。
   注:すべてのチューブは、10%の漂白スプレーを使用して消毒し、その後、脱イオン水で3倍を洗い流し、勾配画分をロードする前に無菌脱イオン水の最終洗浄を行う必要があります。
4. 超遠心管の層状勾配の上部に再懸濁EVペレット(300 μL)を追加します。
5. 4°Cで100,000 x gで90分間の超遠心分離機。
6. 超遠心管から1mL分画を慎重に取り外し、各画分を新しいマイクロ遠心分離管に移します。

3. ナノ粒子を利用したEV分画の濃縮

1. NT80、NT82、および1x PBSの等しいボリュームを使用して、ナノ粒子の30%スラリーを作成します。
   注:混合物は、均質性を確保するために使用する前に渦内にする必要があります。
2. 密度分画を含む各マイクロ遠心管に30μLのスラリーを加え、それらを数回反転して混合します。
3. EVを濃縮するナノ粒子含有密度画分マイクロ遠心管O/Nを約20rpmで4°Cで回転させる。
4. 遠心分離機密度分画マイクロ遠心管はRTで5分間20,000 x gで。
5. 液体を捨て、1x PBSでEVペレットを2回洗浄します。
   注:ナノ粒子ペレットは、-20°Cで凍結するか、またはすぐに様々な下流アッセイ(すなわち、PCR、ウェスタンブロット、質量分析、および他のアッセイ)に使用することができます。

4. 下流アッセイ用ナノ粒子ペレットの推奨調製

1. RNA分離用
   1. 0.001%ジエチルピロカーボネート(DEPC)で処理したオートクレーブド脱イオン水の50μLでペレットを再中断し、キットメーカーのプロトコルに従ってRNAを分離します。
2. ゲル電気泳動用
   1. レムリバッファーの15 μLでペレットを直接再中断します。
   2. 95°Cで3xを熱し、ボルテックスを3分間穏やかに加熱し、各熱サイクルの間にスピンダウンします。
   3. 20,000 x gで15sの遠心分離サンプルを、すべてのeluted材料を直接ゲルにロードします。
      注:最良の結果を出すために、ゲルに積み込まれる粒子の量を制限し、ゲルを100Vで動かして、残りの粒子がウェルに含まれていることを確認します。
3. トリプシン消化用
   1. 試料のアルキル化およびトリプシン化の前に尿素の20 μLでペレットを再中断する。ナノ粒子は、RTで14,000 x g遠心分離により10分間ペレット化することができ、トリプシン化ペプチドを含むサンプルは、クリーンな回収管に転移することができる。

Representative Results

Discussion

この方法は、EVの歩留まりを高め、分離への組み合わせアプローチを使用してEVからウイルスを分離することを可能にします。比較的大量の出発物質(すなわち、細胞上清)は、沈殿、DG分離、ナノ粒子濃縮によるEV分離前に濾過することができ、最終的な体積は〜30 μLとなり、様々な中で即時使用が可能下流のアッセイ。ナノ粒子濃縮の使用は、従来の超遠心分離に比べて、これらのEV濃縮ナノ粒子がより効率的に小胞を捕捉することが示されており、培養の1mLから小胞の量以上またはそれ以上を生み出すことが示されている。超遠心培養上^清15の10mLに比べて上清。全体的に、記載されたプロトコルは、いくつかのよく知られた技術の組み合わせを含むので、限られた困難を提示する必要があります。しかし、EVを豊富に含むナノ粒子を組み込むには、下流のアッセイや生物学的目標に応じて望ましい結果を達成するためにトラブルシューティングや修正が必要な新しい技術が導入されています。ナノ粒子は、一晩濾過細胞培養上清でインキュベートすることをお勧めします。目的とする標的タンパク質またはRNAがモデル系に存在量が少ない場合、プロトコルは、標的の捕捉を確実にするためにインキュベーション期間を増加させるために適応させることができる。下流アッセイにおけるナノ粒子の利用は、典型的には、各アッセイに対して所望のサンプルバッファー内のペレットを再中断することによって達成することができる。例えば、ナノ粒子は、ウェスタンブロット分析のためにLaemmliバッファーに直接再懸濁させることができる。捕捉された材料は、加熱および渦サイクルを介してSDSのナノ粒子からより効率的にellyで送除されるべきです。タンパク質の適切な分離を達成するためには、ゲルにロードされるナノ粒子の量を制限するために注意する必要があり、ゲルは、残りの粒子がウェルに含まれていることを確認するために約100Vで実行する必要があります。さらに、低分子量タンパク質の可視化のために、一晩の湿った移動は最適な結果を達成する。ナノ粒子の使用は小胞集団の有意な濃縮をもたらすが、粒子から捕捉された材料を溶出させるために追加のステップを取らなければならない。さらに、材料の溶出は、多くの溶出バッファーがEV膜の完全性を損なう可能性があるとして、下流機能アッセイにおけるEVの有用性を制限する可能性があります。ナノ粒子ポストインキュベーションから無傷の小胞を除去するための戦略を設計するために追加の研究が必要です。これらの粒子のもう一つの欠点は、現在の特性の欠如である。粒子の外殻は、高分子量分子を排除するように設計されている。しかし、EVに対する粒子の特定の標的化は行われ、その結果、多くの交絡因子と背景信号が下流アッセイに存在する可能性があります。

