小げっ歯類における社会的嗜好行動のダイナミクスを追跡するシステム

Summary

ここで説明する新しい自動実験システムは、3チャンバーテストの代替を提供し、また、いくつかの注意事項を解決します。このシステムは、社会的嗜好および社会的新規性嗜好試験中に小さなげっ歯類の行動ダイナミクスの厳密な分析を可能にする複数の行動パラメータを提供する。

Abstract

社会的行動の神経生物学的メカニズムを探索するには、公平で観察者に依存しない方法で動物モデルに適用できる行動テストが必要です。ミレニアムの初め以来、3室のテストは、小さなげっ歯類の社会性(社会的嗜好)と社会的新規性の好みを評価するための標準的なパラダイムとして広く使用されてきました。しかし、このテストは、空間ナビゲーションへの依存や行動ダイナミクスの過失など、複数の制限に苦しんでいます。ここで提示され、検証されたは、3つのチャンバーテストの代替を提供し、同時にその注意事項の一部を解決する新しい実験システムです。このシステムは、シンプルで手頃な価格の実験装置と、一般に公開されているオープンソース分析システムを必要とし、個々および人口レベルで複数の行動パラメータを自動的に測定および分析します。これは、任意の社会的差別テスト中に小さなげっ歯類の行動ダイナミクスの詳細な分析を可能にします。成人男性マウスやラットが行う社会的嗜好や社会的新規性嗜好試験における社会的行動のダイナミクスを分析するシステムの効率性を実証する。さらに、ウィスカートリミングなどの操作に続くげっ歯類の社会的行動の修正されたダイナミクスを明らかにするシステムの能力を検証します。したがって、システムは小さいげっ歯類モデルの社会的行動およびダイナミクスの厳密な調査を可能にし、株、条件および処置間のより正確な比較をサポートする。

Introduction

神経発達障害(NDD)の基礎となる生物学的メカニズムを明らかにすることは、神経^科学1の分野における主要な課題の一つである。この課題に取り組むには、げっ歯類の行動を標準的かつ公平に表現する行動パラダイムと実験システムが必要です。Moyと^同僚2によって10年以上前に発表された影響力のある研究は、3つのチャンバーテストを提示しました。それ以来、このテストはNDDのげっ歯類モデルにおける社会的行動を調査するために広く使用されている。このテストは、げっ歯類の2つの先天的傾向を評価する:1)物体に対する社会的刺激の近接にとどまる(社交性、社会的嗜好[SP]とも呼ばれる)、および2)身近な1つよりも新しい社会的刺激の近接性を好む(社会的新規性好み[SNP])3、4。いくつかの後続の研究は、コンピュータ化された^方法5、6を使用して3チャンバー試験の自動分析の方法を示唆した。

このテストはまだいくつかの注意事項に苦しんでいます。第一に、主に社会的刺激と直接相互作用する被験者の動機ではなく、社会的な場所の好みを調べるが、一部のグループは、手動^で7、または商用コンピュータ化された^{システム8、9、10}を使用して嗅覚調査(スニッフィング)時間を測定する。第二に、3チャンバーテストは、主に各チャンバー内の被験者が費やした合計時間を測定するために使用され、それは行動ダイナミクスを無視します。最後に、それは社会的行動の1つの側面にのみ依存し、これは各チャンバ内の被験者が費やした時間(または測定された場合はスニッフィング時間)である。

ここでは、3室装置に代わる新しい手頃な価格の実験システムを紹介します。また、上記の注意事項を解決しながら、同じ動作テストのパフォーマンスを可能にします。提示された行動システムは、2つの刺激に向かってげっ歯類の調査行動を自動的かつ直接測定する。さらに、観察者に依存しない方法で行動ダイナミクスを分析します。さらに、このシステムは、複数の行動パラメータを測定し、個々のレベルと母集団レベルの両方でこれらを分析します。したがって、各テスト中の社会的行動とそのダイナミクスの厳密な分析をサポートします。さらに、様々なテスト段階の間にアリーナの反対側のコーナーのチャンバーのランダムな再配置は、空間メモリまたは好みの任意の効果を中和する。このシステムは、性差別などの他の差別テストにも使用できます。カスタム装置は簡単に製造でき、分析システムはオープンソースコードとして一般にアクセス可能であり、あらゆる実験室での使用を可能にします。我々は、社会的嗜好および社会的新規性嗜好試験の間に明確な毛皮の色を有するげっ歯類株における社会的行動の複数のパラメータを測定するこのシステムの能力を実証する。また、ウィスカートリミングなどの操作に続くげっ歯類の社会的行動の修正されたダイナミクスを明らかにするシステムの能力を検証します。

