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方法論記事

慢性サルモネラ感染誘発性腸線維症

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DOI:

10.3791/60068

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2019年9月22日

 ,  ,  , 
1The Biomedical Research Centre, University of British Columbia

この記事について

サマリー

このプロトコルは、トランスムラール炎症および線維症を含むクローン病の主要な病理学的特徴に似たサルモネラ駆動腸線維症のマウスモデルを記述する。この方法は、C57Bl/6遺伝的背景に維持された変異マウスを使用して線維性転帰を変化させる宿主因子を評価するために使用することができる。

要約

コラーゲンなどの細胞外マトリックスの病理学的蓄積を特徴とする組織線維化は、持続的な炎症および調節不自由な修復の結果である。炎症性腸疾患(IBD)では、線維症は外科的切除以外の有効な治療法がない再発的な狭窄形成につながる。その遅い発症のために、線維症を駆動するプロセスはあまり研究され、ほとんど知られていない。したがって、線維性合併症はIBDにおける大きな課題を表す。このプロトコルでは、C57Bl/6マウスのストレプトマイシン前処理に続いて、ワクチングレードのサルモネラ・チフィムリウムΔAroA変異体が持続病原体化につながる場合に、腸線維症の堅牢な生体内モデルが記載されている。盲党の線維症。Sを準備するための方法論。チフィムリウムΔAroAは、接種、盲腸および脾臓における病原体負荷を定量化し、腸組織におけるコラーゲン沈着を評価することを説明する。この実験的疾患モデルは、CD様腸線維症を増強または悪化させる宿主因子を調べるのに有用である。

概要

潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)は、IBDの2つの主要な形態であり、消化管1、2の慢性および再発性炎症性疾患として特徴付けられる。これらの障害は、患者の生活の質に大きな影響を与えます。IBDの症状には、腹痛、下痢、吐き気、体重減少、発熱、疲労3が含まれる。最近の研究は、疾患病因に寄与する遺伝的および環境的要因を同定しました;このような危険因子は、発光抗原4の転座またはオーバーサンプリングをもたらす上皮障壁の破壊に寄与すると考えられている。その結果、腸管免疫細胞4によって媒介される共生細菌叢に対する異常な炎症反応を開始する。IBD関連合併症の特徴は、関節、皮膚、および肝臓1、2を含む様々な器官に影響を与えるGI管を越えた部位にまで及ぶ可能性がある。UCの特徴は、典型的に結腸1に局在する重症および拡散性炎症を含む。疾患病理学は、表面的な粘膜潰瘍を引き起こす腸の粘膜および粘膜下に影響を与える1.対照的に、CDは、疾患の証拠は一般的に結腸および遠位回腸2に見出されるが、GI管の任意の部分に影響を与えることができる。さらに、CDの炎症は、腸壁2のすべての層に影響を与えるトランスムラルである。

同定されたいくつかのIBD感受性遺伝子は、上皮関バリアまたは免疫の調節不全が疾患進行に重要な寄与因子であることを示すだろう5。単球で発現したヌクレオチドオリゴマー化ドメイン2(NOD2)の変異は、CDに対する感受性の増加と関連していることが見出された。これは、細菌成分の変化した自然免疫検出と疾患6との間のリンクを強調する。より最近のゲノム全体の関連研究(GWAS)は、遺伝的変異を含むIBDの病因に関与する可能性のある追加の経路を明らかにした: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R依存経路適応免疫、MUC1、MUC19、およびPTGER4にリンクされ、腸バリア維持、およびATG16L-媒介オートファジー7、8、9。これらの集団ベースの遺伝学研究は、IBDの理解を高めていますが、感受性アエレレだけでは、慢性疾患3を発症および維持するには不十分である可能性が高い。腸内微生物叢組成の変化および多様性の減少を含む他の非遺伝的要因は、腸の炎症に関連している。しかし、腸ジスビオシスが先行するのか、それとも調節不通免疫応答3の結果なのかは不明である。IBDの病因は不明であるが、腸炎10,11の実験的マウスモデルにより疾患の病因に対する我々の理解が高まっている。これらのモデルは、個々に完全に人間の疾患の複雑さを表すものではありませんが、それらはIBDに関連する可能性のある病態生理学的経路を解明し、暫定的な治療戦略10の検証のために貴重です。 11.このようなマウスモデルは、典型的には、化学的誘導または感染、免疫細胞移植、または遺伝子操作による炎症の開始に依存する。さらに、これらの戦略は、多くの場合、上皮の完全性または先天性または適応免疫の変調における摂動を伴う。