記載された方法は、主に実験室の目的のために使用されるべきである。最近では、プラズマやCSFなどの小規模な患者の生体流体からEVを分離する技術や、大規模な商用EV生産など、EVを分離する技術を組み合わせた組み合わせ手法の能力を拡張する代替方法を開発しました。患者材料中のウイルスからEVを分離するために、我々は密度勾配の代わりに利用されるサイズ除外クロマトグラフィー(SEC)カラムの使用を組み込んだ。これらのコラムは使い捨てであり、従って高い封じ込めの実験室で理想的であるという点で有益である。しかし、SECカラムはサイズに応じて粒子を分離するため、この種の分離は、EBOV(〜1 μm)やZIKV(約40nm)などの大型または非常に小さなウイルスの分離にのみ適用可能であり、それぞれEVから分離または分離されます。自由なタンパク質。大規模なEV生産に関しては、近年のろ過ベースの方法、すなわち接線流ろ過(TFF)の進歩により、大量のEVを効率的に分離することが可能になりました。TFFは、ウイルスを含むナノサイズの生体分子の精製に歴史的に使用され、プロトコルの最適化を通じて、このシステム^はEV24、25の単離にうまく適応されています。簡単に言えば、TFFプロセスの間に、サンプル流体は、サイズと分子量に基づいて選択的に小胞を保持する半透過性膜の表面を横切って接線的に流れ、したがって、自由タンパク質および他のからEVを分離することを可能にする生体分子を汚染^{する 26}.超遠心分離と比較すると、TFFは高い歩留まりをもたらし、集約が少^{なく、EV27}のロット間変動を低減することが報告されている。さらに、治療用途のためのEVの良好な製造実践(GMP)グレードの分離のためのTFFの使用も報告されています^28.スケーラビリティと再現性により、今後のEV研究に大きな可能性を秘めています。

ウイルスは、異なるサイズと密度で来るので、問題のウイルスに応じて、このプロトコルの最適化が必要な場合があります。エボラのような非常に大きなウイルス(長さが〜1 μm以上)の場合、単純な濾過は、VLPおよびアポトーシス^体14などの大きな汚染体の大部分を除去するために利用することができる。これにより、EVから離れたウイルスの分離の大部分は、精製のフロントエンドで実行可能になります。しかし、エンテロウイルス(~30nm)、ジカウイルス(~40nm)、B型肝炎ウイルス(約42nm)、C型肝炎ウイルス(約55nm)などの小さなウイルスの場合、さらに下流機能する前に堆積物を決定する必要がある割合分析。粒子径のみのみに基づいて、常に堆積の可能性のある割合を近似することはできません。例えば、直径30nmのポリオウイルスは、分泌オートファゴソーム29、30、31、32、33に封入されることも知られており、左ではなくグラデーションの右側(密度の高い画分)。HIV-1、HTLV-1、および EBOV VlP の場合は、このプロトコルを最適化しましたが、追加のウイルスは、EVから離れて特定の浄化のためのプロトコルを微調整するために特性を付ける必要があります。

ここで概説するプロトコル(図4)は、EV分離のゴールドスタンダード、超遠心分離と比較して、効率性が向上し、出発材料の量が少ないウイルスからEVを初めて分離することを可能にします。この方法は、様々なサンプルサイズ、必要な収率、開始材料タイプ(すなわち、培養上清対患者材料)、および異なるサイズの様々な異なるウイルスを含む、手元の条件に容易に適合させることができる。

Materials

CEM CD4<sup>+</sup> Cells	NIH AIDS Reagent Program	117	CEM
DPBS without Ca and Mg (1x)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	Peak Serum	PS-FB3	Serum
HIV-1 infected U937 Cells	NIH AIDS Reagent Program	165	U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 &micro;m SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059