TrackRodentソフトウェア:3つのアルゴリズムは、実験対象とその刺激との相互作用を追跡するためにMATLAB(2014a-2019a)で書かれました。すべてのアルゴリズムは GitHub に寄託されました。すべての4つのアルゴリズムの主な目的は、刺激領域との直接接触を検出するために被験者の体の輪郭を追跡することです。

ボディベースのアルゴリズム:このアルゴリズムには、白い背景上のワイヤードされていない暗いマウスの輪郭を追跡する3つのバージョン(BlackMouseBodyBased)、暗い背景に白いマウス(WhiteMouseBodyBased)、または暗い背景の白いネズミ(WhiteRatBodyBased)があります。).ソフトウェアのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) では、実験者がマウスまたはラットを使用して実験を選択し、正しいコードを選択する必要があります。アルゴリズムのバージョンごとに、分析の実行中に追跡プロセスを画面に表示するコードと、実行しないコード (高速実行され、「高速」と呼ばれます) の 2 つのオプション コードがあります。たとえば、BlackMouseBodyBased アルゴリズムに関連するコードの名前は、"BlackMouseBodyBased23_7_14" と "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" です。"fast" で終わるすべてのアルゴリズムはトラッキングをオンラインで表示せず、ユーザーはデータを結果ファイル (.mat ファイル) に直接保存する必要があります。すべての本文ベースのアルゴリズムでは、サブジェクトの本文を検出するために、単一のしきい値 (ソフトウェアの GUI の 「低しきい値」) を設定する必要があります。

頭方向ベースのアルゴリズム: 黒いマウスでのみ使用できる 2 番目のアルゴリズムは、頭部の方向性を決定することに加えて、ボディベースのアルゴリズムに基づいています。このアルゴリズムは、被験者の頭部と「刺激」領域との相互作用を検出し、被験者のランダムな接触から生じる誤検知を回避します。このアルゴリズムでは、マウス本体の輪郭の 2 つの検出しきい値が定義されます: 黒いマウスの明るい尾を含む高しきい値と、尾のない体を含む低しきい値。その後、アルゴリズムは、下限しきい値を使用して検出された境界に楕円体を適合させ、マウスの頭と尾の位置を定義します(2つの区別はありません)。尾と頭の間の最終的な判別は、より高いしきい値によって定義された境界に基づいています。

有線動物アルゴリズム:第3のアルゴリズムは、動物に接続されたケーブル(すなわち、電線または光ファイバ)から生じるアーティファクトを最小限に抑えることを目的とし、ケーブルに接続されている間の動物の行動の分析を可能にする。このアルゴリズムには、黒いマウスと白いラットのコードのみが含まれています。ラットのコードでは、実験者は低しきい値と高しきい値の両方を定義する必要がありますが、マウス コードでは低いしきい値のみを定義する必要があります。

Protocol

記載されているすべての方法は、ハイファ大学の制度動物管理利用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 実験的なセットアップ

1. アリーナ
   1. マウス用の実験場(図1A,D)を、白または黒(動物の色に応じて)プレキシガラスボックス(37 cm x 22 cm x 35 cm)を音響室の中央に置いて構築します(60 cm x 65 cm x 80 cm、内側に厚さ2cmの厚い木材で構成されています)。ライトの場合は、音響室(ドアの他に)の泡のストリップ(幅2cm、チャンバーの天井下10cm)を取り外し、赤または白の電球でLEDストリップを取り付けます。反射を防ぐために、アリーナの周りの光ができるだけ均一であることを確認してください。
   2. マウスに対して上記のものと同様にラットのアリーナを構築し、スプレイグ・ドーリー(SD)ラットのサイズに適した異なる寸法を有する(図1G)。音響室の中央に黒いプレキシガラスボックス(50 cm x 50 cm x 40 cm)を置きます(90 cm x 60 cm x 85 cm、内側に厚さ2cmの厚い泡で覆われた厚さ2cmの木で作られています)。
2. 室
   1. マウスの場合は、厚さ 6 mm のプレキシガラスから 2 つの黒または白(毛皮の色に応じて)三角形のチャンバー(12 cmの二重、高さ35cm、床を閉じた)を作成します。アリーナの2つのランダムに選択された反対側のコーナーでそれらを見つけます (図 1B,E)。エポキシ接着剤を使用して各チャンバーの下部に金属メッシュ(18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm の穴)を貼り付け、メッシュを介して刺激と直接相互作用できるようにします(図1C,F)。被験者に手がかりを与えることなく、ビデオで他の人からの差別を可能にする方法で各チャンバーをマークします(例については、図1B,Eを参照)。
      注:各チャンバーは、最終的に社会的刺激(マウス)またはオブジェクト(プラスチックおもちゃ、5 cm x 5 cm x 5 cm、明確な形状と色を含みます。図1C,Iインセット)。エポキシ接着剤の臭いを使用前に少なくとも1週間蒸発させます。
   2. ラットの場合は、2つの黒い三角形のチャンバー(20.5 cmのアイソセレス、40 cmの高さ、床を閉じた状態で厚さ6mmのプレキシガラスで作られています)を作成し、アリーナの2つのランダムに選択された反対側のコーナーに配置します(図1H)。それぞれに金属製メッシュ(25 cm x 7 cm;2.5 cm x 1 cmの穴)を覆います(図1I)。
3. 広角レンズを装備した高品質の単色カメラを音響室の上部に設置し、コンピュータに接続して、商用ソフトウェアを使用して被写体の動作を明確に表示および記録できるようにします(提案については、材料表を参照)。

