火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。テレオスト魚の2つの系統、骨グロシ目とシルリフォーム、並行してエレクトロレセプションを進化させ、テレオスト(ジムノチフォルム、モルミリド、および系統アストロズコプス、マラプテルス、シノドンティス)の5つの系統並行して進化した電気発生。共通の遺伝的アーキテクチャ^を共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の^{収束があります。}

これはおそらく、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれるジムノチフォームとモルミリド、2種豊富なテレオストクレードの数多くの収束的な特徴によって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、通信^する4を発見してから50年の間に、科学者のコミュニティは^開発1、5の進化に関する大きな洞察を得ています。 ^,6, システム及び回路 神経科学^7,8,9,10, 細胞生理学^11,12, 生態学とエネルギー^{13,14,15,16,17}, 動作^18,19, マクロエボリューション^3,20,21.

最近では、電気魚1、22、23、24、25、26のゲノム、転写、およびプロテオミクス資源の増殖が起きており、 ^27、28.これらの資源の使用は、これらの^{種1、2、3、28、29}における遺伝子型と表現型の関係に関する重要な洞察を既に生み出している ^、30.弱い電気魚のフェノチピックデータとゲノムデータを統合する際の大きな障害は、機能的ゲノム^ツール31の現在の欠如である。

そのようなツールの1つは、最近開発されたクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロミックリピートとCas9エンドヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9、CRISPR)技術です。CRISPR/Cas9は、^{モデル32、33、34}および非モデル生物35、36、37の両方で広く使用されているゲノム編集ツールである。CRISPR/Cas9技術は、基礎分子生物学が可能な実験室が、非クローニング^法38を用いて低コストで、ショートガイドRNA(sgRNA)と呼ばれる遺伝子特異的プローブを容易に生成できるところまで進歩した。CRISPRは、モルフォリ^{ノス39、40、}転写活性化剤様エフェクタヌクレアーゼ(TALENs)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFC)などの他のノックアウト/ノックダウン戦略よりも優れている。すべての標的遺伝子の生成に時間がかかります。

CRISPR/Cas9システムは、sgRNA配列によって指示されるゲノムの特定の領域を標的とし、二本鎖の破壊を引き起こすことによって遺伝子ノックアウトを作成するために機能する。二本鎖の破断は細胞によって検出され、非相同末端結合(NHEJ)経路を用いて優先的に内因性DNA修復機構を引き起こす。この経路は非常に誤差が起こりやすい:修復プロセス中に、DNA分子はしばしば二本鎖破壊部位に挿入または欠失(インデル)を組み込む。これらのインデルは、(1)オープンリーディングフレームのシフト、(2)早期停止コドンの挿入、または(3)遺伝子産物の重要な一次構造のシフトのいずれかによる機能の喪失をもたらす可能性がある。このプロトコルでは、CRISPR/Cas9編集を利用して、弱い電気魚種のNHEJを用いた標的遺伝子の標的点突然変異を標的とする。他の技術よりもシンプルで効率的であるが、この突然変異誘発の方法は、遺伝的モザイク41、42、43^{に起因するF0における一帯のフェチピックの重症度をもたらすことが期待される。,44}.

生物の選択
弱い電気魚の比較ゲノムに関する将来の研究を促進するために、プロトコル開発のためのジムノチフォームとモルミリドの両方の代表的な種を選択する必要がありました。ウルグアイのモンテビデオで開催された2016年の電気魚会議での議論の後、すでに実験室で飼育でき、ゲノム資源を利用できる種を利用するコミュニティコンセンサスがありました。ジムノチフォルム・ブラキポポムス・ガウデリオとモルミリド・ブリエンミロス・ブラキシシウスは、これらの基準に適合する種として選ばれた。両方の種で、繁殖状態を誘導し、維持するための自然の手掛かりは、捕虜を模倣することが容易です。B.ガウデリオは、南米のジムノチフォーム種であり、低い夫の要件の利点を有する:魚は比較的小さな(4 L)タンクで比較的高密度に保つことができる。B.ガウデリオはまた、捕虜の条件下で速い世代のターンオーバーを持っています.実験室の条件下では、B.ガウデリオは約4ヶ月で卵から成人に発達する可能性があります。

西中央アフリカのモルミリド魚の一種であるB.ブラキシシウスは、捕虜の中で容易に繁殖する。B.ブラキシウスは、水族館の貿易を通じて容易に入手可能であり、多くの研究で広く使用されており、現在、利用可能なゲノム資源の数を持っています。彼らのライフサイクルは、実験室の条件に応じて、1-3年に及びます。夫の要件は、繁殖中の攻撃性のために適度なサイズのタンク(50-100 L)を必要とし、この種のためにやや集中的です。

他の種の電気魚を研究する実験室は、種が繁殖できる限りこのプロトコルを容易に適応させることができるはずであり、単一細胞胚を収集し、成人期に飼育することができる。住宅、幼虫の夫、および体外受精(IVF)率は、他の種と変わる可能性があります。しかし、このプロトコルは、他の弱い電気魚の繁殖の試みの出発点として使用することができます。

概念実証のための理想的な遺伝子標的:scn4aa
弱い電気モルミリドとジムノチフォーム魚は、電気器官と呼ばれる特殊な臓器を排出することによって電界(電解)を発生させる。電気器官放電(EOD)は、エレクトロサイトと呼ばれる電気器官細胞における作用電位の同時産生から生じる。EIDは、魚の周囲の高解像度の電気画像を作成するために皮膚内の電気受容体の配列によって検出^{される45。}弱い電気魚はまた、彼らのコンコンフェリングのEOD^波形18だけでなく、その排出^速度46の特徴を検出することができ、EODは鳥の歌やカエルに類似した社会的コミュニケーション信号としてさらに機能することができます発声⁴⁷.

