物理的および同方性拡張によるヒト組織切片のナノスコピックイメージング

サマリー

臨床組織サンプルのナノスケールイメージングは、疾患病因の理解を向上させることができる。拡張病理学(ExPath)は、標準的な臨床組織サンプルとの互換性のために改変された拡張顕微鏡(ExM)のバージョンであり、従来の回折制限顕微鏡を用いて生体分子のナノスケール構成を探索する。

要約

現代の病理学では、顕微鏡検査は臨床標本の顕微鏡構造を明らかにすることによって疾患診断において重要な役割を果たしている。しかし、基本的な物理的回折限界は、従来の光学イメージングアプローチを使用する場合、ナノスケールの解剖学および微妙な病理学的変化の尋問を防ぐ。ここでは、固定凍結またはホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織の両方を含む一般的なタイプの臨床原発組織標本のナノスケール光学イメージングのための拡張病理学(ExPath)と呼ばれるシンプルで安価なプロトコルを説明します。セクション。この方法は、組織サンプルを組織ヒドロゲルハイブリッドに化学的に変換し、純粋な水中の複数のスケールにわたってそれらを物理的に同位体に拡張することにより、光回折限界を回避します。膨張により、従来の溶解不可能な分子が分離され、従来の光学顕微鏡を用いて観察することができます。

概要

3次元(3D)コンテキストで組織の分子組織を調べると、生物学的機能と疾患の発症に関する新たな理解が可能になります。しかしながら、これらのナノスケール環境は、従来の回折制限顕微鏡(200−300nm)の分解能を超え、最小の溶解可能距離、dはdαλ/NAによって定義 される。ここでλは光の波長であり、NAは撮像システムの数値絞り(NA)である。 近年、新たに開発した超解像画像^{技術1、2、3、}刺激放出を含む蛍光標識分子の直接可視化が可能となった。光活性化局在顕微鏡(PALM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、および構造化イルミネーション顕微鏡(SIM)。これらのイメージング技術は、ナノスケールでの生物学的機能の理解に革命を起こしましたが、実際には、高価な機器や特殊な機器や画像処理ステップに頼ることが多く、取得時間が遅くなる可能性があります。従来の光学イメージングでは、特定の特性を持つ蛍光体(光スイッチング能力や高い光安定性など)が必要です。さらに、組織標本に対して3D超解像イメージングを行うのも課題です。

2015^年4月に初めて導入された拡張顕微鏡検査(ExM)は、膨らむポリ電解質ヒドロゲルに埋め込まれた保存サンプルを物理的に拡張することにより、ナノスケールの特徴(<70 nm)をイメージングする代替手段を提供します。ここで、主要な生体分子および/または標識は、化学処理後に同位体的に拡張することができるポリマーネットワークにその場所に固定される。物理的な膨張は全く有効な分解能を増加させるので、目的の分子は、従来の回折制限されたイメージングシステムを使用して解決することができる。カスタム合成蛍光標識がポリマー^{ネットワーク4}に固定された元のプロトコルの公開以来、新しい戦略は、タンパク質(タンパク質保持ExM、またはproExM)5^{を直接固定するために使用されてきた。6,7,8,9}および RNA^9,10,11,12ヒドロゲルに, 反復を介して物理的な倍率を増加させる^拡張13または適応ゲル化学8、14、15.

ここでは、臨床病理学フォーマット用に最適化された拡張病理学(ExPath)16と呼ばれるproExMの適応バージョンを提示します。このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、ガラススライドに取り付けられた新鮮な凍結ヒト組織標本を含む臨床サンプルをExMと互換性のある状態に変換します。タンパク質は、次にヒドロゲルに固定され、機械的均質化が行われる(^図1)16。サンプルの4倍の線形膨張により、約300nmの分解能しか持たない従来の共焦点顕微鏡を使用して多色超解像(〜70nm)画像を得ることができ、他の超解像イメージング技術と組み合わせることもできます。