2. 行動パラダイム

注:手順 2.1 ~ 2.7 では、マウスの動作パラダイムについて説明します。ラットに関する具体的な指示については、セクション2.8を参照してください。

1. 行動実験を開始する前に、すべての動物(被験者:2-4ヶ月の雄マウス;刺激:21-30日齢の若いマウス)のケージが少なくとも1時間実験室に残っていることを確認してください。
2. 順応期間に続いて、2つの反対側のコーナーでランダムにアリーナに2つの空の部屋を挿入します。15分間の習慣のためにアリーナの真ん中に被験者を配置します。その間、2つの社会的刺激を置き、それぞれが習慣のためにアリーナの外に位置する別の部屋に置きます。別のチャンバーにオブジェクト(プラスチック製のおもちゃ、5 cm x 5 cm x 5 cm、明確な形状と色)を配置します。
3. ソーシャルプリファレンス(SP)テストを実行するには、ビデオ録画を開始し、テストが終了するまで録画を続けます。
4. 2つの空の部屋を取り外し、すぐにオブジェクトと社会的刺激の1つを挿入し、それぞれ別個のチャンバーに入れます。習慣の間に空だったアリーナの反対側のコーナーでランダムにこれらの部屋を見つけます。被験者がSPテストの5分間の刺激と相互作用することを許可する。テストの終了時に、記録を停止します。
5. SPテストの後、刺激を含むチャンバーをアリーナから取り出し、被験者を空のアリーナに15分間放置します。
6. 社会的新規性の好み(SNP)テストを実行するには、ビデオ録画を開始し、アリーナに2つのチャンバーを挿入します:1つはSPテストに使用されるのと同じ社会的刺激を含み(使い慣れた刺激)、もう1つは新しい社会的刺激を含みます。これらのチャンバーをアリーナの2つの反対側のコーナーにランダムに配置し、これらの場所がSPテストに使用されていないことを確認します。被験者がSNPテストの5分間の刺激と相互作用することを許可する。
7. SNPテストの終わりに、ビデオ録画を停止し、アリーナから被写体とチャンバーを取り除き、被写体をホームケージに戻します。次の実験のために(別の被験者と)チャンバーに刺激を残すか、彼らの家のケージにそれらを返します。流水でアリーナとチャンバーをきれいにし、10%のエタノールを続け、乾燥させます。
8. ラットの行動パラダイム
   1. ラットの場合は、ステップ2.1-2.7で説明した行動パラダイムを繰り返し、2つの修正を加えて:1)ラットの被験者を処理し、実験の前に2日間(毎日10分)チャンバーに社会的刺激を習慣化します。そして2)15分間SP試験を延長し、ラットに社会的刺激への暴露のより長い期間を与える。その後、SPテストの分析を最初の5分に制限します。
      注:1つのセッションを実行するには、少なくとも1つのアリーナと5つのチャンバーが必要です。