モルミリドとジムノチフォームの両方の電気細胞における作用電位発生の主な構成要素は、電圧ゲートナトリウムチャネルNaV1.4²である。非電気テレオストは、2つのパラロゴス遺伝子コピーを発現し、scn4aaおよびscn4abは、電圧ゲートナトリウムチャネルNaV1.4³⁰に対するコーディングを行う。ジムノチフォームとモルミリドの両方の弱い電気魚系統において、scn4aaは急速に進化し、その運動特性に影響を与える多数のアミノ酸置換^{を受けている48.}最も重要なことは、scn4aaは電気^器官2、3への両方の系統で区画化されている。電気器官に対するscn4aaの比較的制限された発現と、EOFの生成における重要な役割は、有害な多発性効果を最小限に抑えるため、CRISPR/Cas9ノックアウト実験の理想的なターゲットとなります。弱い電気魚は幼虫電気器官を6-8日後に放出し始めるので、scn4aaのターゲティングは胚マイクロインジェクション後の迅速なフェノタイピングに理想的に適しています。

ここに記載されているすべての方法は、ミシガン州立大学の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. sgRNAターゲットの選択

注:手順 1.1 で sgRNA を手動で設計するためのプロトコルが用意されています。これはscn4aaターゲット選択に利用された。EFISHGENOMICS Web ポータルを使用してこのプロセス (ステップ 1.2) を容易にするために、追加のプロトコルが提供されます。カスタムターゲットのsgRNAの設計に成功するために、いくつかの自動チェックを備えたプロトコル1.2を選択することをお勧めします。

1. sgRNAターゲットを設計します。
   1. sgRNAガイドオリゴを生成するためには、エキソン1、または他の5'エキソンを標的とするのが最善です。5' UTR をターゲットにすることができます。ただし、5' のコーディング シーケンスをターゲットにすることをお勧めします。ゲノム情報を利用することが好ましいが、トランスクリプトームデータを用いて成功したsgRNAを開発することができる。イントロン/エキソン境界(ゲノムデータ)またはエキソン/エキソン境界のアノテーションが望ましい。
   2. 1.1からの候補ゲノム配列は、パターン5'-N(18)-NGG-3'に一致する可験性標的配列を検索する。これは、デスクトップシーケンス分析ソフトウェア、カスタムスクリプト、またはシーケンスの手動検査を使用して自動的に実行できます。
   3. シーケンスは、標的活性に対してDoench et al.⁴⁹の方法を用いて優先順位付けすることができる。さらに、標的配列は、オフターゲット結合のためのゲノム/転写データベースに対するBLAST探索によって評価され得る。
   4. ターゲット シーケンスを横に並える標準 PCR プライマーを生成できることを確認します。プライマーは、切断部位の両側(NGG配列の上流の3塩基)から少なくとも20bpでなければならない。理想的には、PCR 製品は 150-200 塩基対(bp)である必要があります。
   5. 定数オリゴマー(1.1.6)にアニーリングするためのT7プロモーター(N18の5')と相補領域(N18の3')を含む以下のテンプレートを使用して上記の基準を満たす設計オリゴマー:5'-TAATACGACTActATAGG-N₁₈-GTTTTAGAGCTAGAATAGCAAG-3'
      注:N18配列には、NGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列は含まれていない。これをオリゴマーに含めないでください。
   6. すべてのsgRNA、sgRNA標的のオリゴマー(ステップ1.1.5)、およびPCRプライマー(ステップ1.1.4)をオリゴヌクレオチド産生サービスからの標準脱塩オリゴマーとして合成するために使用される定数オリゴマー(表1)を注文します。オリゴマーおよびPCRプライマーは、標準的な脱塩オリゴマーとして注文することができ、追加の精製は必要ない。
2. sgRNAターゲットの自動設計を行います。
   1. ゲノムデータを用いて、標的遺伝子を選択する。エキソン/イントロン境界がわかっている場合は、代わりにトランスクリプトームデータを使用できます。ターゲットは、EFISHGENOMICSポータル(http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu)を使用して識別することができます。理想的なターゲットは、exon 1 内になります。ただし、他の 5' エキソンと 5' UTR を考慮できます。
   2. ターゲットシーケンスが特定されたら、自由に利用可能なEFISHGENOMICS CRISPRウェブツール(http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/)をロードします。この Web ツールは、ターゲットジェネレーション^50、51用の CRISPOR アルゴリズムのカスタマイズ バージョンを使用します。
   3. [ステップ 1]のボックスにシーケンスの名前を入力し、ターゲットのシーケンスを適切なボックスに入力します。
3. 配列の派生元の適切なゲノムを選択します。現在、B.ブラキシシウスとB.ガウデリオのゲノムデータが利用可能です。ゲノム配列は、このツールの使用には必要ありませんが、望ましくない潜在的なオフターゲット効果を評価するのに役立ちます。
4. 適切な PAM を選択します。20 bp-NGG PAM をお勧めしますが、使用する Cas9 タンパク質に応じて、いくつかの追加の PAM モチーフから選択できます。
5. 推奨ガイド配列を持つゲノム内の標的配列の位置を含むレポートが生成されます。予測されたオフターゲット効果、高い特異性スコア、高効率スコアを持つ 3 つのターゲットを選択します。最も高いスコアリングガイドシーケンスは、左側に緑色で強調表示されます。可能であれば、黄色と赤色の強調表示されたガイド シーケンスは避ける必要があります。
6. 選択したターゲット シーケンスをクリックすると、包括的な CRISPOR レポートが生成されます。これらの報告からの重要な情報は、「重なり合うオリゴヌクレオチドからのT7 in vitro発現」に関する情報である。このレポートから、推奨sgRNAオリゴ、標的部位のPCRプライマー、およびすべてのsgRNAの合成に使用される一定のオリゴマーの情報を抽出します。
7. 選択したオリゴマー(ステップ1.6)をオリゴヌクレオチド産生サービスから注文します。オリゴマーおよびPCRプライマーは、標準的な脱塩オリゴマーとして注文することができ、追加の精製は必要ない。