プロトコル

1. ストック試薬およびソリューションの準備

1. ゲル化溶液成分を調調します。
   注:溶液濃度は g/mL (w/v%) で与えられます。
   1. 以下のストックソリューションを作る:38%(w/v)アクリル酸ナトリウム(SA)、50%(w/v)アクリルアミド(AA)、2%(w/v)N、N'-メチレベジサクリラム化物(ビス)、および29.2%(w/v)塩化ナトリウム(NaCl)。二重脱イオン水(ddH2 O)に化合物を溶解する。表 1の金額を参照として使用します。準備されたソリューションは、必要に応じてボリュームをスケールアップまたはスケールダウンできます。たとえば、38% (w/v) SA 溶液の 10 mL を作成するには、1.9 g SA を卒業した 10 mL シリンダに追加し、ddH₂O を 5 mL の体積に追加します。
   2. 表 1 に示すように、1.06 倍の濃度でモノマー溶液の 9.4 mL を調出します。
      注:これにより、イニシエータ、加速器、および阻害剤を添加した後に1倍の濃度が得られます。モノマーストックは、最大3ヶ月間、または-20 °Cで長期保存できます。
   3. 以下のストック溶液をddH 2O:0.5%(w/v)の阻害剤4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピピリジン-1-オキシル(4HT)で別々に調製し、ゲル化溶液を組織に拡散させるゲル化を阻害する、10%(v/v)の過硫酸アンモニウム(APS)によるラジカル生成を加速するイニシエーターテトラメチルチレンジアミジン(TEMED)と、ゲル化プロセスを開始する10%(w/v)APS。
      注:4HTおよびTEMEDのストック溶液は1 mLのアリコートで調製し、少なくとも6ヶ月間-20°Cで貯えることができる。APSは、長期保存後に有効性を失うことがわかったとゲル化する直前に少量(<0.1 mL)で調製するのが最適です。
2. 消化バッファー(50 mMトリスpH 8.0、25 mM EDTA、0.5%[w/v]ニオニオニック界面活性剤、0.8M NaCl)を組み合わせて1MトリスpH8(ddH2Oの25mLでトリスベースの3.03g)、EDT(0MT)の25mLを調出す、ニオニオニック界面活性剤の2.25g、NaClの23.38g。合計体積500mLのddH₂Oを追加します。
   注:溶液は必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができ、4 °Cで保存することができます。プロテパネセK(ProK)は消化工程の直前に添加される。
3. 2.941gのク硝酸ナトリウム三塩二水和物_をddH2Oの500mLと組み合わせ、室温(RT)でpHを8.0に調整して、20mMのクレート液を調えます。必要に応じて在庫量を拡大します。
4. 6-(アクリロイル)アミノ酸、スクシニミジルエステル(アクリルX、SE)のストック溶液を調製する。AcX)、アンカー化合物。無水ジメチルスルホキシド(DMSO)の500 μLでAcXを溶解し、最終的な濃度を10mg/mLにします。
   注:溶液は20 μLのアリコートの-20 °Cの乾燥した環境で貯えることができる。
5. 免疫染色のために市販の緩衝液を使用しない場合は、ブロッキングバッファーを調出す。1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で5%(v/v)正常動物血清および0.1%(w/v)のニオニオン界面活性剤のブロッキングバッファーを使用し、二次抗体の宿主動物に基づいて血清を選択する。例えば、ヤギで発生した抗体に対して500mLのブロッキングバッファーを調作するには、ヤギ血清25mL、ニオニオン界面活性剤0.45g、および1x PBSを500mLの体積に組み合わせます。

