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方法論記事

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

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DOI：

10.3791/60017

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2019年8月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、低分子ミオシン阻害剤の半高スループットスクリーニングに適合した。この運動アッセイは、384ウェルマイクロプレートフォーマットで実行され、総反応量はウェルあたりわずか20μLです。プラットフォームは、事実上すべてのADP産生酵素に適用可能でなければなりません。

要約

ATPase酵素は、アデノシン三リン酸に蓄積されたフリーエネルギーを利用して、自然に発生しない生体内生化学的プロセスの多種多様を触媒します。これらのタンパク質は、代謝、細胞分裂、環境変化や動きへの応答を含む、本質的に細胞生活のすべての側面に不可欠です。ここで提示されるプロトコルは、低分子ATPase阻害剤の半高スループットスクリーニングに適合したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイについて説明する。このアッセイは、原理の証明として、心臓および骨格筋ミオシンII、2つのアクチン系分子運動ATPasesに適用されている。ATPの加水分解は、アッセイ中の酵素反応によるNADHの酸化に結合する。まず、ATPaseによって生成されたADPは、ピルビン酸キナーゼ(PK)によってATPに再生される。PKは、リンフェノールピルビン酸(PEP)からピルビン酸への移行を並行して触媒する。続いて、ピルビン酸は乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって乳酸に減少し、これはNADHの酸化を並行して触媒する。したがって、ATP濃度の低下は、NADH濃度の低下と直接相関し、それに続いてNADHの本質的な蛍光への変化が続く。PEPが反応系で利用可能である限り、ADP濃度は非常に低いままで、独自の製品によるATPase酵素の阻害を回避する。さらに、ATP濃度はほぼ一定のままであり、線形時間コースを生み出します。蛍光は連続的に監視され、データの品質を容易に推定でき、潜在的なアーティファクト(例えば、化合物の沈殿や熱変化に起因する)をフィルタリングするのに役立ちます。

概要

ミオシンは、真核生物1、2のアクチン細胞骨格のフィラメントに沿って方向運動を生成するためにアデノシン三リン酸(ATP)を加水分解するメカノケミカルエネルギートランスデューサである。それらは、オルガネラの輸送、筋肉収縮または細胞骨格緊張1、2の生成のような様々な細胞内機能に構造的およびキネチ的に適応している。ミオシンスーパーファミリーは、ヒトゲノム3、4における〜12個の異なるミオシンクラスに属する〜40個のミオシン遺伝子によって表される。ミオシンクラスのメンバーは、いくつかの癌、神経障害、骨格筋症、肥大型心筋症5、6などの非常に多様な疾患のセットで様々な役割を果たします。これらの分子モータの生理的・病理学的機能が多いため、様々な条件7の薬剤標的としてますます認知されるようになっているのは驚くべきことではない。最近、新しいミオシン阻害剤8、9、10および活性化剤11の発見において著しい進歩がなされ、既存のものの特性を改善する12、13歳,14歳,15.

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、長い間、サルコプラズマ網状Ca2+ポンプATPase16、DNA修復ATPase Rad54 17、AAA+ などの様々な酵素のATPase活性を測定するために使用されてきました。ATPase p9718または微小管モーターキネシン19.アッセイはATP再生サイクルを採用しています。ATPaseによって生成されたアデノシン二リン酸(ADP)は、ピルビン酸キナーゼ(PK)によってATPに再生され、1分子のホスホエノールピルビン酸(PEP)を平行にピルビン酸に変換します。続いて、ピルビン酸は乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって乳酸に還元される。つまり、NADHの1分子をNADに酸化する。従って、時間の関数としてのNADH濃度の低下はATP加水分解速度に等しい。ATP再生サイクルは、PEP が使用可能である限り、ATP 濃度をほぼ一定に保ち、ADP 濃度を低くします。これは、線形時間コースで、初期反応速度を決定することが容易になり、ADP19による製品阻害を回避するのに役立ちます。NADH結合ATPaseアッセイは既に96ウェルフォーマット20に適合していますが、反応量が多い(約150μL)ため、試薬の需要が高いため比較的高価であり、多数の高速スクリーニングに対応しにくくなります。化合 物。ATPase酵素によって産生されるリン酸塩の検出に依存するマラカイトグリーンアッセイ19、21などの代替方法は、小型化およびハイスループットスクリーニング22に適っていることが証明された。,23歳,24.しかし、エンドポイントアッセイは、フルタイムのコースがない場合に未発見のままであるいくつかのアーティファクト(以下で説明)の影響を受ける可能性が高いです。