2. sgRNAを生成する

1. PCRチューブ内のアニールオリゴマー:100μM定数オリゴマーの1μL、100μM sgRNA特異的オリゴマーの1μL、およびヌクレアーゼ_フリーH2Oの8 μLを加える
2. サーモサイカー内のアニールオリゴマーは、次のプログラムで95°Cで加熱し、-2°C/sで85°Cに冷却し、0.1°C/sで25°Cまで冷却し、4°Cで保持します。
3. sgRNAテンプレートを生成するには、2.5μLのdNTPミックス(10mM)、10x緩衝液の2°L、T4 DNAポリメラーゼの0.5μL、および5μLのヌクレアーゼ_{フリーH2Oをステップ2.2}からアニールオリゴマーに加えます。12°Cで20分間インキュベートする。
4. 製造元の指示に従って PCR クリーンアップ列を使用してテンプレートを精製します。
5. 20~30°Lで溶出します 分光光度計を使用して濃度と純度を推定します。テンプレートは 100 ~ 200 ng/μL および 1.8 ~1.9 A_260/280である必要があります。
6. 1~5μLを実行してアガロースゲルを使用して確認します。支配的なバンドは 120 bp である必要があります。代表的な結果については、図 1Aを参照してください。
7. ゲル検証済みsgRNAテンプレートを-20°(長期)または4°C(短期、1~4週間)で保存します。
8. DNTPミックスの室温8μL(dA、dT、dG、dCの等量)、10x緩衝液の2μL(室温)、T7 RNAポリメラーゼの2μL、sgRNAテンプレートの100−200ngを添加することにより、T7 RNA転写キットを使用してsgRNA転写キットを転写、ヌクレアーゼ_フリーH2Oを20μLの総体積にする。下部に収集するためにスピン。37 °Cで2〜4時間インキュベートします。
9. DNaseを1μL加え、37°Cでさらに15分間インキュベートします。
   1. グリコーゲン1μL、ヌクレアーゼフリーH2O30μL、酢酸アンモニウム5M30μL、180μLの100%EtOHを転写したsgRNAを加えてsgRNAをクリーンアップします。よく混ぜ、-80°C(凍結するまで)または-20°Cで一晩で少なくとも20分間インキュベートします。最高速度で15分間4°Cで遠心分離。
10. ペレットを乱さずに上清を取り出して廃棄し、1mLのRNaseフリー70%EtOHを-20°Cで冷やして洗浄します。4 °Cで最高速度でさらに5分回転させます。
11. ペレットを乱さずに上清を取り出して廃棄し、ペレットを5分間空気乾燥させます。
12. ヌクレアーゼ_フリーH2Oの30°Lで再サスペンドし、UV分光法(200ng/μLの最小収率)を使用して純度と収率を決定します。
13. RNaseフリーゲル上のsgRNAの存在を確認します。sgRNAは、二次構造(図1B)のために2つのバンドとして50から150 bpの間で現れる。
14. アリコートを3°Lにし、-80°Cで保存します。

3. Vitroでの切断効率の検証

1. 市販のDNA抽出キットを用いて標的種からゲノムDNAを抽出する。腹フィンクリッピングは、組織が再生されるため、魚を犠牲にすることなく使用することができます。
2. 標準PCRを使用して、ステップ1.6および1.7で説明するように設計されたプライマーを使用して標的DNA領域を増幅します。ゲル電気泳動で製品を確認します。適切な領域が増幅されていることを確認するためにフラグメントをシーケンシングすることが推奨されますが、必須ではありません。scn4aaテンプレートの代表的な結果を図 2に示します。
3. 確立されたラボまたは会社のプロトコルを使用して PCR フラグメントをクリーンアップします。
4. 増幅したDNAを-20°Cで保管してください。凍結融解サイクルを減らすためにアリコートに分離することを検討してください。
5. 各コンポーネントに必要な量とボリュームを決定します。負のコントロール(sgRNAまたはCas9を除く)と陽性対照(標的PCR増幅DNAを切断する以前にテストされたsgRNA)とsgRNAの濃度系列を実行することを検討してください。
6. 室温でPCRチューブで以下の反応混合物を指定順に設定し、sgRNAおよびCas9タンパク質を最後に加えて最良の結果を得た:標的DNA PCR産物の50~100ng、10xバッファー3の1μL、10x BSAの1μL(0.1g/mL)、Cas9タンパク質の50〜200ng(1mg/mL、150ngが示唆される)、およびng sgRNAの30〜200(100ngが示唆される)。
   1. 反応を37°Cで1時間インキュベートし、次いで65°Cで10分間インキュベートし、Cas9タンパク質を不活性化する。
   2. 2%~3%のアガロースゲル(30~200bpのバンドサイズが予想される)でサンプル全体を、正と負のコントロールとともに実行します。切断が成功すると、PCR 製品の一部が表示される場合がありますが、2 つの小さなバンドもあります。代表的な結果を図 2に示します。

4. 胚の入手

注:弱い電気魚の胚を得することは困難な場合があります。水質の注意深いモニタリング、魚のケアのための十分な時間、定期的な摂食は、繁殖プログラムを成功させる鍵です。魚は、プロトコルステップ4.1で説明されているように、^再生52のために最初に数週間調整されなければならない。これに続いて、自然産卵行動(4.3)に使用するための自然のゲーム発生を増強するプロトコル(4.3)が、正確にタイミングの胚(4.4)を得るための最近開発されたインビトロ技術の代替が提示される。プロトコル4.3はB.ブラキシストとB.ガウデリオに対して同様に有効であり、プロトコル4.4はB.ガウデリオで優れています。

