大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

サマリー

本稿では、大人のマウス人工内耳における免疫組織化学のための人工内皮の10mmラウンドカバースリップに人工内皮の断片を付着させるために、細胞および組織接着剤の脱塩および使用を必要とする修飾人工内皮調製方法を提示する。

要約

内科における聴覚処理は、メカノ感覚毛髪細胞の完全性に依存する。生涯にわたり、過度の騒音への暴露、耳毒性薬の使用、細菌またはウイルス性耳感染症、頭部外傷、老化プロセスなどの多くの病因から難聴を獲得することができます。感覚性毛細胞の喪失は、後天性難聴の品種の一般的な病理学的特徴である。さらに、内側の毛髪細胞シナプスは軽度の侮辱によって損傷を受けることがある。したがって、人工内耳上皮の表面製剤は、免疫標識技術および共焦点画像と組み合わせて、リボンシナプスおよび感覚毛髪細胞の損失を含む人工内耳病理の調査に非常に有用なツールであり、毛髪細胞および支持細胞におけるタンパク質レベルの変化、毛髪細胞再生、および報告遺伝子発現の決定(すなわち、GFP)は、正常な形質導入および形質転換細胞型の同定を検証する。内耳の骨状螺旋状構造である人工内耳は、聴覚感覚末臓器、コルティ(OC)の器官を保持する。OCの感覚的な毛細胞および周囲の支持細胞は、人工内耳管に含まれ、バジラー膜上に休息し、頂点のベースおよび低周波で発生する高周波検出とトノトピック的な方法で組織化される。分子・遺伝情報の入手可能性とノックアウトやノックイン技術による遺伝子操作能力により、マウスは聴覚科学を含む生物学的研究に広く用いられている。しかし、成体マウスの人工内耳は小さな、人工内皮は骨の迷路に封入され、微小分節が困難になる。解剖技術は多くの実験室で開発され、使用されているが、この修飾されたマイクロ解剖法は、細胞および組織接着剤を使用して、より簡単かつ便利である。これは、脱石後のすべてのタイプの成虫マウスのコクレオに使用することができる。

概要

コクレアは音の検出に専念し、聴覚を担当します。人工内耳管は骨部迷路の螺旋状に巻き取られ、聴器感覚末器官であるコルティ(OC)の器官を保持する。OCは、成虫CBA/CaJ^{マウス1、2}で巻き取られた場合、約5.7ミリメートルの長さで、人工内皮を構成する、バシラー膜上に置かれる。OCは、ベースで検出された高周波と頂点の低周波数で音位的に組織化されているため、人工内皮は、多くの場合、低に対応するアピカル、ミドル、ベースターンの3つの部分に分かれています。それぞれ、高周波検出。支持細胞の配列に加えて、OCは内側毛細胞(IHC)の1行の内側の毛細胞(IHC)が内側に位置し、人工内耳スパイラルに対して横に位置する3列の外側の毛髪細胞(OHC)で構成されています。

正しい聴覚処理は、内髪の感覚的な毛細胞の完全性に依存する。感覚性毛細胞の損傷または喪失は、過度の騒音への暴露、耳毒性薬の使用、細菌またはウイルス性耳感染症、頭部外傷、老化などの多数の病因によって引き起こされる、後天性難聴の一般的な病理学的特徴であるプロセス³.さらに、内毛細胞/聴神経シナプスの完全性および機能は軽度の侮辱によって損なわれ得^る4.分子・遺伝情報の入手とノックアウト技術やノックイン技術による遺伝子の操作により....