ここで、NADH結合ATPaseアッセイは、低分子阻害剤の半高スループットスクリーニング用に最適化されている。骨格および心筋ミオシンIIとミオシン阻害剤ブレビスタチン8、パラ-アミノブルビスタチン13およびパラ-軽トブルビスタチン12は、NADHに依存するアッセイの力を実証するために使用される読み出しとしての蛍光。このプロトコルは、任意のADP産生酵素に焦点を当てたプロジェクトをスクリーニングするのに適しています。

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プロトコル

1. ストックソリューションと試薬の準備

  1. 蒸留水中の結晶性DTTを1000mMの最終濃度に溶解することにより、ジチオスレイトール(DTT)ストック溶液を調作する。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  2. 結晶性ATPを蒸留水中に溶解してATPストック溶液を100mMの最終濃度に調出す。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  3. 70 mM 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)を含む10x NADHバッファーを調製し、10mM MgCl 2、0.9mMエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N、N、N'-四重酢酸(EGTA)、および3mMNaMを調製する。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。4 °Cで保存します。
  4. 10 mM MOPS および 0.1 mM EGTA を含む 1x ミオシン バッファーを準備します。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。4 °Cで保存します。牛血清アルブミン(BSA)とDTTを最終濃度0.1%(w/v%)使用前にそれぞれ1mMです。
  5. 4 mM MOPS、0.1 mM EGTA、2 mM MgCl2、および 3 mM NaN3を含む 1x アクチン バッファを準備します。1 M NaOH 溶液で pH を 7.0 に調整します。4 °Cで保存します。BSA と DTT を最終的な濃度に 0.1% (w/v%)使用前にそれぞれ1mMです。
  6. 結晶性NADHを10倍のNADHバッファーに溶解して、5.5mMの最終濃度に溶解してNADHストック溶液を調作します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  7. 結晶性PEPを10倍のNADHバッファーに溶解して50mMの最終濃度に溶解してPEPストック溶液を調出す。アリコットと-20 °Cで保存します。
  8. グリセロールと10倍のNADHバッファー(50%:50%)の混合物に凍結乾燥LDH粉末を溶解することにより、LDHストック溶液を調作する2000 U/mL の最終濃度に。未溶解タンパク質を除去する溶液を遠心分離する(7,197 x g、20°C、10分)。上清を清潔な遠心管に慎重に移します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  9. グリセロールと10x NADHバッファー(50%:50%)の混合物に凍結乾燥PK粉末を溶解することにより、PKストック溶液を調作10000 U/mL の最終的な濃度に。未溶解タンパク質を除去する溶液を遠心分離する(7,197 x g、20°C、10分)。上清を清潔な遠心管に慎重に移します。アリコットと-20 °Cで保存します。
  10. 凍結乾燥した心臓および骨格筋ミオシンIIサンプルを100μL蒸留水を添加して再構成し、それぞれ〜37.9 μMおよび〜40.8 μMミオシン濃度(モノメリック)に対応する10mg/mLストック溶液を得た。詳細については、製造元の説明を参照してください。
  11. パルディーおよびスプディッチ25によって説明されるウサギの筋肉アセトン粉末からF-アクチンを調製する。