1. 調節
   1. B.ブラキシウスは、繁殖条件下で非常に積極的になるように、カップル/小グループ(100〜150 Lタンク)または非常に大きなタンク(約475 Lタンクで2人の男性と5-6メス)に保管してください。避難所として使用する魚1匹につき少なくとも1~2本のPVCチューブが必要です(図3A、B)。
   2. B.ガウデリオははるかに高密度で飼育することができます。100 Lタンク(男性2人と女性6名)で最大8人を飼います。避難所として使用する魚ごとに少なくとも1つのPVCチューブが必要です。もつれた糸を加えると、豊かさと隠れ場所が増えます。直径1cmの穴をタンクの上部に掘削した50mL遠心管を追加し、大人がチューブに自然にスポーンできるようにします(図3C)。
   3. 繁殖期には、冷凍血虫を補充した魚に毎日新鮮な黒虫を与えます。食べ物は、必要に応じて、ビタミンやサプリメントで豊富にすることができます。
   4. 比較的高い導電率(300~600°S)で通常魚を収納し、pHバランスの取れた溶液。繁殖期には、1~3週間の間に少なくとも半分の導電率を下げて、性腺の再粗野化と産卵を誘発する。逆浸透(RO)水を毎日添加することで導電性を低下させ、導電率が低い場合のpHに細心の注意を払う(pH<6)。
   5. 繁殖条件は、卵の生産が時間の経過とともにテーパリングで約3〜5ヶ月間保つことができます。この時間の後、魚を1〜3週間ゆっくりと高い導電性に戻します。再び繁殖条件にさらされる前に、高い導電性でさらに3ヶ月を保ちます。
2. 産卵剤(SGnRHa + ドンペリドン)注射を使用してください。
   1. 重力に見える繁殖条件で雌の魚を特定する (図 4)。B.ガウデリオでは、女性はちょうどベントに大胆な腺を腫らしているでしょう。B. 高らんとうの雌は、腫れた腹を持ち、深い体を持って表示されます (図 4A)。男性は一般に精子を産生する問題を持っていない。しかし、より大きな男性は、収集された精子の量が大きいため好ましい。
      注:産卵剤は、ゲーテの成熟を促進し、産卵を座標する市販のホルモンミックスです。魚が過去に産卵剤を注入した場合は、>4週間の休息と注射の間の十分な供給を許可します。私たちは、卵と精子の多くを確保するために、少なくとも2人の男性と4-5メスを注入することをお勧めします。
   2. 数分間MS-222(0.4 g/3 L)で魚を麻酔し、魚がその姿勢を保つことができずなくなるまで、不動であるが、円錐運動を続ける(ステージII^53)。
   3. 魚(g)を計量して産卵剤量(0.5μL/g)+0.5°Lを算出します。余分な 0.5°L は、ピペット エラーを説明します。
   4. スポーン剤をPCRチューブ内のバッファ(1x PBSまたはDPBS)の4倍のボリュームに追加し、よく混ぜます。解決策は曇りになります。これは、発熱性樹脂上の産卵剤を分配し、その後、計算された用量を測定するためにピペットを使用するのに役立ちます。産卵剤は粘性があるので、十分に分配し、ピペットに注意してください。
   5. 熱可塑性に注入液をピペットし、気泡を避けて精密ガラスシリンジに引き込みます。28 G、長さ19~25mmのベベレードルをお勧めします。
   6. 滑らかな速度で後方の幹筋に溶液を注入します。針を2~4~4~で取り出し、取り外します。すぐに回復のために新鮮なシステム水に魚を入れます。
   7. およそ24時間後に胚の採取を準備する(4.3または4.4参照)。単一細胞マイクロインジェクションに必要なものを含むすべての必要な材料を収集します(セクション5を参照)。
3. 自然産卵を通じて胚を得る。
   1. 大きな450 Lタンクに薬剤注入された大人(4.2)を産卵する家。最も効果的な性比は、通常、1〜2オスと3〜4メスで、PVCチューブから作られた十分な隠れ場所を持ち、卵の消費を防ぐためにタンク底に暗い大理石の基板を持っています。大理石は、通常、上記のように割れ目や50 mL遠心管に粘着性の卵を堆積することを好むB.ガウデリオよりもB.高等生症にとって重要である。
   2. 夜間の産卵時間を通常のラボの稼働時間に合わせて、逆光サイクルに魚を配置します。市販のコンシューマ グレードセキュリティ システムを使用して、赤外線照明を使用して魚を監視し、リモート接続された PC からの障害を最小限に抑えます (図 3)。
   3. 魚は、約24時間の暗い光周期の間に自発的に産卵剤注入をポストします。