2. ExPath用のアーカイブおよび新たに作成された臨床組織スライドの調製

1. 組織を ExPath 互換形式に変換します。FFPEスライド、染色されたFFPEスライド、または最適切断温度(OCT)溶液で固定または固定された凍結組織スライド:試料の調製方法に基づいて、次の4つのステップ(2.1.1−2.1.4)のいずれかを選択します。
   注:これらは、病理学サンプルの標準リカバリステップに基づいており、ExPathプロトコルに固有のものではありません。
   1. FFPE臨床サンプル
      1. 95%エタノール、70%エタノール、50%エタノールの30mLを調出します。キシレン、100%エタノール、ddH2 Oの30mLを測定します。
      2. 鉗子を使用して50 mL円錐形でサンプルとスライドを置き、キシレンの15 mLを追加します。チューブをキャップし、約60 rpmで軌道シェーカー上に水平に置き、各溶液のために3分間RTでインキュベートします。残りの 15 mL キシレンを繰り返します。
      3. 100%エタノール、95%エタノール、70%エタノール、50%エタノール、およびキシレンの代わりにddH2 Oを繰り返します。
   2. 染色され、取付けられた永久的なスライド
      1. スライドを100mmペトリ皿に入れ、キシレンで覆います。かみそり刃を使用してカバースリップを慎重に取り外します。カバースリップが簡単に取り外されない場合は、カバースリップが緩むまでスライドをキシレンに戻します。
      2. FFPE サンプルの手順を使用して処理します (手順 2.1.1.1−2.1.1.3)。
         注:H&E染色スライドの場合、膨張プロセス中に汚れが除去されます。
   3. OCT溶液の固定されていない凍結ティッシュスライド
      1. アセトンで組織を-20 °Cで10分間固定します。
      2. RTでそれぞれ10分間、1x PBS溶液でサンプルを3回洗います。
   4. 以前に固定された、凍結された臨床ティッシュのスライド
      1. RTで2分間スライドをインキュベートし、OCT溶液を溶かします。
      2. RTでそれぞれ5分間、1x PBS溶液でサンプルを3回洗います。
2. フォーマット変換後のすべてのサンプルで抗原検索の熱処理を行います。
   1. スライド染色瓶などの耐熱容器に20mMク硝酸溶液(rt時pH8)を添加する。
      注:スライドに取り付けられた組織を覆うのに十分な溶液が必要です(標準的なスライド染色瓶の場合は50 mL)。
   2. クエン酸溶液を電子レンジで100°Cに加熱し、溶液中にスライドを置きます。容器をインキュベーション室に直ちに移し、60°Cで30分間インキュベートします。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。スライドはペトリ皿に置かれ、1x PBSで覆われ、4 °Cで貯えることができる。
3. 標準的な免疫蛍光(IF)/免疫組織化学(IHC)染色プロトコルを使用してサンプルを染色します。
   注:特定の一次および二次抗体濃度および染色期間は、製造業者によって提案された濃度または特定の実験の最適化によって異なります。
   1. 疎水性ペンを使用して、スライド上の組織セクションの周りに境界を描画し、組織を覆うために必要な溶液の量を最小限に抑えます。スライドに合うほど大きな皿にスライドを置きます。標準的な 3 インチスライドの場合は、100 mm ペトリ皿を使用します。
      注:疎水性ペンは、試料の重合や消化プロセスを妨げません。
   2. 37 °Cで1時間、RTで2時間、または一晩4°Cのブロッキングバッファーで組織をインキュベートし、非特異的結合を減らします。
   3. 一次抗体を適量の調製ブロッキングバッファー(または他の好ましい染色バッファー)で所望の濃度に希釈する。一次抗体溶液で組織をRTまたは37°Cで少なくとも3時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
      注:サンプルは、組織が乾燥するのを防ぐために加湿容器(湿った拭き取り付けのペトリ皿など)に入れる必要があります。典型的には、抗体は、使用される組織サイズおよび抗体に応じて、200−500 μLのバッファーで1:100−1:500に希釈されている。
   4. RTで10分間、準備されたブロッキングバッファー(または他の好ましい洗浄バッファー)で組織を3回洗浄する。
   5. 希釈二次抗体(および300 nM 4'、6-ジアミドノ-2-フェニリンドール[DAPI])は、所望のブロッキングバッファー(または他の好ましい染色バッファー)を約10μg/mLの濃度に調製した。二次抗体溶液中の組織をRTまたは37°Cで少なくとも1時間インキュベートする。
      注:タイミングは、使用する抗体および組織の厚さに応じて調整されてもよい。シアニン色素を含む二次抗体(Cy3、Cy5、Alexa 647)は、事前重合を適用した場合、ExMプロトコルと互換性がありません。推奨される色素には、Alexa 488(緑)、Alexa 546(オレンジ/レッド)、およびAtto 647NまたはCF633(遠赤)が含まれます。DAPI は、拡張プロセス中に洗い流されるため、拡張後に再適用する必要があります。
   6. RTで各10分間、準備されたブロッキングバッファー(または他の好ましい洗浄バッファー)で組織を洗浄する。
      注:プロトコルはここで一時停止できます。スライドはペトリ皿に置かれ、1x PBSで覆われ、4 °Cで貯えることができる。
   7. 従来の広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、または選択した他のイメージングシステムを使用して蛍光イメージングを行います。
      注:このステップは、拡張前および拡張後の画像を比較することによって、膨張因子を使用して生物学的長さを決定するために必要である。拡張後のイメージングを容易にするために、関心のある容易に識別可能な領域を選択し、低倍率と高倍率の両方の画像を収集する必要があります。