2. 低分子阻害剤のATPase活性と阻害効果の測定

  1. 複合プレートを調べます。
    1. 高品質ジメチルスルホキシド(DMSO)に関心のある化合物を溶解する。
    2. DMSOの10 mM化合物濃度から始まる15ステップのシリアル1:2希釈を作成します。
    3. マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルを384ウェルポリプロピレンプレート(各12.5μL)に移します。1 つのコンパウンド (3 列ではなく) に対して複合プレート上の 2 つの行を使用して、エッジ効果の影響を受ける可能性のあるウェルの数を最小限に抑えます。各化合物の 2 行目の最後の 3 つのウェルを負のコントロールとして使用します (DMSO のみ)。複合希釈には、プレート上の最初と最後の行を使用しないでください。
    4. 純粋な DMSO を最初の行のウェルに転送します(NADH キャリブレーション用に予約)。
    5. 最後の行を正のコントロールに使用します。
      注:DMSOにおける4mM濃度でのパラ-アミノブルビスタチンをここで用いた。
  2. アクチンバッファー内のアクチンストック溶液を希釈することにより、各アッセイプレート(384ウェル黒壁ポリスチレンマイクロプレート)に対して20μM希釈アクチン溶液の4500μLを調製する。5 mLピペットを使用して上下30xをピペットで完全に混合し、アクチンフィラメントを破ることによって粘度と不均一性を低減します。沈殿したタンパク質を除去する溶液を遠心分離し(7,197 x g,20°C,10分)。上清を清潔な遠心管に慎重に移します。
  3. LDHおよびPK酵素を含有するマスターミックス(「酵素ミックス」)を調製する。各アッセイプレートについて、171.4 μLのLDH溶液、171.4 μLのPK溶液、3189.3 μLまたは3252.9 μLのミオシンバッファーを組み合わせて、それぞれ15mLの円錐遠心管で心臓または骨格筋ミオシンIIを含むアッセイを行います。凝集と沈殿を避けるために、この時点でミオシンを追加しないでください。
  4. すべての基板を含むマスターミックス(「基板ミックス」)を調記します。各プレートについて、ATPの162.1 μL、PEPの162.1 μL、NADH溶液の324.1 μLを15 mLの円錐遠心管に組み合わせます。凝集と沈殿を避けるために、この時点でアクチンを追加しないでください。
  5. 250 μM から始まるキャリブレーション用の NADH の 7 ステップのシリアル 1:2 希釈を作成します。
    1. 1.5 mLマイクロ遠心管に257.7 μLのミオシンバッファーを含むNADHストック溶液の12.3 μLを混合します。
    2. アリコート135 μLのミオシンバッファーを7つの1.5 mLマイクロ遠心分離管に入れる。
    3. 第1管から溶液の135μLを第2管に移し、ピペッティングで混合します。7番目のチューブに到達するまで繰り返します。
    4. 最後のチューブを NADH コントロールなし (バッファーのみ) として使用します。
  6. 8チャンネルピペットを使用して、NADHキャリブレーションソリューションの20 μLを三つ編みのアッセイプレートの最初の行に転送します。
  7. 酵素混合物に68 μLの心臓または4.2 μLの骨格筋ミオシンIIを加える。渦は簡単に
  8. 最初の行を除き、調製されたミオシン酵素ミックスの8.4 μLを自動ディスペンサーを用いてアッセイプレートの各ウェルに分配する。
  9. 100 nLピンツールヘッドを装備した自動液体処理システムを使用して、化合物プレートから酵素ミックスを含むアッセイプレートに100 nLの溶液を移します。
  10. マイクロプレートシェーカーを使用して、室温で1分間1分間アッセイプレートを振ります。
  11. 基板ミックスに遠心アクチン溶液の4,052 μLを添加します。渦は簡単に
  12. アクチン基板の11.6 μLをアッセイプレート(第1列を除く)の各ウェルに分配し、自動ディスペンサーを使用して酵素反応を開始します。
  13. マイクロプレートシェーカーを使用して、室温で1分間1分間アッセイプレートを振ります。
  14. アッセイプレートを101 x gで30sで遠心分離します。
  15. プレートリーダーの内部温度が25°Cで安定していることを確認してください。プレートをロードし、別の30sのために振ります。この揺れステップは、各井戸で液体表面の形状を同様にするために必要であり、プレートが測定温度に達する時間を可能にします。
  16. 45秒間隔でプレートをスキャンする30分間NADH蛍光を記録します。380 nm、10 nm 帯域幅励起フィルタ、470 nm、24 nm 帯域幅発光フィルタを 425 nm カットオフダイクロイック ミラーと組み合わせて使用します。高濃度モードで測定を実行します。アッセイを実行する前に、フラッシュ、検出器ゲイン、プレート寸法、測定高さの数を最適化します。
    注:最終アッセイ条件は、300 nM心臓/20 nM骨格筋ミオシンII、10 μMアクチン、40 U/mL LDH、200 U/mL PK、220 μM NADH、1 mM PEP、1mM ATP、1mM ATP 1mM MOPSを含むバッファー内の1mM ATPです(pH = 7.0)、2MMMMg、0.15 mM EGTA、0.1 mg/mL BSA、0.5% (v/v) DMSO および 1 mM DTT.総容積は20 μL/ウェルである。最も高い最終化合物濃度は、0.5%DMSOで50 μM. 20 μMパラ-アミノーブルビスタチンであり、0.5%DMSO単独で負の対照である。すべての測定は三つ三度で行われる。