   4. 産卵が始まったら、産卵行動が起こる間に卵を1時間ごとに集める。B.ブラキシウスでは、生まれたての卵へのダメージを最小限に抑えるために、細かい綿メッシュネットの上に小径のサイフォンを使用して卵を収集します。50 mL遠心管またはタンク基板からB.ガウデリオの卵を収集します。低強度の赤色光を持つヘッドランプを使用して魚を産卵する最小限の妨害で効率的に作業します。最初の切断は受精後約1時間(HPF)で起こるので、卵の大部分は単一細胞マイクロインジェクションに適しているであろう。
   5. マイクロインジェクションに直ちに進みます(セクション5を参照)。
4. B.ガウデリオの体外受精のための男性を絞る.
   1. ゼブラフィッシュ^ブック54に記載されているように精子エクステンダー溶液(SES)を調製する: 10 mM HEPES, 80 mM KCl, 45 mM NaCl, 45 mM 酢酸ナトリウム, 0.4 mM CaCl 2 , および0.2 mM MgCl_2.
      1. ddH₂Oを使用して音量を上げ、pHを1 M NaOHで7.7に調整します。
      2. 冷蔵庫に保管してください。
      3. 使用前に0.22μmフィルタでフィルター処理してください。
   2. 数分間MS-222(0.4 g/3 L)で魚を麻酔し、魚がその姿勢を保つことができずなくなるまで、不動であるが、円錐運動を続ける(ステージII^53)。SESの500 μLアリコートを氷の中に入れられます。
   3. 手と魚を十分に乾かして、特に頭と通気口の周りを回ります。MS-222浸した湿ったペーパータオルで覆われたポリスチレンフォーム/スポンジホルダーに、腹部側を上に置き、左(右利きの人用)を前置きします。ヘッドは、可能な限りテーブルと平行である必要があります。
      注:ステップ4.4.4~4.4.6はできるだけ早く行うべきであり、魚は30~60sの水から出るだけであるべきです。
   4. 口塞に向かって生殖器の上に光を圧迫する内側にラウダル方向に圧力を加えます。魚は廃棄物を排出するかもしれない。廃棄物が排出された場合は、繊細なタスクワイプで通気孔をきれいにするように注意してください。精子で廃棄物を収集しないでください。オスの大きさに応じて、10〜60°Lが一般的である。
   5. 先端付きのマイクロピペットを使用して、50°L単位で男性から絞られると慎重に精子を収集します。氷上のSESの500 μLアリコートに精子を直接入れ直します。他の人が圧迫している間、別の研究者に精子の収集を手伝ってもらえると役に立ちます。精子はできるだけ早く使用されるべきであるが、少なくとも1時間は生存可能である。
   6. 収集直後に、回収のために新鮮なシステム水に魚を入れます。魚は30~60年代の水から出るだけであるべきです。
5. B.ガウデリオの体外受精のための女性を絞る.
   1. 数分間MS-222(0.4 g/3 L)で魚を麻酔し、魚がその姿勢を保つことができずなくなるまで、不動であるが、円錐運動を続ける(ステージII^53)。ワークステーションにポリテトラフルオロエテーンシートを置きます。
      注:セクション4.5.1-4.5.5はできるだけ早く行う必要があり、魚は30〜60sの水からのみです。
   2. 乾いた手、道具、ポリテトラフルオロエテーンシート、および魚、特に頭と通気孔の周りに徹底的に。頭を前向きにして横に置く(右利きの人の場合)。
   3. 口塞に向かって生殖器の上に光を圧迫する内側にラウダル方向に圧力を加えます。魚は廃棄物を排出するかもしれない。廃棄物が排出された場合は、繊細なタスクワイプで通気孔をきれいにするように注意してください。魚の大きさに応じて、20〜150個の卵が一般的です。ポリテトラフルオロエセンコーティングされたスパチュラ/ツールを使用して、彼らは慎重にクローカから絞られた卵を収集します。すぐに小さなペトリ皿とカバーに卵を移動します。このプロセス中に卵が乾燥したままであることを確認してください。あるいは、絞った後、卵塊を小さなペトリ皿の基部またはポリテトラフルオロエセンシートに触れ、メスから追放する。
   4. 収集直後に、回収のために新鮮なシステム水に魚を入れます。
6. B.ガウデリオの体外受精のための卵子受精を行う。
   1. SESで100μLの精子を加えます(ステップ4.4を参照)。
   2. システム水を1mL(0.22μmフィルターでろ過)を加え、30~60個よく混ぜます。
   3. さらに1~2mLのシステム水を加え(ペトリ皿にスペースを残す)、インキュベーターに入れます。ペトリ皿のIVFの時間を記録し、29°のインキュベーターに移動します。50分のタイマーを設定して発達の進捗状況を確認する(例えば、動物極での単一細胞の形成、図6参照)。この間、マイクロインジェクション用の材料を調製する。