サルモネラ腸セロバーは、ヒトおよびマウスに感染する可能性のある腸内病原体である。摂取後、サルモネラ菌は、上皮、M細胞、または抗原提示細胞12の直接侵入によって腸を植民地化することができる。マウスはSに経口感染した。チフィムリウムは、主に脾臓および腸間膜リンパ節などの全身部位の植民地化をもたらす。.しかしながら、ストレプトマイシンを用いるマウスの前処理は、正常な微生物叢13の宿主保護効果を減少させることによって腸内のサルモネラコロニー化の効率を高める。このモデルの病理学的特徴は、上皮障壁の破壊または潰瘍、顆粒球の募集、および重度の表皮13を含む。あるいは、ワクチングレードSに感染する。チフィムリウムΔAroA変異体は、感染後40日目まで持続する盲腸および結腸の慢性的な植民地化につながる14.S.チフィムリウムΔAroA株は、芳香族アミノ酸の生合成に欠陥を有する;これは変異株の鳥性をレンダリングし、非常に効果的なワクチン15として利用することができる。マウスの経口感染は、Th1-およびTh17-サイトカイン関連炎症反応、広範な組織リモデリング、およびコラーゲン沈着につながる。組織病理学は、TGF-β1、CTGF、およびIGF14などの線維性因子の上昇レベルに関連している。このモデルで報告された経壁状線維瘢痕は、IBDでしばしば観察される厳格な形成を連想させる。サルモネラ菌による線維症の誘導には、サルモネラ病原性島(SPI)-1および2 12によってコードされたウイルスが必要である。重要なのは、このSです。ティンフィムリウムΔAroA感染モデルは、C57/Bl6の背景に維持された変異マウスにおける線維性応答の研究に有用なシステムである。C57/Bl6株はSに非常に敏感である。チフリウムSL1344は、自然抵抗性関連マクロファージタンパク質(NRAMP)-16、17をコードする遺伝子における機能喪失変異による感染である。我々は、IL-17AおよびRORα依存性自然リンパ球細胞が、このモデル18における病因に重要な寄与因子であることを見出した。

CDの主要な合併症は、コラーゲン2、19を含む細胞外マトリックス(ECM)の調節および過剰な沈着である。GI管は再生のための比較的高い容量を有するが、線維瘢痕は、慢性および重度の炎症20、21に関連する未解決の創傷治癒応答のために生じ得る。CDでは、これは重要な臓器障害21、22につながる組織アーキテクチャに有害な影響をもたらす。CDで観察される炎症の経壁の性質は、最終的に対症性狭窄または狭窄形成21に関連する腸壁の肥厚に先行する。CD患者の約3分の1は、この合併症22の腸切除を必要とする。アザチオプリンや抗TNFα生物製剤などの免疫抑制剤の使用が影響を及ぼさないか、外科的介入の要件を控えめに減らすことを考えると、IBDには有効な抗線維療法はありません19,23.線維症は慢性炎症の結果であると考えられているが、線維芽細胞やペリサイトなどの間葉系起源の細胞は、線維瘢痕21、24におけるECMの主要な細胞源であると考えられている。慢性S.チフィムリウムΔAroA感染は、CD様特徴の病因に関する洞察を提供できる腸線維症の堅牢なマウスモデルである。

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プロトコル

すべての動物プロトコルは、ブリティッシュコロンビア大学の動物ケア委員会によって承認されました。

1. マウスの経口ガビングに対するサルモネラ菌の調製 ΔAroA培養

  1. Sの冷凍グリセロールストックから。チフィムリウムΔAroAは、無菌接種ループを有する100μg/mL連鎖マイシンを含むLB寒天を用いて筋板を調出する。37 °Cで一晩インキュベートします。ストリープレートは4°Cで1週間まで保存できます。
  2. 感染の1日前に、2.5mLの水に0.5gのストレプトマイシンを溶解して抗生物質を調剤する。ストレプトマイシン溶液を殺菌するフィルター殺菌後、100μLのストレプトマイシン溶液(20mgストレプトマイシン/用量)を用いて、球根先端の22Gガバゲ針と1mL注射器を用いてマウスを経口的にゲーゲジする。接種ループを使用して、単一のコロニーを持つ培養チューブにLBブロス(50 μg/mLストレプトマイシン)の3mLを接種する。サルモネラ培養を200RPMで振りながら一晩37°Cで好気的にインキュベートする。
  3. 感染の日に、無菌PBSで一晩サルモネラ培養の2連続1/10希釈を行うことによって最終的な感染用量を調剤する。これにより、約3 x 106 CFUを含む100 μLの接種が行われ得られます。
  4. 球根先端の22Gガビンジ針と1 mL注射器を使用して、準備されたサルモネラ菌の100 μLで各マウスをゲージします。
    注:無菌技術を使用してサルモネラ培養を準備します。サルモネラ菌の最終的な接種濃度は、ストレプトマイシンを用いてLB寒天の連続希釈をめっきすることによって確認することができる。S.タイフィムリウムΔAroA株は、マクナグニー教授(kelly@brc.ubc.ca)に連絡することによって得ることができる。