3. データの分析

  1. 観察された蛍光強度を各ウェルの時間に対してプロットします。
  2. 単純な線形回帰を実行して、各ウェルの蛍光応答の傾きと切片を決定します。勾配は ATP (NADH) 消費率に比例し、インターセプトは測定開始時の NADH 濃度に比例します(t = 0 s)。
  3. NADHの濃度に対してプレートの最初の行で得られたインターセプトをプロットすることにより、NADHのキャリブレーション曲線を構築します。インターセプトが NADH 濃度に直線的に依存していることを確認します。
    注: インターセプトは、t = 0 s で実際の蛍光強度を推定し、t ≥ 0 s で読み取る生蛍光強度の平均よりもはるかに信頼性が高くなります。
  4. 単純な線形回帰を実行して、NADH キャリブレーションラインの勾配と切片を取得します。
    注:インターセプトは蛍光バックグラウンド信号(NADHは存在しない)を記述し、傾斜は特定の実験における1M NADH溶液の外挿/理論蛍光強度に対応します。
  5. 残りのウェルで得られた蛍光応答の傾きをNADHキャリブレーションラインの傾きで除算し、蛍光変化をATP消費率に変換します。
  6. ATP 消費率を阻害剤の濃度に対してプロットします。
  7. 阻害定数を決定するには、適切な統計ソフトウェアを使用して、単純な 1 対 1 結合平衡モデルに対応する次の二次方程式に線量応答データを適合します。
    figure-protocol-1
    ここでYはATP消費率であり、Y分は阻害剤の不在の中でATP消費率であり、Ymaxは100%阻害で理論的なATP消費率であり、KIは阻害定数である。 ,,〔E〕t及び[I]tは、それぞれ酵素(ミオシン)及び阻害剤の総濃度である。

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結果

スクリーニング実験に使用される一般的なプレートレイアウトマップを図 1に示します。最初と最後の行は、NADHキャリブレーションと正の制御(20 μMパラ-アミノーブルビスタチン、0.5%DMSO)のためにそれぞれ予約されています。残りの行(BからO)は、化合物の阻害活性をテストするために使用されます。ここで、DMSO中の10mM化合物濃度から始まる15ステップの連続1:2希釈を調製し、化合物プレートからアッセイプレートに転送し、アッセイプレート上で最も高い最終化合物濃度が50μM(0.5%DMSO)であることを確認する。1つの化合物(48データポイント/化合物)の線量応答曲線を得るために2つの行が使用されます。プレート レイアウト マップは、特定のプロジェクトの特定の目的をサポートするように再設計できることに注意してください。たとえば、多数の化合物の単一点スクリーニングデータを取得する場合、1 つの 384 ウェル プレートで 112 個の化合物をテストし、同じレイアウトを使用して正の制御と N...