5. 単一細胞マイクロインジェクション

1. スポーン剤注射(ステップ4.2)または自然産卵(ステップ4.3)の前にマイクロインジェクション針を引っ張ります。フィラメント付きのホウケイ酸ガラス毛細管(O.D.1.0 mm、I.D.0mm、長さ10cm)と針プーラーを使用してマイクロインジェクション針を引っ張ります。計画された治療注射ごとに2-4針を準備します。
   注:フィラメントを持つバックローディング針が好ましいのは、フィラメントが先端に向かって溶液をウィックし、気泡を除去するためである。しかし、フィラメントのない針を使用することができ、フロントローディングは結果に影響を与えるべきではありません。針は長いが頑丈なテーパーを持っている必要があります。次の仕様を使用して、次の針抜きプログラムを開始点として使用してください: 熱 = 500;プル = 70;速度 = 70;と時間 = 100。代表的な針形態を図5Aに示す。
2. 注射液を準備し、針を準備します。
   1. 0.9 μLの sgRNA と Cas9 酵素の 0.9 μL (1 mg/mL) を、10% または 100% フェノールレッド (それぞれ 1% および 10% の最終フェノール赤濃度) の 0.2 μL に PCR チューブに追加します。よく混ぜ、氷の上に座って2-5分でsgRNAとCas9を複雑にします。注射液中のsgRNA、Cas9、フェノールレッドの最終濃度を計算します。
      注:上記のレシピを使用して針の詰まりや切断効率に問題がある場合は、Cas9を安定させ、針の詰まりを防ぐために1倍の最終濃度塩/緩衝ミックスを使用することが有用である可能性があります。
   2. マイクロローダーピペットチップを使用して、2°Lの溶液をマイクロインジェクション針にバックロードします。できるだけ先端に近い液体を排出します。
   3. マイクロマニピュレータに針をロードし、圧力設定を設定します(775 p i、0.1−0.2 s、8-12 p_cから始まります)。
   4. スコープの下で、細かい鉗子のペアを使用して、斜めの角度で針の先端を壊します。針のテーパが剛性を持ち始めるところに向かってブレークします。先端に近づくと、注射液のサイズをテストし、必要に応じてさらにブレークすることをお勧めします。針の穴は、硬いテーパを維持しながら、できるだけ小さくする必要があります(図5A)。
   5. ミネラルオイルとマイクロメータを使用して、注入液のサイズを測定します。通常は 1 ~ 2 nL が使用されます。0.1 mm の直径は 0.5 nL です。
   6. 針先または圧力の設定を調整して、仕様内で注入量を得ます。
3. 発達中のザイゴトを特定し、注射段階を準備します。射出ステージを設定します。直径100mmのペトリ皿を取ります。下を反転し、反転した上部の下に配置します。反転した上部にガラス顕微鏡スライドを配置します。マイクロマニピュレータをスコープに取り付ける方法によっては、反転ベースから高さを追加する必要がなくなる場合があります。
   1. 発達中の卵を見て、IVFの後に推定受精50〜60分後に受精した頬骨を識別します。動物のポールが形成され始め、黄身/動物細胞界面の周りに小さな脂肪滴が過剰になります(図6)。
   2. プラスチック転写ピペット(卵が通過できるように先端を少しカット)を使用して、できるだけ少ない水で10〜20個の卵を収集し、スライドの端に置きます。水はスライドの下で邪悪になり、端に卵を引っ張ります。
   3. 繊細なタスクワイプを使用し、穏やかに余分な水を除去し、卵がスライドの端にしっかりと付着できるようにスライドを押します。注射中の卵の動きを避けるために少し立っている水分を維持しながら、卵を湿らせておくのに十分な水があるはずです。
4. 単一の細胞に直接注入する。
   1. 近づいてくる針に垂直に、スライドに対して卵を垂直に揃えます(図5B)。
   2. マイクロマニピュレータを使用して、針を絨毛に当てはまします。およそ45°の角度で、針を絨毛に挿入し、次に単一のセルに挿入します。黄身を通して単一のセルを入力すると便利です。フリーハンドとマイクロマニピュレータで注入段階の両方を動かすことで、注入プロセスをより詳細に制御できる場合があります(図5B)。
   3. sgRNA/Cas9/フェノール赤溶液を単一細胞に注入します。針を慎重に取り外します。次の卵に進み、すべての卵が注入されるまで手順5.4.1~5.4.3を繰り返します。
   4. 細かい鉗子で注射中に壊れた卵を取り除きます。ホヤボトルに0.22μmのフィルター処理されたシステム水を使用して、注入段階から卵を新しい100mm直径のペトリ皿にそっと取り除きます。
   5. すべての卵が注入されるか、2細胞段階に発展するまで、手順5.3.3~5.4.6を繰り返します。受精率と注射の成功を決定するために、約20の推定受精卵を無注射制御として確保してください。より大きなクラッチのためには、2細胞段階に発達した未注入胚を使用し、より小さなクラッチのために推定受精卵を取っておきます。
   6. さらに、ゲノムに存在しない遺伝子に対してsgRNAを複合体化したCas9を15~25個の胚に注入して、sgRNA/注射制御を検討してください。野生型胚に推奨されるGFP遺伝子。各ペトリ皿の卵、両親、IVF時間、日付を記録します。sgRNAターゲットまたはラベルを注入されていないものとして含めます。29°Cのインキュベーターに移動します。

6. 畜産

1. 卵の世話をしなさい。
   1. 卵の生存率を確認する 4 – 6 時間以下の注射.
   2. 死んだ卵の数だけでなく、受精していないものの数を記録します。未受精卵は8細胞の段階の周りに逮捕され、動物の極で細胞のロゼットパターンを持っています(図6)。死んだ卵の数と水中の卵の破片の量に応じて、水の少なくとも50%〜80%を取り除き、ろ過されたシステム水と交換します。細胞の破片フィルムやバイオフィルムが形成された場合、ペトリ皿の底をスクラブするのに役立ちます。
   3. 次の2~3日間は、毎日卵1~2倍をチェックしてください。卵がチェックされるたびに、手順 6.1.2 ~ 6.1.3 を繰り返します。
   4. 2-3日後に幼虫が孵化します。彼らが孵化するすべての卵ケースを取り外します。穏やかなピペットは、半分孵化した幼虫を解放するのに役立ちます。
2. 幼虫の世話。
   1. 卵を毎日1-2倍チェックしてください。幼虫がチェックされるたびに手順 6.1.2 ~ 6.1.3 を繰り返します。
   2. 6~14 DPFから、酢ウナギを幼虫に送ります。酢のウナギは皿の中で生き続けるので、食べ物のわずかな過剰は良いです。料理をチェックして掃除するたびに酢のうなぎを加えます。
   3. 11~14 DPFから、酢ウナギに加えて幼虫1個につき5~10個の孵化したばかりのアルテミアを加えます。この間、幼虫は無料の水泳アルテミアを食べることを学びます。
   4. 15 DPFで、流れる水、ろ過、通気を含むタンク内の卵カップ(セクション6.2.5を参照)に幼虫を移動します。1カップあたり約25個の胚は存在しないはずです。卵カップは、底にメッシュネット付きのプラスチックカップです。卵カップの底に100mmのペトリ皿の上/下を加えて、食べ物がメッシュを通って落ちるのを防ぐ。卵カップは、離散的なグループを維持しながら、水質の理由から、魚を水の大きな量に収容することができます。15~18日から幼虫1個あたり15−30の新たに孵化したアルテミアの両方を追加し続けます。毎日ペトリ皿をきれいにし、死んだアルテミアの塊を除去するためにピペットを使用しています。
   5. 18-30日から、孵化したばかりのアルテミアだけを養う。魚が成長し、尾の噛み付きが見られる場合は、供給量を増やします。
   6. 約30日後、魚を10L(2.5ガロン)タンクに移動し、タンクあたり約25人を移動します。ろ過、通気、隠れ場所があることを確認します。円筒形のバイオろ過媒体と小径のPVCチューブを検討してください。
   7. 約30〜45日後に新たに孵化したアルテミアとブラックワームを養います。タンクの標準的な洗浄と水の変化を維持します(つまり、1週間あたりの水の変化は最低で~10%~20%)。
   8. 〜45 DPFの後、〜60 DPFまでブラックワームのみを供給する。
   9. 〜60 DPFの後、約15匹の魚のコホートを40 L(10ガロン)タンクに移動し、成人の夫の手順を開始します。場所を隠すためのPVCチューブと糸「モップ」(コルクの周りに結ばれた茶色の糸の塊)を追加します(図3C)。魚は、受精後約3~4ヶ月後に繁殖サイズ(10−12cm)に近づいているはずです。

