ここでは、ブタ分割角膜ボタンの調製および栽培のためのステップバイステップのプロトコルが提示される。このオルガノ典型的に栽培された臓器培養モデルは、ヒトドナー角膜に匹敵する15日以内の細胞死亡率を示すので、有毒なデキストランを添加することなく非ヒト角膜の長期培養を可能にする最初のモデルを表す。
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この記事について
サマリー
要約
角膜内皮細胞に関する実験的研究は、いくつかの困難に関連している。ヒトドナー角膜は、通常移植に必要とされるため、実験調査に利用できることはほとんどありません。内皮細胞培養は、多くの場合、生体内の状況にうまく翻訳されません。非ヒト角膜の生体構造特性により、栽培中の間の間質腫脹は実質的な角膜内皮細胞損失を引き起こし、長期間培養を行うことが困難となる。デキストランなどの膨張剤は、この応答を打ち消すために使用されます。しかし、それらはまた、著しい内皮細胞損失を引き起こす。そこで、脱膨張剤を必要としない元生体臓器培養モデルが確立された。地元の屠殺場からの豚の目は、分割角膜ボタンを準備するために使用されました。部分的な角膜トレフィン化の後、角膜の外層(上皮、ボウマン層、間質の一部)を除去した。これは、大規模な間質腫脹およびデセメットの膜折りたたみによって誘発される角膜内皮細胞損失を大幅に減少させ、より長い栽培期間を通して、内皮細胞層の一般的な保存を改善する。その後、完全な角膜トレフィン化に続いて、残りの眼球および栽培から分割角膜ボタンを除去した。内皮細胞密度は、軽微小顕微鏡を用いて調製後最大15日目(すなわち、1日目、8日目、15日目)のフォローアップ時間で評価した。使用される調製技術は、より少ない間質組織の腫脹によって可能な内皮細胞層のよりよい保存を可能にし、ヒトドナー角膜に匹敵する分割角膜ボタンのゆっくりと線形減少率をもたらす。この標準化された有機栽培研究モデルは、少なくとも2週間安定した栽培を可能にするため、今後の様々な外的要因の調査に代わる貴重な代替手段である。角膜内皮への影響。
概要
角膜移植手順は、世界で最も一般的に行われる移植1の一つです。ヒトドナー角膜の深刻な不足があるので、ヒト角膜内皮細胞に対処する実験的研究は、ヒト角膜の1を行うことが困難である。しかし、眼内で使用される灌漑液および他の物質の導入、眼科粘弾性装置、ならびに手術器具および技術(例えば、ファコエマル化物化器具および技術、超音波エネルギー)が必要である。臨床使用前の角膜内皮への影響に関する有効かつ広範な調査。
ヒトドナー角膜に代わるものはほとんどない。動物研究モデルは非常に貴重ですが、同時に非常に資源を消費し、ますます倫理的に疑問を持っています。インビトロ細胞培養の主な欠点は、人間の目への限られた翻訳です。細胞培養から得られた結果は、細胞が内皮間葉転移(EMT)を受ける可能性があるため、細胞の極性の喪失および細胞形状および遺伝子の変化によって引き起こされる線維芽細胞様形態を引き起こす可能性があるため、生体内条件に不一致である可能性がある。式2.
以前のex vivoモデルはわずか120時間の栽培期間を報告したのに対し、少なくとも15日間新鮮な豚角膜を培養することによりブタ角膜内皮器官培養モデルを確立する新しい調製技術が最近導入された3
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プロトコル
このプロトコルは、当社の機関の倫理的ガイドラインに従っています。私たちの機関の倫理審査委員会の法令に従って、すべての豚角膜は、地元の屠殺場から得られたので、実験の前に倫理的な承認を得る必要はありませんでした。
1. 臓器文化
- 豚の目を準備します。
- 地元の屠殺場から、死後すぐに取り除かれたが、熱処理の前にブタの目を取得します。研究室に目を運び、数時間以内にそれらを処理します。輸送中は、処理前に室温(約21°C)で目を離してください。
- 目のはさみと大腸菌鉗子を使用して消毒する前に、すべての眼窩の付属体(眼筋、結膜、脂肪組織)を取り除きます。明らかな外傷、外部損傷(ナイフカットなど)、または目に見える角膜の不透明性を持つすべての目を分離して破棄します。
- リン酸緩衝生理食生(PBS)溶液の57mLに7.5%ポビドネヨウ素の3mLを加えて無菌カップに5%ヨウ素-PBS溶液(1:20)を調製する。また、60 mL純粋なPBSを含む別の滅菌カップを調調します。
注:使用されるヨウ素-PBS溶液の総量とカップの大きさは、解剖する角膜の数に依存します。5~6眼は、5%-ヨウ素-PBS溶液の約60mLを適切に消毒する必要があります。 - 5%-ヨウ素-PBS溶液に5~6個の目を入れ、目の表面を適切に消毒するために合計5分間使用します。目の表面が完全に水没し、ヨウ素溶液中に完全に消毒されているこ....