2. 組織におけるサルモネラの負担の評価

  1. 無菌PBSとオートクレーブステンレススチールビーズの1 mLと2 mLの安全ロック、丸底マイクロチューブを準備します。組織のコレクションの前に管の前の重量を量る。
  2. 二酸化炭素暴露により安楽死させたマウスからセカルおよび脾臓組織を切除する。別々のチューブで個々の動物から組織を収集します。組織の重量を決定するために管の重量を量る。
  3. ミキサーミル装置を使用して30 Hzで15分間均質化し、96ウェル2mLメガブロックでウェルあたり900 μLのPBSを転送します。組織のピペット100 μLは、第1のウェルに均質化し、よく混合し、10-6希釈が得られるまで後続のウェルに100μLを加えることによってシリアル希釈を行う。100 μg/mL連鎖細胞を含むLB寒天に三千度の各希釈のプレート10 μL。
  4. 1000 μLサンプルの10μLをめっきしてから平均CFUを100倍に数え、乗算し、適切な希釈係数を算出した。組織重量合計CFUを組織重量で割り、組織のグラム当たりのCFUを決定します。
    注:組織処理中は、すべてのサンプルを氷の上または4°Cに保管してください。組織均質化でシリアル希釈を行う場合は、ワイドオリフィスピペットのヒントを使用してください。PBSを含む96ウェルメガブロックを事前に準備しておきます。

3.ピロシリウス赤染色とコラーゲンの定量。

  1. 10%緩衝ホルマリンで一晩セカル組織を固定し、パラフィン埋め込みの準備をします。前述の25.25ピクロシリウス赤染色のための5-μmのセクションをカットします。
  2. 明視野顕微鏡上の全体のセカル断面の合成画像をキャプチャします。
  3. フィジー (ImageJ) を開き、.tif イメージ ファイルをツールバーにドラッグ アンド ドロップします。
  4. メニュー バーで、[イメージ > タイプ > RGB スタック]を選択して、イメージを赤、緑、青のチャンネルに分割します。パネルの下部にある水平バーをスライドさせて、チャンネルを緑に設定します。
  5. イメージを開く > 調整 > しきい値ツール。任意のバックグラウンド信号を排除するために、最小値と最大制限を調整します。目的のしきい値を設定したら、しきい値ツールを閉じて、[測定値を分析]に移動します。[面積]、[面積の分数]、[しきい値に制限]、および[表示] ラベルをオフにします。
  6. フリーハンド選択またはポリゴン選択ツールのいずれかで組織セクションをゲートし、[分析 > 測定]をクリックしてコラーゲンの正の%領域を測定します。
  7. 組織領域へのコラーゲン染色のための絶対領域陽性を正規化します。
    注:フィジー(ImageJ)は、https://fiji.scでダウンロードできるオープンソースのプログラムです。同じキャプチャ条件(明るさとフォーカス)を持つ画像は、正確な定量化のために同じしきい値の制限を持つ必要があります。選択した組織内に背景染色がある場合は、絶対領域を測定し、組織全体からコラーゲンの陽性領域から差し引きます。

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結果

ストレプトマイシン治療に続いてSに対する経口感染が続く。チフィムリウムΔAroAは、特に盲腸において堅牢な腸の炎症および線維症をもたらす(図1)。盲腸1g当たり108~109CFUの典型的な病原体負担と、脾臓1g当たり104CFUは、感染した動物から回収することができる(図2)。ピクロシリウス赤色染色セカル切片における線維症の評価は、感染後21日目のピーク線維症を示し、病理の多くは42 pi(図3および図4)によって解決される。コラーゲン沈着は腸の粘膜下で最も顕著であり、粘膜の線維症は軽度である。

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ディスカッション

IBDの病因に関する我々の理解は、腸の炎症のマウスモデルによって大幅に強化された。このような個々のモデルは、複雑で多因子性ヒト疾患のすべての特徴を要約するものではないが、疾患進行の主要な特徴を同定するのに有用であった。IBDに関連する線維性の狭窄は、現在の治療が疾患の発症を逆転させるのに効果がないため、主要な満たされていない臨床ニーズのままである。また、腸線維症は、現在の動物モデルの限界のために実験室での研究が困難です。BALB/cマウスにおけるTNBSへの慢性暴露は、IL-13およびTGF-B1シグナル伝達27、28によって駆動される結腸における堅牢なコラーゲン沈着を誘導することが示されている。しかし、腸線維症は、DSS治療、IL-10欠損症、または養子T細胞転写モデルなどの大腸炎の他の日常的に使用される実験室モデルでは一般的に観察されない。Grasslらは、減衰したΔAroA変異サルモネラ株を有するC57Bl6の慢性消化管感染が盲腸12の粘膜および粘膜...

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開示事項

著者は、開示する利益相反を持っていません。

謝辞

私たちは、イングリッドバルタのヒスロジーサービスに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2 mL 丸底安全ロックチューブEppendorf22363344
ステンレス鋼ビーズQiagen69989
PBSGibco10010031
Large-Orifice ピペットチップフィッシャー2707134
2 mL メガブロックプレートSarstedt82.1972.002
強制針FST18061-22
ストレプトマイシン硫酸塩ΣS9137
ミキサーミルRetschMM

参考文献

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