7. 大人の夫

1. 次の餌に少量のブラックワームが存在するように、十分な黒虫で毎日魚を養います。このアドリビタム供給は、最大の成長を可能にします。
2. 週に数回、血虫の授乳を補うために役立ちます。
3. 20%~30%の水交換で2~4週間ごとにタンクを清掃します。糸モップがバイオフィルム/藻類でいっぱいになったら、RO水の下できれいにこすってください。

sgRNA標的部位は、セクション1に記載されているように、B.ガウデリオおよびB.ブラキシシウスの両方でscn4aaのエキソン1内で同定された。sgRNAはセクション2の説明に従って生成されました。sgRNAの選択と合成に成功した後(図1)、インビトロ切断を試験した(図2)。その後、インビトロ切断を実証するsgRNAを単一細胞マイクロインジェクション用に選択した。

成虫魚は生殖を条件とし(セクション4.1)、その後、産卵剤(セクション4.2)を注入し、その後、セクション4.4に記載されているようにIVFのために(B.ガウデリオ)を絞るか、または自然に出現させた(B.ブラキシスト)としてスポーンさせたセクション4.3で説明します。これらの努力は、両方の種のマイクロインジェクションのための単一細胞胚をもたらした。セクション5で説明したように、scn4aasgRNA/Cas9/フェノール赤複合体(65-190 ng/uL sgRNA、450 ng/uL Cas9、1%−−10%フェノールレッド、最終濃度)の1細胞段階で1.5−2.0nLを注入した。同じクラッチからの卵は、注入されていないコントロールとして使用されました。すべての胚は、セクション6に記載されているように世話をした。IVFに続いて、卵の40%~90%が受精し、胚の70%~90%が注射後に孵化して生き残った。

魚の約75%は6−11 DPFまで生き残り、その後フェノタイプされた。幼虫魚を、シルガード固定化Ag/Cl記録電極を備えた大皿に埋め込まれた35mmペトリ皿に入れました(図7A)。胚の動きは、システム水で作られた3%アガロース型を使用して制限され、胚に合わせて切断された(図7B)。同じ記録室が両方の種に使用され、同じアガロース型が種比較の間で使用された。胚は60sのために記録され、これは何百ものEIDを捕捉するのに十分である。比較のために、年齢とサイズが一致する未挿入のコントロールが選択されました。この時点で、生き残った胚の10%〜30%は振幅EODの減少を示す。明らかな形態学的欠陥を伴うEOD振幅の減少を示す胚および未注入の全胚を、scn4aa標的部位のDNA抽出およびその後のPCRのために消化した。表現型の浸透の範囲がしばしばあり、一部の個体は他のものよりもEOD振幅の低下が強かった。

PCRのクリーンアップとクローニングの後、各胚から30以上のクローンがサンガーシーケンシングに選択されました。CRISPR/Cas9誘導変異は、B.ガウデリオ(図8A、B)およびB.ブラキシスト(図9A、B)強いEOD振幅減少を有する個体(図8Cおよび図9C)で同定された。(それぞれ)、未注入のコントロールは参照遺伝子型のみを持っていました。確認された突然変異体(「CRISPR」)と年齢/サイズの一致した無注入制御との間のEOD振幅の可視化は、scn4aa変異型B.ブラキシステウス(図10A)とB.ガウデリオ(図10B)の両方が実証した)胚は、コントロールよりもEOD振幅が有意に低かった(p< 2.2 x 10-16、ウェルチ2サンプルt検定)。scn4aaのCRISPR/Cas9ターゲティングは、B.ブラキシストとB.ガウデリオの両方で成功し、両方の種の幼虫/早期電気細胞分泌にscn4aaを含む。