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結果
提示された解剖技術は、間質組織の部分的な除去を意味し、より薄い角膜サンプルをもたらし、したがって、より少ない間質腫脹をもたらす(図1および図2)。より少ない間質の腫脹は角膜内皮に否定的な影響を与えるより少ないせん断およびピンチ力を誘発し、したがって、より低い内皮細胞損失率6を引き起こす。スプリット角膜ボタンは、非分割角膜ボタンおよび全角膜サンプルと比較して、栽培の15日後に有意に保存された内皮細胞層を示し、これは内皮細胞損失の減少とリフォームの数が少ない図(≥4細胞/細胞境界は3つではなく結合)、ロゼット形成(5つ以上の放射状に配置された細胞が1つの場所で会合)、およびアリザリン赤(破壊された)細胞(破壊された)15日後6。
15日間にわた.......
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ディスカッション
このプロトコルは、研究目的6のための標準化され、低コストのexvivo角膜内皮器官培養モデルを表すブタ分割角膜ボタンの調製のための方法を提供する。ブタ分割角膜ボタンは、2週間にわたって眼科で培養されたヒトドナー角膜で観察された内皮細胞損失に匹敵する内皮細胞密度の低下を示した6,10,11, 12.
非分割角膜ボタンおよびブタ角膜全サンプルに対する優位性は、以前に6を示した。その研究では、1日目、8日目、15日目に3つの群を比較した。すべてのグループの角膜内皮(角膜ボタン、非分割角膜ボタン、分割角膜ボタン)は、1日目に良好な状態にあり、保存状態の良好な内皮細胞層6によって表された。しかし、.......
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開示事項
著者は何も開示していない。
謝辞
発表された研究モデルの確立は、ドイツ連邦教育省のKMU-innovativ(FKZ:13GW0037F)によって支援されました。
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材料
2
HOの1 Lあたりの低塩化水ショットブラン) ) カールツァ顕微鏡
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco,米国 | ||
| 子牛胎児血清 | Biochrom GmbH、ドイツ | ||
| 塩酸(HCl)溶液 | 自社生産 | ||
| 張性バランス塩溶液 | 自社生産 | :NaCl 4.9 g;KCl0.75グラム;CaCl x H2O 0.49g;MgCl<サブ>2×H<サブ>2O 0.3g;酢酸ナトリウムx 3 H2O 3.9g;クエン酸ナトリウム×2 H2O 1.7 g | |
| ポビドンヨウ素7.5%、Braunol | B. Braun Melsungen AG、ドイツ | ||
| ナトリウム(NaCl)0.9% | B.ブラウンMelsungen AG、ドイツ | ||
| 酸化ナトリウム(NaOH)溶液 | 自社生産 | ||
| トリパンブルー0.4% | Sigma-Aldrich、米国 | ||
| 材料&Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH、ドイツ | ||
| ビーカーガラス50mL | AG、ドイツ | ||
| トカニューレ(フィルター(5 & micro;m) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| 細胞培養プレート (12ウェル) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| アイシザー | Geuder AG, ドイツ | ||
| 折り畳み式フィルター & 185 mm | Whatman, アメリカ | ||
| ホッケーナイフ | Geuder AG, ドイツ | ||
| ラボラトリー ガラス瓶 キャップ付き 100 mL | Schott AG, ドイツ | ||
| マグネティックスターバー | Carl Roth GmbH & Co. KG, ドイツ | ||
| MillexGV フィルター (5 &マイクロ;m) | Merck Millopore Ltd.、米国 | ||
| Needler holder | Geuder AG、ドイツ | ||
| ペトリ皿 | VWR International、米国 | ||
| ピペットチップ | Sarstedt AG & Co.、ドイツ | ||
| メス(シングルユース)、三角刃 | Aesculap AG & Co. KG、ドイツ | ||
| 血清ピペット 10mL | ザルスタットAG &Co., ドイツ | ||
| 血清学ピペット 5 mL | Sarstedt AG & Co., ドイツ | ||
| 滅菌カップ | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| 滅菌手袋 | Paul Hartmann AG (ドイツ | ||
| ) 滅菌外科用ドレープ | Paul Hartmann AG (ドイツ | ||
| ) ステッチハサミ | Geuder AG (ドイツ | ||
| 縫合糸 Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc. (米国 | ||
| シリンジ (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| トレフィン&オスラッシュ;7.5 mm | 自社生産 | ||
| タイイング鉗子 | Geuder AG、ドイツ | ||
| 計量紙 | neoLab Migge GmbH、ドイツ | ||
| 機器&ソフトウェア | |||
| 双眼手術顕微鏡 | イスAG、ドイツ | ||
| オ | リンパスに取り付けられたカメラ、日本 | ||
| CellSensエントリー(ソフトウェア) | オリンパス、日本 | ||
| 冷光源 | ショットAG、ドイツ | ||
| インキュベーター | ヘレウスGmbH、ドイツ | ||
| 倒立位相差顕微鏡 | Olympus GmbH, ドイツ | ||
| 加熱機能付きマグネチックスターラー | IKA-Werke GmbH & Co. KG, ドイツ | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, アメリカ | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, アメリカ | ||
| 精密スケール | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
参考文献
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. I....
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再版と許可