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ディスカッション

プロトコルの重要な手順

負の制御のみで複数のプレートを実行することにより、プレートレイアウトを最適化します(阻害剤を使用しないATPase反応)。反応速度のパターンについては、結果を注意深く検査してください。例えば、「非結合」プレートの親水性表面コーティングにおけるエッジ効果および/または欠陥から生じてもよい。パターンが観察される場合は、アーティファクトを最小限に抑えるためにプレートの種類やプレートのレイアウトを変更します。例えば、典型的な用量応答曲線(三重を有する16濃度、合計48点)は、384ウェルプレート上の3列または2列に配置することができる。これらの配置により、それぞれ 6 と 4 のデータ ポイントが生成され、エッジ効果の影響を受ける可能性があります。したがって、行の配置は常に優先されます。

変更とトラブルシューティング

観察された蛍光応答は、反応のフルタイムコース全体を通して線形でなければな...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、国立神経障害研究所と脳卒中研究所と薬物乱用NS096833(CAM)国立研究所からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
384ウェル ローフランジ ブラック フラットボトム ポリスチレン NBS マイクロプレートコーニング3575
ATP (アデノシン 5 プライム 三リン酸二ナトリウム塩水和物)シグマA7699
オーロラ FRD-IB ディスペンサーオーロラ ディスカバリー
00017425 Biomek NXP マルチチャンネル ラボラトリー オートメーション ワークステーションベックマン コールターA31841
ブレビスタチンAMRIN/Aカスタム合成
BSA (ウシ血清アルブミン、プロテアーゼフリー)アクロン バイオテックAK1391 
遠心分離機 5430 R、冷蔵、ローター FA-35-6-30付き エッペンドルフ022620663
遠心分離機 5430、非冷蔵、ローター A-2-MTPエッペンドルフ022620568
DMSO (ジメチルスルホキシド)付き シグマD2650
DTT(DL-ジチオスレイトール) SigmaD5545
E1 ClipTip マルチチャンネルピペット; 384 フォーマット; 8 チャンネルThermo Scientific4672010
E1 ClipTip マルチチャンネルピペット; 96 フォーマット; 8 チャンネルThermo Scientific4672080
EGTA (エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸) シグマE3889
EnVision 2104マルチラベルプレートリーダーPerkinElmer2104-0010
グリセロール SigmaG2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle)SigmaL1254
MgCl2.6H2O (塩化マグネシウム六水和物) シグマM2670
マイクロプレートシェーカーVWR  12620-926 
マイクロプレート、384ウェル、PP、小容量、深井戸、NaturalGreiner Bio-One784201
MOPS(3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸) SigmaM1254
ミオシンモータータンパク質(全長)(ウシ心筋)細胞骨格 MY03
ミオシンモータータンパク質(全長)(ウサギ骨格筋)細胞骨格 MY02
NADH (β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型二ナトリウム塩水和物)SigmaN8129
NaN3 (アジ化ナトリウム) シグマ71289
NaOH(水酸化ナトリウム) シグマS8045
光学フィルター CFP 470/24nm (発光)PerkinElmer2100-5850バーコード 240
光学フィルター Fura2 380/10nm (励起)PerkinElmer2100-5390バーコード 112
光学モジュール: ベータラクタマーゼPerkinElmer2100-4270バーコード 418
OriginPro 2017 ソフトウェアOriginLabN/A
para-AminoblebbistatinAMRIN/Aカスタム合成
para-NitroblebbistatinAMRIN/Aカスタム合成
PEP (ホスホ(エノール)ピルビン酸モノカリウム塩)SigmaP7127
PK (ウサギ筋肉由来ピルビン酸キナーゼ)SigmaP9136
ウサギ筋肉アセトン粉末Pelフリーズバイオロジカルズ41995-2

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低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応
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