図1:sgRNAテンプレート合成および転写(A)sgRNAテンプレート合成のゲル画像。ラベルは、myod (MYO2、MYO1) の異なる sgRNA およびscn4aa (S1-S3) の 3 つの sgRNA に対応します。オリゴマーを焼鈍した後、〜120 bpテンプレートが生成される。(B) B.ガウデリオ(bg2017)の3つのsGRNAのためのsgRNA転写のゲル画像とB.ブラキシストの2つ(bb2016,2017)。sgRNAは二次構造のために2つのバンドとして現れ、dsDNAのラダーを使用する場合50−150 bpの間になります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:インビトロCRISPRアッセイにおける成功(sg1)および失敗(sg2)の代表的なゲル画像。CRISPR コンポーネントを持たないテンプレートの同等量は、scn4aa レーンに示されています。切断が発生したことを示す sg1 の重複するバンドに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:弱い電気魚のためのタンクのセットアップを繁殖。(A) 生成動作のワイヤレスビデオ監視のための一般的なセットアップの概略。赤外線を生成することができる3つの市販のCCTVカメラ(Swann, Inc.)は、水の上部を目指し、デジタルビデオレコーダー(DVR)に接続されています。ビデオは、ネットワークに接続されたコンピュータ (PC) から隣接する部屋で発生する動作をリアルタイムで監視します。(B) B. B. 高らんとうにこのようなセットアップで捕捉された産卵行動 .(C) PVC隠れチューブと糸モップを持つB.ガウデリオのための典型的な繁殖セットアップ.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:オスとメスの繁殖(A) B. ブラキシシウスと (B) B. ガウデリオ.両方の種は性的に二形性であり、性的に成熟すると視覚的に容易に区別される。両方の女性は、熟した卵でいっぱいの特徴的に腫れたベリーを示し、これらの写真でグレービーです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:マイクロインジェクション。(A)ガラス毛細血管針の先端は、適切なマイクロインジェクションボリュームを提供するために壊されなければならない。左側の先端は壊れていません。真ん中と右の先端は、卵のチョリオンを突き刺すためにわずかに斜めのベベルで壊れています。(B)卵はガラススライドに対して並べられ(1%〜10%フェノールレッドは注射の送達を視覚化するトレーサーとして含まれる)、ガラス毛細血管針を注入する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6: 開発段階(A) B. ガウデリオと (B)ブラキシシウス.すべての卵子は受精すると仮定され、発達は24 HPFに監視される。12−24 HPF胚の間は生存可能な卵で見ることができ、そうでなければ卵は分解を示す。受精に関係なく、卵子の活性化に関していくつかの分裂が起こるように見える。受精卵は、受精卵においてはるかに対称的な切断の異常なパターンを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:本研究で用いた幼虫記録室の写真(A) 電極はシルガード内に埋め込まれていますが、3%アガロース金型を介して制限された胚を含む35mm皿に広がります。(B)アガロースによる胚の制限運動を強調する高倍率画像。胚のサイズが変化するにつれて除去できるアガロースの断片に注意してください。B.ガウデリオ胚は正極に面している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 8: CRISPR/Cas9 B. ガウデリオにおける突然変異を誘導 .(A)単一のscn4aaにおけるCas9誘導変異のゲノムDNAから32個のクローン配列を標的とするF0B.ガウデリオ胚(11DPF)。参照シーケンスには、sgRNA ターゲット サイトが灰色で強調表示され、プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) シーケンスが赤色で強調表示され、Cas9 カット サイトに 「|」とマークが付いています。予想されるワイルド型シーケンスからの変更が与えられ、各シーケンスのクローンの数が括弧内に与えられます。(省略形: + = 挿入, - = 削除, ± = インデル)非 CRISPR 関連のシーケンスの非類似性は太字で表示されます。Jao et al.60をモデルにした図 。(B)scn4aaノックダウンB.ガウデリオの配列クローンから予測されたアミノ酸配列(A)。野生の型配列からのCas9による変化は赤色で強調表示され、ヌクレオチド誘発変化数が与えられる。(C)5つのサイズが一致した幼虫からの22秒の電気記録は、すべて同じ記録室で6 DPFを記録した。ゲイン設定はすべてのトレースで同じです。赤色の痕跡は、確認された突然変異を有するB.ガウデリオ幼虫(上記の図8A、Bに示された1人の個体)からであり、黒での痕跡は、未注入B.ガウデリオ幼虫由来である。 全体として、scn4aaのCRISPR/Cas9編集はEOD振幅の減少を示したが、効果は異種であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 9: CRISPR/Cas9 B. 高台炎の突然変異を誘発 .(A)単一のscn4aaにおけるCas9誘導変異のゲノムDNAから42クローン配列F0B.ブラキシスティウス胚(11DPF)を標的とした。参照シーケンスには、sgRNA ターゲット サイトが灰色で強調表示され、プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) シーケンスが赤色で強調表示され、Cas9 カット サイトに 「|」とマークが付いています。予想されるワイルド型シーケンスからの変更が与えられ、各シーケンスのクローンの数が括弧内に与えられます。(省略形: + = 挿入, - = 削除, ± = インデル)非 CRISPR 関連のシーケンスの非類似性は太字で表示されます。Jao et al.60をモデルにした図 。(B) scn4aaノックダウンB.ブラキシシウスから配列クローンから予測されたアミノ酸配列(A)野生型配列からのCas9による変化は赤色で強調表示され、ヌクレオチド誘導変化数が与えられる。(C)4つのサイズが一致した幼虫からの10秒間の電気記録は、すべて同じ記録室で10 DPFを記録した。ゲイン設定はすべてのトレースで同じです。赤色の痕跡は、確認された突然変異を有するB.高等島幼虫(上記のA、Bに示された1人の個体)からであり、黒の痕跡は、注射されていないB.高等島幼虫からのものである。 全体として、scn4aaのCRISPR/Cas9編集はEOD振幅の減少を示したが、効果は異種であった。反転 EID は、記録中に釣魚の向きを変更したものです。これにもかかわらず、実験魚とコントロールの違いは見分けがつかない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図10:CRISPRの平均EOD振幅と未注入サイズ/年齢一致の兄弟の箱ひげ図(A)10 DPFにおけるB.ブラキシスト幼虫のEOD振幅。100のゲインで記録され、CRISPR n = 56 EIDを2個体から、3個体から注入されていないn=114 EID。(B)6 DPFにおけるB.ガウデリオ幼虫のEOD振幅。500のゲインで記録され、CRISPR n = 34 EIDを2個体から、3個体から注入されていないn=148 EID。CRISPR魚の振幅は、注入されていないコントロール(p < 2.2 x 10-16、ウェルチ2サンプルt検定)よりも有意に少なかった。すべての個体は、図7に記載の記録室で記録された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:プロトコルに必要なオリゴヌクレオチド。

著者たちは何も開示する必要はない。