3. 試料の重合における

1. アンカー溶液で試料をインキュベートします。
   1. 非アルデヒド固定剤で固定されたサンプルの場合は、1x PBSでAcXストック溶液を0.03mg/mL、またはアルデヒド固定剤で固定されたサンプルの場合は0.1mg/mLの濃度に希釈することにより、アンカー溶液(通常は250μLで組織部を覆うのに十分)を準備します。AcXと反応するために利用可能なより少ない自由アミンを持っています。
   2. スライドを100mmペトリ皿に入れ、組織の上に固定液をピペットします。RTで少なくとも3時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
2. ゲル化溶液中のサンプルをインキュベートします。
   1. ゲル化溶液の少なくとも100倍の余分な容積を調製する。200 μLあたり、次の順序で、次の順序で、188 μL のモノマー溶液、4 μL の 0.5% 4HT ストック溶液 (1:50 希釈、最終濃度: 0.01%)、4 μL の 10% TEMED ストック溶液 (1:50 希釈、最終濃度 0.2%)、および 4 μL の 10% APS ストック溶液 (10% APS ストック溶液)。希釈、最終濃度0.2%)
      注:ゲル化溶液は、使用する直前に行う必要があります。溶液は4°Cに保たれ、APS溶液は早期ゲル化を防ぐために最後に追加する必要があります。
   2. 組織部から余分な溶液を取り出し、スライドを100mmペトリ皿に入れます。新鮮な冷たいゲル化溶液を試料に加え、4°Cで30分間組織上の混合物をインキュベートし、溶液を組織に拡散させます。
3. ゲル化溶液を乱すことなく、試料(図2A)の周囲にスライド上にチャンバーを構築する。
   1. ダイヤモンドナイフを使用してカバーガラスの部分を薄く切断することにより、ゲル化室のためのスペーサーを作ります。
      注:イメージングポスト拡張を容易にするために、スペーサーは組織標本に近い厚さで組織の上のブランクゲルの量を減らす必要があります。数1.5ガラスは標準的な臨床サンプル(5−10 μm)のために使用することができる。カバーガラス片は、より厚いサンプルのために積み重ねることができます。
   2. 水滴(約10μL)を使用して、組織の両側のスペーサーを固定します。
   3. スライドの上にカバーガラスの蓋を慎重に置き、組織の上に気泡を閉じ込めないようにしてください(図2B)。
4. 加湿した環境(湿った拭き取りによる閉鎖したペトリ皿など)でサンプルを37°Cで2時間インキュベートします。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。スライドの部屋は4 °Cで密封されたペトリ皿の中に貯えることができる。