3. 行動分析のためのトラックローデント GUI の使用

注:トラックローデント GUI については、図 2Aの上部パネルを参照してください。

1. MATLAB(2014a-2019aでテスト)を開き、TrackRodentフォルダを選択します。
2. 各フォルダを右クリックし、[パスに追加|選択したフォルダとサブフォルダ。
3. コマンド ウィンドウに TrackRodent と入力し、Enter キーを押します。
4. セッション ファイルの読み込み(AVI) を選択して、1 つまたは複数のビデオ ファイル (AVI または MP4 形式) をアップロードします。
5. ビデオクリップのフレームごとに検査を可能にするムービーインスペクタは、リスト内の最初のファイルに対して直ちに開かれます(図2A)。ビデオクリップを調べ、分析するセグメントの最初と最後のフレームを定義するために使用します。後で必要になるこれらのフレームの番号を記録します。完了したら、ウィンドウを閉じます。
6. 追加のビデオファイルを検査するには、ムービーの検査を押して特定のビデオファイルを選択して、いつでもビデオインスペクタを開きます。
7. テストした種を選択します(マウスまたはラット、マウスがデフォルト)。
8. 被写体とアリーナ(黒または白)の色に応じて、追跡を中断する可能性のあるすべての領域を除外します。
   1. 特定の領域を除外するには、[除外領域]を押し、カーソルが十字形に変わったら、その領域のすべてのコーナーに除外のマークを付けます。完了したら、マウスを右クリックし、マークされた領域の中心をダブルクリックします。除外された領域は、画面上で赤の網掛けになります。必要な数の領域を除外するには、この手順を繰り返します。
9. 除外からエリアを削除するには、 (交差カーソルを使用して) 除外から除外する領域をクリックします。
10. 各チャンバを「刺激」領域として定義するには、被験者による調査の自動検出のために、適切なボックスをチェックして「刺激」領域の形状をポリゴンまたは楕円形に選択し、Stimulus X("X"は1、2、または3を表します)を押します。「刺激」領域を除外された領域と同様にマークすると、色が黄色になります。特定の「刺激」領域の位置を変更するには、Stimulus X をもう一度押して、新しい領域の位置をマークします(これにより、自動的に位置が更新されます)。
    注:すべてのファイルに対して一貫した方法で異なる刺激番号を選択します(つまり、すべてのSPテストファイルに対する刺激1としてのオブジェクト)。
11. アリーナ内の特定の仮想コンパートメント内の被写体の存在を追跡するには、「コンパートメント」領域(ポリゴンまたは楕円形)の形状を選択し、コンパートメントX("X"は 1、2、3、4、または5)を押します。「コンパートメント」領域を除外領域または刺激領域と同様にマークすると、青色になります。特定の「コンパートメント」領域の位置を変更するには、コンパートメント Xをもう一度押して、新しいエリアの位置をマークします(これにより、場所が自動的に更新されます)。
12. リストから目的のアルゴリズム (BlackMouseBodyBased がビデオに使用されました) を選択します (図 2Bの使用可能なアルゴリズムを参照)。
13. 解析の開始フレームと終了フレームの数を GUI の対応する編集ボックスに書き込みます。
14. サブジェクト本体を検出するためのしきい値を選択します。
    注:ほとんどのアルゴリズムは「低」しきい値のみを使用し、ヘッド指向性ベースのアルゴリズムも「高」しきい値を使用します。「低」しきい値には、尾のないマウス/ラットボディを含むレベルを選択し(可能な限り)、「高」しきい値にもテールを含める必要があります。ヘッド指向性ベースのアルゴリズムを使用する場合、ソフトウェアは頭部の位置を尾部の位置とは反対であると判断します。
    注:ソフトウェアは、選択したしきい値を使用して検出された小さなオブジェクトを無視して後で行われます。
15. 特定のしきい値のサブジェクト境界の自動検出を評価するには、関連するしきい値フィールドに値を挿入し、キーボードの Enter キーを押します。
16. 複数のファイルを選択する場合は、上部にある [次へ] ボタンを使用して次のファイルに移動し、各ファイルに適切な定義を選択します。完了したら、GUI の上部にある[前へ]ボタンと[次へ]ボタンを使用して、各ファイル間を移動して、すべてのファイルのパラメータと領域の場所を確認します。
    注:すべての領域とパラメーターの定義は、特定のファイルに固有です。
17. 選択したすべてのファイルの動作分析を開始するには、最初のファイルに移動し、Start キーを押します。
18. 解析の最後に、ムービー ファイルの同じディレクトリにムービーごとに結果ファイル (.mat ファイル) が保存されます。
    注:アルゴリズムの低速(非高速)バージョンを使用する場合は、GUIの[分析されたムービーを保存]トグル ボタンがオフでない限り、調査として検出されたすべてのフレームの色を変更するボディマスの中心の白い十字でムービーのバージョンも保存されます。このバージョンのムービー (元のムービーと同じ名前で、サフィックスが 「分析されたムービー」と同じディレクトリに保存されている) をオフラインで使用して、システムによって実行される自動検出の品質を評価できます。