プロトコル

10~12週の男性成人CBA/Jマウスと6~8週のC57BL/6Jマウスに関するすべての研究プロトコルは、サウスカロライナ医科大学(MUSC)の制度動物ケア利用委員会(IACUC)によって承認されました。動物のケアは、MUSCの実験動物資源部門の監督下にあった。

注:以下に示す手順については、マウスを腹腔内注射を介してケタミン(100mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)で麻酔されます。マウスは、動物がつま先のピンチなどの痛みを伴う刺激に反応しなくなった後に切断されます。

1. 側頭骨の抽出

1. 直ちに外科的ハサミ(長さ17cm)でマウスを切断し、皮膚を前頭に引っ張って頭蓋骨を露出させた後、頭蓋骨の中心線に沿って前方の後方の側面からはさみで頭蓋骨の骨を切断する。
2. 鉗子を使用して脳組織を取り出し、生後3ヶ月以上のマウスの親指と人差し指で側頭骨を手動で取り除きます。生後3カ月未満のマウスの側頭骨を切断するには、小さな外科的はさみ(長さ11cm)を使用する。
3. 側頭骨を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解した氷冷フレッシュ4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を含むペトリ皿(直径30mm)に入れ、pH7.4に溶解した。
   注:PFA溶液の不適切なpHバランスは免疫標識の品質を低下させるので、新鮮な....

結果

人工内皮の表面製剤は、免疫標識および共焦点イメージングと組み合わせて、リボンシナプス、感覚毛細胞の定量などの人工内病理の調査のために聴覚科学で広く使用されており、感覚性毛細胞におけるタンパク質^{発現5、6、7、8.}表面製剤のための成虫マウスのコクレオの解剖は簡単ではありませんが、新卒生は10〜15耳で練習した後、この修正された方法を学ぶことができます(図1と図2)。この技術では、CtBP2(シナプス前リボンのマーカー)およびGluA2(シナプス後末端のマーカー)の免疫標識と組み合わせて、Z突起下の共焦点画像を用いたIHC/聴覚神経シナプスを0.25μm間隔でカウントします。マウスリボンシナプスのサイズ^は、21が可能です。.......

ディスカッション

免疫標識と組み合わせた全実装表面製剤の人工内耳分除は、内耳病理および分子機構の調査のための基本的なツールを提供する。この改変された大人のマウス人工内耳解剖法は、細胞および組織接着剤を使用して、この困難な手順を簡素化する。

この修飾人工内耳表面調製方法は比較的容易でアクセスしやすいが、それでも熟練度を達成するためには練習が必要である。正しいカットを行うには、セクター間のセクター間に注意深い集中が必要です。基底ターンの人工内感毛細胞は螺旋状の四肢に非常に近いため、表面の準備が完全に平らにできるように四肢組織を完全に除去することは困難ですが、共焦点Z突起はこの問題を補うことができます。さらに、内炎のフック領域は、解剖するのが最も困難な部分である。フック領域の OHC と IHC の分離が発生する可能性があります。フック領域は、ヒトにおける大きな解剖学的変動を示し、骨伝導^{聴覚22、23}にとって重要である。ミュラー1とVibergとCanlon

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
科学および産業向けの	10mmランドカバースリップ	260367
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgG2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21131
Alexa Fluor 488 ファロイジン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A12379
Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウスIgG1	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21125
Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギIgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A11012
Carboard Micro Slide Trays	Fisher Scientific	12-587-10
Cell-Tak	BD Biosciences	354240
Corning Petri Dishes	Fisher Scientific	353004
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
Dumont #5 鉗子	FSTファインサイエンスツール	11251-20
EDTA二ナトリウム塩	シグマアルドリッチ	E5134
スバッファー付きフルオロゲル	電子顕微鏡科学	17985-104
ウェル細胞培養皿	グライナーバイオワン	627170
ギ抗ミオシンVIIa抗体	プロテウスバイオサイエンス25-6790
顕微鏡スライド	Fisher Scientific	12-544-7
マウス 抗 CtBP2 抗体	BD Biosciences	#612044
マウス 抗 Glu2R 抗体	ミリポア	MAB397
正常ヤギ血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31872
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	441244
リン酸緩衝生理食塩水	フィッシャーサイエンティフィック	BP665-1
メス	VWR100491-038
トリトンX-100	シグマアルドリッチ	X100-500ML
バンナススプリングシザー	ファインサイエンスツール	15001-08

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