4. サンプル消化

1. カバースリップの下にかみそり刃をそっとスライドさせ、ゲル表面からカバースリップをゆっくりと持ち上げて、ゲルチャンバーの蓋を取り外します。体積を最小限に抑えるために、組織の周りのブランクゲルをトリミングします。試料が透明になるので、均質化後のゲルの向きを追跡するために非対称にゲルをカットします。
   1. 使用前に消化バッファー(最終濃度4U/mL)で1:200でProKを希釈する。完全にゲルを浸すのに十分な溶液を準備します。4ウェルプラスチック細胞培養プレートの単一の井戸は、ウェルあたり少なくとも3 mLを必要とします。
   2. 消化バッファーを含む密閉容器にサンプルを60°Cで3時間インキュベートします。消化中にサンプルがスライドから切り離されない場合は、カミソリブレードを使用してサンプルをそっと取り除きます。
      注:試料は消化バッファーに完全に浸し、サンプルが乾燥するのを防ぎ、フィルムで密封できる覆われた容器(小さなスライドボックス、プラスチック井戸、ペトリ皿など)に入れるべきです。

5. サンプルの拡張とイメージング

1. 柔らかいペンキブラシを使用して、目的のイメージングシステムと互換性のある容器で1x PBSに試料を移し、完全に膨張したゲルを収容するのに十分な大きさです。反転したシステムでイメージングする場合は、組織をサンプル側に下に配置するか、直立システムでイメージングを行う場合は、イメージングの目的からサンプルまでの距離を最小限に抑えます。必要に応じて、柔らかいペイントブラシを使用してゲルを裏返します。
   注:LEDからの側面照明は液体でそれらを見えるようにするために使用することができる。標準的な6ウェルプレートは、あらかじめ膨張した直径が0.6cm未満のサンプルを収容できます。ガラス底井戸板は、反転システムでのイメージングに使用する必要があります。
2. RTで1x PBSでサンプルを10分間洗浄します。必要に応じて、消化プロセスがDAPI汚れを洗い流すので、300 nM DAPIでサンプルを再染色します。PBSを除去し、RTで20分間1x PBSで希釈した300 nM DAPIで汚れを取り除き、続いてRTで1x PBSで10分洗浄します。
   注:サンプルは1x PBSで覆われ、次のステップに進む前に4 °Cで貯えることができる。
3. サンプルを拡大するには、PBSを交換し、RTでそれぞれ10分間、ddH₂O(少なくとも最終ゲル体積の少なくとも10倍)の余分な体積で洗浄します。
   注:^3rdまたは4^番目の洗浄の後、標本の膨張は高原に始まるはずです。貯蔵のために、細菌の増殖を防ぐために、ddH2 Oは0.002%−0.01%のアジドナトリウム(NaN3)で補うことができる。この場合、最終的な膨張係数は可逆的に10%減少します。
4. 従来の広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、または選択した他のイメージングシステムを用いて蛍光イメージングを行う。
   注:ゲルが漂流するのを防ぐために、余分な液体を井戸から取り除くことができる。ゲルはまた1.5−2%の低溶融アガローズと固定することができる。1.5−2%(w/v)低溶融アガロースを容器内の水に入れ、溶液の体積の2~4倍を準備します。溶液を40°Cの水浴または電子レンジで10~20秒温めて溶かします。溶けたアガロをゲルの縁の周りにピペット。アガロースをRTまたは4°Cで硬化させる後、脱水を防ぐためにサンプルに水を加えます。

結果

プロトコルが正常に実行された場合(図1)、サンプルは機械的均質化後に平らで透明なゲルとして現れ(図3A)、水中で3−4.5倍の膨張が可能です(図3B)。^5、16を使用した最終的な膨張因子およびイメージングシステムに応じて〜70nmの有効な決断を提供する。図4は、ExPathプロトコルを用いて処理された5μm厚FFPE腎臓サンプルの画像の例を示す。ゲル化したサンプルの完全な膨張は、水中の4.5倍の膨張因子をもたらし、0.95 NA目的を用いて画像化した場合、約63nmの有効な分解能を得た。組織は、まずキシレンで前処理してパラフィンを除去し、水分補給(セクション2.1.1)、続いてクエン酸バッファー(セクション2.2)で抗...