4. 結果表示のためのトラックローデント GUI の使用

注:結果の表示については、図 2Aの下部パネルを参照してください。

1. 各ムービー ファイルの結果を調べるには、[結果ファイルの読み込み] を押し、動作解析によって生成された .mat ファイルを選択します。
2. トグル ボタン間を移動して、次のいずれかの分析を画面上で調べます。セッションに沿ったコンパートメント職業(「コンパートメント」が定義されている場合、示されていません)。セッションに沿った刺激探査(図2C);コンパートメント内の合計時間 (「コンパートメント」が定義されている場合、表示されません)。および総刺激探査時間 (図 2D)。
   注:「刺激」領域は、ソフトウェアが主題の相互作用を評価する領域であり、「コンパートメント」領域は、ソフトウェアが被験者の存在を追跡する領域です。[解析の停止]ボタンを使用して解析を停止すると、最後に解析されたフレームまで生成された結果が自動的に保存されます。ほとんどのコンピュータでは、一度に最大 20 本のムービーをアップロードして分析できる必要があります (コンピュータのパフォーマンスによって異なります)。

5. 集団分析のためのトラックローデント人口サマリーGUIの使用 (図 2E)

1. MATLAB(2014a-2019aでテスト)を開き、TrackRodentフォルダを選択します。
2. コマンド ウィンドウに「トラックの一般概要」と入力し、Enterキーを押します。
3. [ 結果ファイルの選択 ] を押して、複数の TrackRodent 結果ファイル (.mat 形式)をアップロードします。
4. 分析のための最後のフレームの数字を記入してください,テスト名,刺激1名と刺激2名.
5. すべての適切なボックスをオンにして、オプションの解析のリストから目的の解析を選択します。
6. 適切なチェックボックスをオンにして[結果をスピードシートにエクスポート]を選択し、チェックした解析のすべての結果を 1 つのスプレッドシート ファイルとして抽出します。
7. [開始] をクリックし、分析が完了するまで待ちます。
   注:これで分析は終了です。ソフトウェアは、それらがTrackRodentソフトウェアを使用して行動的に分析されたことを考えると、必要な数のムービーファイルの結果を分析するために使用することができます。ソフトウェアによって実行される分析は、30 Hzのフレームレートでのビデオ録画を前提としています。異なるフレームレートを使用した場合は、時間に30を掛け、正しい値に変換するために記録に使用されるフレームレートで割ります。

Results

C57BL/6Jマウスにおける社会的嗜好試験のためのシステムの使用
図 1は、実験セットアップの 3 つのバージョンを示しています。最初のバージョン(図1A-C)は、C57BL/6Jマウスのような暗い毛皮の色を持つマウス用に設計されています。2番目の(図1D-F)は、BALB/cまたはICR(CD-1)マウスのような明るい毛皮色を有するマウスに対して計画されている。3つ目は大きく(図1G-I)、SDラットなどの明るい毛皮色のラット用に設計されています。最初に調べた被験者は、ナイーブ成人(生後8〜12週)、グループ収容(ケージあたり2〜5匹)雄C57BL/6Jマウスであった。社会的刺激は、若年(生後...

Discussion

ここで説明する実験システムは、3チャンバ^装置2、5の代替として設計されたが、その制限の一部を解決しながら、同じ試験の性能を可能にする。長方形アリーナの2つの反対側のコーナーに位置する三角形のチャンバーの使用は、被験者刺激相互作用領域を適切に定義された平面に制限し、調査行動の正確な自動分析を可能にします。1つの利点は、分析ソフトウェア(TrackRodent)を使用して、各検定の複数の行動パラメータを計算することです。また、パラダイムの様々な段階でアリーナのランダムな反対側のコーナーにチャンバーの再配置を可能にし、空間ナビゲーションスキルの任意の効果を中和します。

さらに、各ステージの間に空のままであるアリーナの2つのコーナーは、被験者に休息とグルーミングのための便利な場所を提供し、誤検知の結果を最小限に抑え、チャンバーから離れて引き出します。したがって、システムは、SPおよびSNPテスト中に各刺激を調査する被験者の動機の直接評価を可能にする。さらに、ビデオの動作分析...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP モノラル USB3 Vision	FLIR (以前のPointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	単色カメラ
FlyCap 2.0	FLIR (以前のPointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	ビデオ録画ソフトウェア
ホーム 5 分 エポキシ接着剤	Devocon	20845	プレキシガラス刺激チャンバーに金属メッシュを接着するため
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	プログラミング環境
プレキシガラスボード(厚さ6 mm黒または白)	Melina(1990)LTD、イスラエル	NaN	アリーナおよび刺激室建設用
12V電源に接続された赤いLEDストリップ(1メートルあたり60個のLED)	2012topdeal eBay	サプライヤーNaN	音響室の照明用