ディスカッション

ここでは、FFPE、H&E染色、ガラススライド上の新鮮な凍結標本を含む病理学で使用される最も一般的なタイプの臨床生検サンプルに適用できるProExM⁵のバリアントであるExPath^{プロトコル16}を提示する。フォーマット変換、抗原検索、および検体の免疫染色は、ExPathに特異的ではない一般的に使用されるプロトコルに従います。元のproExM^{プロトコル9}とは異なり、ExPathは消化バッファー内のEDTAのより高い濃度に依存しており、元のExPath^研究16で示されているように、ホルマリン固定組織の拡張を改善する。このプロトコルは、5−10 μm厚い臨床^標本16で検証されているが、いくつかの改変を伴う厚い組織サンプルにも適用できる。このプロトコルの最も重要なステップは、1)ゲル化ステップのタイミングです。2)ゲル化室のセットアップ。3)サンプル均質化のためのパラメータ;4)ゲルの取り扱い。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-ヒドロキシTEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	阻害剤
6ウェルガラス底板 (#1.5 カバーガラス)	Cellvis	P06-1.5H-N
Aceton	Fischer Scientifc	A18-500
アクリルアミド	Sigma Aldrich	A8887
Acryloyl-X, SE (AcX)	Invitrogen	A20770
アガロース	Fischer Scientifc	BP160-100
過硫酸アンモニウム (APS)	Sigma Aldrich	A3678	イニシエーター
抗ACTN4抗体	Sigma Aldrich	HPA001873
マウスで産生された抗コラーゲンIV抗体	Santa Cruz Biotech	sc-59814
鶏肉で産生された抗ビメンチン抗体		Abcam ab24525
アクアホールドII疎水性ペン	デバイス	、980402
乳房、一般的な疾患、組織アレイ、	Abcam	ab178113
DAPI(1 mg / mL)、	Thermo Scientific	62248	核染色
、ダイヤモンドナイフ、No.88、CM	一般ツール	、31116
エタノール	、Pharmco	111000200
エチレンジアミン四酢酸 酸(EDTA)0.5 M	VWR	BDH7830-1
FFPE腎臓サンプル	USBiomax	HuFPT072
鉗子
ギ抗チキンIgY(H + L)、高度に交差吸着されたCF488A	バイオジウム	20020
ヤギ抗チキンIgY(H + L)、高度に交差吸着されたCF633	チウム	20121
ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 高度に交差吸着された Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind Staining Medium	Active Motif	15253	選択可能な非商用スタンティングバッファーで置換できます。
MAXblock ブロッキング ミディアム	アクティブ モチーフ	15252	選択した非商用ブロッキング バッファーで代用できます。
MAXwash Washing Medium	Active Motif	15254	お好みの非商用洗浄バッファーで代用できます。
マイクロカバーガラス#1(24 mm x 60 mm)	VWR	48393 106
カバーガラス#1.5(24 mm x 60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma Aldrich	M7279
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121	ブロッキングバッファーの調製に。二次抗体の動物宿主に依存します。
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture	Dish Thermo Fisher	167063	マルチウェルプラスチック培養ディッシュ
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL 円錐	サーモフィッシャー	339651
Nunc 50 mL 円錐	形サーモフィッシャー	339653
オービタルシェーカー
ペイントブラシ
pHメーター
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10倍溶液	Fischer Scientifc	BP399-1
プラスチックペトリ皿(100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinase K(分子生物学グレード)	Thermo Scientific	EO0491
Razor	blade Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
アクリル酸ナトリウム	Sigma Aldrich	408220
塩化ナトリウム	シグマ アルドリッチ	S6191
クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物	シグマ アルドリッチ	C8532-1KG
トリスベース	フィッシャー サイエンティフ	BP152-1
トリトン X-100	シグマ アルドリッチ	T8787
CF640R	ビオチウム	29026
	シグマ アルドリッチ	214736